Прыгающая библиотека

Этот рисунок иллюстрирует основной принцип прыгающих библиотек. Стрелки представляют две физически удаленные последовательности, которые сближаются с помощью этого метода.

Библиотеки прыгающих фрагментов или библиотеки соединительных фрагментов представляют собой коллекции фрагментов геномной ДНК, генерируемые в результате скачков хромосом . Эти библиотеки позволяют анализировать большие области генома и преодолевать ограничения расстояния в обычных методах клонирования.Клон прыгающей библиотеки состоит из двух участков ДНК, которые обычно расположены на расстоянии многих тысяч оснований друг от друга. Участок ДНК, расположенный между этими двумя «концами», удаляется в результате серии биохимических манипуляций, выполняемых в начале метода клонирования.

Изобретение и ранние улучшения

Источник

Скачок хромосом (или перескок хромосом) был впервые описан в 1984 году Коллинзом и Вайсманом. В то время методы клонирования позволяли создавать клоны ограниченного размера (до 240 КБ), а цитогенетические методы позволяли картировать такие клоны с небольшой областью конкретной хромосомы с разрешением около 5-10 МБ. Таким образом, между доступными технологиями оставался серьезный разрыв в разрешении, и не было методов для картирования более крупных областей генома.

Основной принцип и оригинальный метод

Этот рисунок представляет собой схематическое изображение метода, используемого для создания библиотек прыжков, когда он был первоначально разработан в 80-х годах.

Этот метод является расширением «хромосомного ходьбы», которое позволяет делать более крупные «шаги» по хромосоме.Если желательны шаги длиной N kb, необходима ДНК с очень высокой молекулярной массой. После выделения он частично переваривается часто расщепляющимся ферментом рестрикции (таким как MboI или BamHI ). Далее полученные фрагменты выбираются по размеру, длина которого должна составлять около N kb. Затем ДНК необходимо лигировать при низкой концентрации, чтобы способствовать лигированию в круги, а не образованию мультимеров. Маркер ДНК (такой как ген тРНК-супрессора янтарного цвета supF) может быть включен в этот момент времени в ковалентно связанный круг, чтобы обеспечить выбор фрагментов соединения. Затем круги полностью расщепляются вторым ферментом рестрикции (таким как EcoRI ) с образованием большого количества фрагментов. Такие фрагменты лигируют в векторы (например, вектор λ), которые необходимо выбрать для использования введенного ранее ДНК-маркера. Таким образом, оставшиеся фрагменты представляют собой библиотеку соединительных фрагментов, или «прыгающую библиотеку». Следующим шагом является проверка этой библиотеки с помощью зонда, который представляет собой «отправную точку» желаемого «прыжка хромосомы», то есть определение местоположения опрашиваемого генома. Клоны, полученные на этом последнем этапе отбора, будут состоять из ДНК, гомологичной нашему зонду, отделенной нашим маркером ДНК от другой последовательности ДНК, которая изначально располагалась на расстоянии N kb (что называется «перепрыгиванием»). Создав несколько библиотек с разными значениями N, в конечном итоге можно нанести на карту весь геном, что позволит перемещаться из одного места в другое, контролируя при этом направление, при любом желаемом значении N.

Ранние проблемы и улучшения

Оригинальная техника скачка хромосом была разработана в лабораториях Коллинза и Вайсмана Йельского университета в Нью-Хейвене, США. и лаборатории Пустки и Лераха в Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге, Германия.

Метод Коллинза и Вейсмана описанное выше столкнулось с некоторыми ранними ограничениями. Основная задача заключалась в том, чтобы избежать некруглых фрагментов. Было предложено два решения: либо скрининг фрагментов соединения с данным зондом, либо добавление второго этапа выбора размера после лигирования для отделения одиночных кольцевых клонов (мономеров) от клонов, лигированных друг с другом (мультимеров). Авторы также предположили, что следует учитывать другие маркеры, такие как сайт λ cos или гены устойчивости к антибиотикам (вместо гена тРНК-супрессора янтаря), чтобы облегчить отбор клонов соединения.

Пустка и Лерах предположил, что на первом этапе создания библиотеки следует использовать полное расщепление с помощью редко расщепляющих ферментов рестрикции (таких как NotI) вместо частичного расщепления с часто сокращающимся ферментом рестрикции. Это позволит значительно сократить количество клонов с миллионов до тысяч. Однако это может создать проблемы с циркуляризацией фрагментов ДНК, поскольку эти фрагменты будут очень длинными, а также потеряют гибкость в выборе конечных точек, которую можно получить при частичном расщеплении. Одним из предложений по преодолению этих проблем было бы объединение двух методов, т.е. создание прыгающей библиотеки из фрагментов ДНК, частично расщепленных обычно расщепляющим ферментом рестрикции и полностью редким расщепляющим ферментом рестрикции, и циркуляризация их в плазмиды, расщепляемые обоими ферментами. Несколько из этих «комбинированных» библиотек были завершены в 1986 году.

В 1991 г. Забаровский и др. предложил новый подход к построению прыжковых библиотек. Этот подход включал использование двух отдельных векторов λ для построения библиотеки и реакцию частичного заполнения, которая устраняет необходимость в выбираемом маркере. Эта реакция заполнения работала путем разрушения специфических когезивных концов (образующихся в результате рестрикционного расщепления) фрагментов ДНК, которые не были лигированы и нециркуляризованы, тем самым предотвращая их клонирование в векторы более энергоэффективным и точным способом. Кроме того, для этого улучшенного метода потребовалось меньше ДНК, а также была создана библиотека, которую можно было перевести в плазмидную форму, что облегчило ее хранение и репликацию. Используя этот новый подход, они успешно создали человеческую прыгающую библиотеку NotI из линии лимфобластоидных клеток и человеческую прыгающую библиотеку NotI, специфичную для хромосомы 3, из гибридной линии клеток человека и мышиной хромосомы 3.

Текущий метод

Методы второго поколения, или «следующего поколения» (NGS), претерпели радикальные изменения: с 2007 года возможности секвенирования увеличились более чем в десять тысяч раз, а стоимость снизилась более чем в миллион раз (Национальный институт исследования генома человека). NGS произвел революцию в области генетики во многих отношениях.

Строительство библиотеки

Библиотеку часто готовят путем случайной фрагментации ДНК и лигирования общих адаптерных последовательностей. Однако сгенерированные короткие чтения затрудняют идентификацию структурных вариантов, таких как инделы, транслокации и дупликации. Большие области простых повторов могут еще больше усложнить выравнивание. В качестве альтернативы с NGS можно использовать библиотеку переходов для картирования структурных вариаций и построения сборок de novo.

Этот рисунок представляет собой схематическое изображение одного из последних используемых методов создания библиотек переходов.

Прыгающие библиотеки можно разделить на категории в зависимости от длины включенных фрагментов ДНК.

Библиотека коротких прыжков

В библиотеке короткого перехода фрагменты геномной ДНК длиной 3 т.п.н. лигируются с биотинилатными концами и циркуляризируются. Затем круговые сегменты разрезают на небольшие фрагменты, а биотинилированные фрагменты отбирают с помощью анализа аффинности для секвенирования парных концов.

Есть две проблемы, связанные с библиотеками короткого перехода. Во-первых, считывание может проходить через биотинилированное циркулярное соединение и уменьшать эффективную длину считывания. Во-вторых, чтения из фрагментов без перехода (т.е. фрагментов без соединения циркуляризации) секвенируются и уменьшают охват генома. Сообщалось, что доля неперепрыгнувших фрагментов варьируется от 4% до 13%, в зависимости от размера выборки. Первую проблему можно решить, разрезав круги на более крупные и выделив из них более крупные фрагменты. Вторую проблему можно решить, используя специальную библиотеку переходов со штрих-кодом.

Пользовательская библиотека прыжков со штрих-кодом

Эта библиотека перехода использует адаптеры, содержащие маркеры для выбора фрагментов в сочетании со штрих-кодами для мультиплексирования. Протокол был разработан Talkowski et al. и на основе подготовки библиотеки парных пар для секвенирования SOLiD. Размер выбранного фрагмента ДНК составляет 3,5 – 4,5 т.п.н. Были задействованы два адаптера: один содержал сайт узнавания EcoP15I и выступ AC; другой содержит выступающий выступ GT, биотинилированный тимин и олигоштрих-код. Циркуляризованную ДНК расщепляли и отбирали фрагменты с биотинилированными адаптерами (см. Рисунок 3). Сайт распознавания EcoP15I и штрих-код помогают отличить соединительные фрагменты от непереходных фрагментов. Эти целевые фрагменты должны содержать от 25 до 27 пар оснований геномной ДНК, сайт узнавания EcoP15I, выступающий конец и штрих-код.

Библиотека прыжков в длину

Этот процесс создания библиотеки аналогичен процессу создания библиотеки короткого перехода, за исключением того, что условие оптимизировано для более длинных фрагментов (5 КБ).

Библиотека фосмидных прыжков

Этот процесс создания библиотеки также аналогичен процессу создания библиотеки короткого перехода, за исключением того, что для амплификации больших (40 т.п.н.) фрагментов ДНК требуется трансфекция с использованием вектора E. coli. Кроме того, фосмиды можно модифицировать, чтобы облегчить преобразование в прыгающую библиотеку, совместимую с некоторыми секвенаторами следующего поколения.

Парное секвенирование

Сегменты, образующиеся в результате циркуляризации при построении прыгающей библиотеки, расщепляются, а фрагменты ДНК с маркерами обогащаются и подвергаются секвенированию парных концов.Эти фрагменты ДНК секвенируются с обоих концов и генерируют пары прочтений. Геномное расстояние между прочтениями в каждой паре приблизительно известно и используется в процессе сборки.Например, клон ДНК, созданный путем случайной фрагментации, имеет длину около 200 п.н., а чтение с каждого конца составляет около 180 п.н., перекрывая друг друга.Его следует отличать от секвенирования парных пар, которое по сути представляет собой комбинацию секвенирования следующего поколения с прыгающими библиотеками.

Компьютерный анализ

Для обработки данных библиотеки скачков были разработаны различные инструменты сборки. Одним из примеров является ДЕЛЛИ. DELLY был разработан для обнаружения структурных вариантов генома и «объединяет парные концы коротких вставок, пары сопряжений дальнего действия и выравнивания разделенного чтения» для обнаружения перестановок на уровне последовательности.

Пример совместной разработки новой экспериментальной схемы и разработки алгоритма демонстрирует ассемблер ALLPATHS-LG.

Подтверждение

При использовании для обнаружения генетических и геномных изменений прыгающие клоны требуют проверки секвенированием по Сэнгеру .

Приложения

Ранние приложения

Вначале для идентификации и клонирования генов болезней использовали ход хромосом от генетически связанных маркеров ДНК. Однако большое молекулярное расстояние между известными маркерами и интересующим геном усложняло процесс клонирования. В 1987 году была создана библиотека скачков хромосом человека для клонирования гена муковисцидоза. Муковисцидоз — аутосомно-рецессивное заболевание, поражающее 1 из 2000 жителей европеоидной расы. Это было первое заболевание, при котором была продемонстрирована полезность прыгающих библиотек. Онкоген Met был маркером, тесно связанным с геном муковисцидоза на хромосоме 7 человека, и библиотека была проверена на наличие прыгающего клона, начинающегося с этого маркера. Было установлено, что ген муковисцидоза локализуется на 240 т.п.н. ниже мет-гена. Скачки хромосом помогли сократить «шаги» картирования и обойти часто повторяющиеся области генома млекопитающих. Скачки хромосом также позволили создать зонды, необходимые для более быстрой диагностики этого и других заболеваний.

Новые приложения

Характеристика хромосомных перестроек

Сбалансированные хромосомные перестройки могут иметь значительный вклад в развитие заболеваний, как показали исследования лейкемии. Однако многие из них не обнаруживаются хромосомным микрочипом. Кариотипирование и FISH позволяют выявить сбалансированные транслокации и инверсии, но они трудоемки и обеспечивают низкое разрешение (небольшие геномные изменения пропускаются).

Для выявления таких геномных изменений можно применить комбинированный подход прыгающей библиотеки NGS. Например, Слэйд и др. применили этот метод для точного картирования сбалансированной транслокации de novo у ребенка с опухолью Вильмса . Для этого исследования было сгенерировано 50 миллионов чтений, но только 11,6% из них удалось однозначно сопоставить с эталонным геномом, что представляет примерно шестикратный охват.

Тальковский и др. сравнили различные подходы к обнаружению сбалансированных изменений хромосом и показали, что модифицированная прыгающая библиотека в сочетании с секвенированием ДНК нового поколения является точным методом картирования хромосомных точек разрыва. Две разновидности библиотек переходов (библиотеки коротких переходов и специальные библиотеки переходов со штрих-кодом) были протестированы и сравнены со стандартными библиотеками секвенирования.Для стандартного NGS генерируются фрагменты размером 200–500 пар оснований. Около 0,03–0,54% фрагментов представляют собой химерные пары, которые представляют собой пары конечных прочтений, картированных на двух разных хромосомах. Поэтому очень мало фрагментов покрывают область точки останова.При использовании библиотек коротких переходов с фрагментами 3,2–3,8кб процент химерных пар увеличивался до 1,3%. С использованием пользовательских библиотек прыгающих штрих-кодов процент химерных пар еще больше увеличился до 1,49%.

Пренатальная диагностика

Традиционное цитогенетическое тестирование не может обеспечить разрешение на уровне генов, необходимое для прогнозирования исхода беременности, а глубокое секвенирование всего генома нецелесообразно для рутинной пренатальной диагностики. Библиотека полногеномных прыжков могла бы дополнить традиционное пренатальное тестирование. Этот новый метод был успешно применен для выявления случая синдрома CHARGE .

И снова сборка

В метагеномике области геномов, общие для разных штаммов, обычно длиннее, чем считывания. Это усложняет процесс сборки и делает реконструкцию отдельных геномов вида сложной задачей. Химерные пары, которые картированы далеко друг от друга в геноме, могут облегчить процесс сборки de novo. Используя библиотеку более длинных прыжков, Ribeiro et al. продемонстрировали, что сборки бактериальных геномов имеют высокое качество при сокращении затрат и времени.

Ограничение

Стоимость секвенирования резко снизилась, а стоимость создания «прыгающих библиотек» — нет. Поэтому по мере разработки новых технологий секвенирования и биоинформатических инструментов прыгающие библиотеки могут стать ненужными.

См. также

• Хромосомные прыжки
• Биоинформатика
• секвенирование ДНК

Внешние ссылки

• ДЕЛЛИ: Обнаружение структурных вариантов с помощью интегрированного анализа парных концов и разделенного чтения.
• ALLPATHS-LG: сборка de novo полногеномных микрочтений дробовика