Стабильная липидная частица нуклеиновой кислоты
Стабильные липидные частицы нуклеиновых кислот ( SNALP примерно 120 нанометров ) представляют собой микроскопические частицы диаметром , что меньше длины волны видимого света. Их использовали для терапевтической доставки миРНК млекопитающим in vivo . В SNALPs миРНК окружена липидным бислоем , содержащим смесь катионных и фузогенных липидов, покрытых диффундирующим полиэтиленгликолем . [ 1 ]
Введение
[ редактировать ]РНК-интерференция (РНКи) — это процесс, который естественным образом происходит в цитоплазме, ингибируя экспрессию генов в определенных последовательностях. Регулирование экспрессии генов посредством РНКи возможно путем введения малых интерферирующих РНК (миРНК), которые эффективно подавляют экспрессию целевого гена. РНКи активирует РНК-индуцированный комплекс молчания (RISC), содержащий миРНК, миРНК, полученную из расщепленной дсРНК. siRNA направляет комплекс RISC к определенной последовательности мРНК, которая расщепляется RISC и, следовательно, подавляет эти гены. [ 2 ]
Однако без модификаций основной цепи РНК или включения инвертированных оснований на обоих концах нестабильность миРНК в плазме делает чрезвычайно трудным применение этого метода in vivo . Рецепторы распознавания образов (PRR), которые можно сгруппировать как эндоцитарные PRR или сигнальные PRR, экспрессируются во всех клетках врожденной иммунной системы . Сигнальные PRR, в частности, включают Toll-подобные рецепторы (TLR) и участвуют в первую очередь в идентификации молекулярных паттернов, связанных с патогенами (PAMP). Например, TLR могут распознавать определенные области, консервативные у различных патогенов, распознавание которых стимулирует иммунный ответ с потенциально разрушительными последствиями для организма. В частности, TLR 3 распознает как дсРНК, характерную для репликации вируса, так и миРНК, которая также является двухцепочечной. [ 3 ] Помимо этой нестабильности, еще одно ограничение терапии siRNA касается неспособности воздействовать на ткань с какой-либо специфичностью.
Однако SNALP могут обеспечить стабильность и специфичность, необходимые для эффективности этого режима РНКи-терапии. Состоящие из липидного бислоя , SNALP способны обеспечивать стабильность siRNA, защищая их от нуклеаз в плазме, которые могут их деградировать. Кроме того, доставка миРНК подвергается эндосомальному транспорту, что потенциально подвергает их воздействию TLR3 и TLR7 и может привести к активации интерферонов и провоспалительных цитокинов . Однако SNALPs позволяют siRNA проникать в эндосому без активации Toll-подобных рецепторов и, следовательно, стимулирования препятствующего иммунного ответа, что позволяет siRNA выйти из эндосомы. [ 1 ]
Разработка SNALP-доставки siRNA
[ редактировать ]Подавление экспрессии генов с помощью миРНК было важным исследовательским инструментом в исследованиях in vitro . Однако чувствительность siRNA к деградации нуклеазой делает их использование in vivo проблематичным. В 2005 году исследователи, работающие с вирусом гепатита B (HBV) у грызунов, определили, что определенные модификации миРНК предотвращают деградацию нуклеазами в плазме и приводят к усилению молчания генов по сравнению с немодифицированной миРНК. Модификации смысловых и антисмысловых цепей осуществлялись дифференцированно. Что касается как смысловой, так и антисмысловой цепи, 2'-ОН был замещен 2'-фтором во всех пиримидиновых положениях. Кроме того, смысловые цепи были модифицированы во всех пуриновых положениях дезоксирибозой, а антисмысловые цепи модифицированы 2'- О -метилом в тех же положениях. 5'- и 3'-концы смысловой цепи были кэпированы абазическими инвертированными повторами, а фосфоротиоатная связь. на 3'-конце антисмысловой цепи была включена [ 4 ]
Хотя это исследование продемонстрировало потенциальную РНКи-терапию с использованием модифицированной миРНК, снижение ДНК HBV у грызунов на 90% произошло в результате применения дозы 30 мг/кг при частом введении. Поскольку такой режим дозирования не является жизнеспособным, эта же группа изучила эффекты инкапсулирования миРНК в ПЭГилированный липидный бислой, или SNALP. В частности, липидный бислой облегчает поглощение клеткой и последующее высвобождение из эндосомы, а ПЭГилированный внешний слой обеспечивает стабильность во время приготовления препарата благодаря полученной гидрофильности внешней поверхности. Согласно этому исследованию 2005 года, исследователи получили 90% снижение ДНК HBV при дозе миРНК 3 мг/кг/день в течение трех дней, что значительно ниже, чем в предыдущем исследовании. Кроме того, в отличие от немодифицированной или модифицированной и неинкапсулированной миРНК, введение миРНК, доставляемой с помощью SNALP, не приводило к обнаружению уровней интерферонов , таких как IFN-α, или воспалительных цитокинов, связанных с иммуностимуляцией. Несмотря на это, исследователи признали, что необходима дополнительная работа для достижения приемлемой дозы и режима дозирования. [ 5 ]
В 2006 году исследователи, работающие над подавлением аполипопротеина B (ApoB) у приматов, не являющихся людьми, достигли 90% подавления с помощью однократной дозы 2,5 мг/кг доставленной SNALP APOB-специфической миРНК. ApoB представляет собой белок, участвующий в сборке и секреции липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), и он экспрессируется преимущественно в печени и тощей кишке . И ЛПОНП, и ЛПНП важны для транспорта холестерина и его метаболизма. Такая степень подавления наблюдалась не только очень быстро, примерно через 24 часа после введения, но и эффекты подавления сохранялись в течение более 22 дней после всего лишь одной дозы. Исследователи также протестировали однократную дозу 1 мг/кг, получив подавление целевого гена на 68%, что указывает на дозозависимое подавление. Это дозозависимое подавление было очевидным не только в степени подавления, но и в продолжительности молчания, экспрессия целевого гена восстанавливалась через 72 часа после введения. [ 6 ]
Хотя SNALP диаметром 100 нм эффективно используются для нацеливания на определенные гены для подавления активности, существует множество системных барьеров, которые конкретно связаны с размером. Например, диффузии в солидные опухоли препятствуют большие SNALP, и аналогичным образом воспаленные клетки, обладающие повышенной проницаемостью и удержанием, затрудняют проникновение больших SNALP. Кроме того, ретикулоэндотелия элиминация , селективность по размеру гематоэнцефалического барьера и ограничения капиллярных окон требуют меньшего размера SNALP для эффективной доставки мишене-специфической siRNA. В 2012 году ученые из Германии разработали то, что они назвали «моно-NALP», используя довольно простой метод замены растворителя, включающий постепенное разбавление 50% раствора изопропанола. В результате получается очень стабильная система доставки, аналогичная традиционным SNALP, но имеющая диаметр всего 30 нм. Однако разработанные здесь моно-NALP неактивны, но могут стать активными носителями за счет реализации специфических механизмов нацеливания и высвобождения, используемых в аналогичных системах доставки. [ 7 ]
Приложения
[ редактировать ]Заирский вирус Эбола (ZEBOV)
[ редактировать ]Мы смогли обеспечить полную защиту либо с помощью пула миРНК, инкапсулированных в SNALP, либо с помощью отдельных миРНК SNALP, в зависимости от их относительной эффективности... [наиболее мощная миРНК] ... обеспечила абсолютную защиту, то есть 100-процентную выживаемость, а также способствовал развитию полной авиремии у инфицированных морских свинок. Таким образом, не было обнаружено обнаруживаемого вируса Эбола, хотя животным была привита смертельная инфекционная доза вируса, в 30 000 раз превышающая смертельную.
В мае 2010 года применение SNALP к вирусу Эбола Заир попало в заголовки газет, поскольку препарат способен излечивать макак-резус при введении вскоре после их воздействия смертельной дозы вируса, которая может быть до 90% смертельной для человека в спорадические вспышки в Африке. Лечение, использованное для макак-резус, состояло из трех siRNA (шахматных дуплексов РНК), нацеленных на три вирусных гена. из смеси холестерина , дипальмитоилфосфатидилхолина SNALP (размером около 81 нм здесь) были получены путем спонтанной везикуляции , 3-N-[(ω-метокси поли(этиленгликоль)2000)карбамоил]-1,2-димирестилоксипропиламин и катионный 1,2-дилинолеилокси-3-N,N-диметиламинопропан. [ 9 ]
помимо применения на макаках-резусах Доказано, что SNALP защищают cavia porcellua от виремии и смерти при введении вскоре после постконтактного воздействия ZEBOV. Система доставки миРНК, специфичная для гена полимеразы (L), была наложена на четыре гена, связанные с вирусной геномной РНК в рибонуклеопротеиновом комплексе, обнаруженном в частицах EBOV (три из которых соответствуют приведенному выше приложению): NP, VP30, VP35 и белок L. . SNALP имели размер от 71 до 84 нм и состояли из синтетического холестерина, фосфолипида DSPC, ПЭГ-липида PEGC-DMA и катионного липида DLinDMA в молярном соотношении 48:20:2:30. [ 10 ] Результаты подтверждают полную защиту от виремии и смерти морских свинок при введении системы доставки SNALP-siRNA после диагностики вируса Эбола, тем самым доказывая, что эта технология является эффективным лечением. Будущие исследования будут сосредоточены главным образом на оценке влияния «коктейлей» siRNA на гены EBOV для усиления противовирусного эффекта. [ 10 ]
Гепатоцеллюлярная карцинома
[ редактировать ]В 2010 году исследователи разработали применимую таргетную терапию гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) у людей. Идентификация CSN5, пятой субъединицы сигналосомного комплекса COP9, обнаруженной при раннем ГЦК, использовалась в качестве терапевтической мишени для индукции миРНК. Системная доставка модифицированной миРНК CSN5, инкапсулированной в SNALP, значительно ингибировала рост опухоли печени в модели ортотопического ксенотрансплантата Huh7-luc+ рака печени человека. Также было доказано, что опосредованный SiRNA нокдаун CSN5 ингибирует прогрессирование клеточного цикла и увеличивает скорость апоптоза в клетках ГЦК in vitro. Эти результаты не только демонстрируют роль CSN5 в прогрессировании рака печени, но также указывают на то, что CSN5 играет важную роль в патогенезе ГЦК. В заключение было доказано, что SNALP значительно снижают рост опухоли гепатоцеллюлярной карциномы в клетках Huh7-luc* человека посредством терапевтического подавления. [ 11 ]
Опухоль
[ редактировать ]В 2009 году исследователи разработали siRNA, способные воздействовать как на поло-подобную киназу 1 ( PLK1 ), так и на белок веретена кинезина (KSP). Оба белка важны для клеточного цикла опухолевых клеток: PLK1 участвует в фосфорилировании множества белков, а KSP является неотъемлемой частью хромосом сегрегации во время митоза . В частности, биполярные митотические веретена не могут формироваться при ингибировании KSP, что приводит к остановке клеточного цикла и, в конечном итоге, к апоптозу . Аналогично, ингибирование PLK1 облегчает остановку митоза и апоптоз клеток. Согласно исследованию, доза PLK1-специфической миРНК в дозе 2 мг/кг, введенная в течение 3 недель мышам с имплантированными опухолями, привела к увеличению времени выживания и очевидному уменьшению опухолей. Фактически, среднее время выживания обработанных мышей составило 51 день по сравнению с 32 днями для контрольной группы. Кроме того, только у 2 из 6 обработанных мышей были заметные опухоли вокруг места имплантации. Несмотря на это, GAPDH , опухолевый сигнал, присутствовал на низких уровнях, что указывает на значительное подавление роста опухоли, но не на ее полную элиминацию. Тем не менее, результаты показали минимальную токсичность и отсутствие существенной дисфункции костного мозга. Животные, получавшие KSP-специфическую миРНК, также продемонстрировали увеличение времени выживания до 28 дней по сравнению с 20 днями в контрольной группе. [ 12 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Джей Джей Росси (2006). «РНКи-терапия: SNALPing siRNA in vivo» . Генная терапия . 13 (7): 583–584. дои : 10.1038/sj.gt.3302661 . ПМИД 17526070 .
- ^ Чжан, Шубяо; Дефу Чжи; Лиф Хуан (2012). «Векторы на основе липидов для доставки миРНК» . Журнал по борьбе с наркотиками . 20 (9): 724–735. дои : 10.3109/1061186X.2012.719232 . ПМК 5006685 . ПМИД 22994300 .
- ^ Уайтхед, Кэтрин ; Джеймс Э. Дальман; Роберт С. Лангер; Дэниел Г. Андерсон (2011). «Замалчивание или стимуляция? Доставка миРНК и иммунная система». Ежегодный обзор химической и биомолекулярной инженерии . 2 : 77–96. doi : 10.1146/annurev-chembioeng-061010-114133 . ПМИД 22432611 .
- ^ Моррисси, Дэвид; Бланшар, К.; Шоу, Л.; Дженсен, К.; Локридж, Дж.А.; Дикинсон, Б.; МакСвигген, Дж.А.; Варгиз, К.; Боуман, К.; Шаффер, CS; Полиский, бакалавр; Зиннен, С. (2005). «Активность стабилизированной короткой интерферирующей РНК в мышиной модели репликации вируса гепатита В» . Гепатология . 41 (6): 1349–1356. дои : 10.1002/hep.20702 . ПМИД 15880588 .
- ^ Моррисси Д.В., Локридж Дж.А., Шоу Л., Бланшар К., Дженсен К., Брин В., Хартсо К., Мачемер Л., Радка С., Джадхав В., Вайш Н., Зиннен С., Варгиз К., Боуман К., Шаффер К.С., Джеффс Л.Б., судья А. , Маклахлан I, Полиски Б (2005). «Мощная и стойкая in vivo активность химически модифицированных миРНК против ВГВ». Природная биотехнология . 23 (8): 1002–1007. дои : 10.1038/nbt1122 . ПМИД 16041363 . S2CID 23082937 .
- ^ Циммерманн, Трейси С.; Ли, Эми CH; Акинч, Акин; Брамлаге, Биргит; Бамкрот, Дэвид; Федорук, Мэтью Н.; и др. (2006). «РНКи-опосредованное подавление генов у приматов, кроме человека». Природа . 441 (7089): 111–114. Бибкод : 2006Natur.441..111Z . дои : 10.1038/nature04688 . ISSN 0028-0836 . ПМИД 16565705 . S2CID 4421438 .
- ^ Рудорф, София; Иоахим О. Радлер (2012). «Самосборка стабильных мономолекулярных липидных частиц нуклеиновой кислоты размером 30 нм». Журнал Американского химического общества . 134 (28): 11652–11658. дои : 10.1021/ja302930b . ПМИД 22694262 .
- ^ «Маклахлан из Protiva и Гейсберт из USAMRIID о SNALPS, siRNA и Эболе» . Новости РНКи. 18 мая 2006 г.
- ^ Томас В. Гейсберт; и др. (2010). «Защита приматов, кроме человека, от смертельного заражения вирусом Эбола с помощью РНК-интерференции: исследование, подтверждающее концепцию» . Ланцет . 375 (9729): 1896–905. дои : 10.1016/S0140-6736(10)60357-1 . ПМЦ 7138079 . ПМИД 20511019 . (бесплатно при регистрации)
- ^ Jump up to: а б Гейсберт, Томас В.; Хенсли Л.Е.; Каган Э; Ю ЭЗ; Гейсберт Дж.Б.; Даддарио-ДиКаприо К; Фриц Э.А.; Ярлинг П.Б.; МакКлинток К; Фелпс-младший; Ли AC; судья А; Джеффс Л.Б.; Маклахлан I (2006). «Защита морских свинок после воздействия от смертельного вируса Эбола обеспечивается вмешательством РНК» . Журнал инфекционных болезней . 193 (12): 1650–1657. дои : 10.1086/504267 . ПМК 7110204 . ПМИД 16703508 .
- ^ Ли, Ю.Х.; Судья, AD; Со, Д; Китаде, М; Гомес-Кирос, Ю.Л.; Исикава, Т; и др. (2011). «Молекулярное нацеливание на CSN5 при гепатоцеллюлярной карциноме человека: механизм терапевтического ответа» . Онкоген . 30 (40): 4175–4184. дои : 10.1038/onc.2011.126 . ISSN 0950-9232 . ПМК 3140552 . ПМИД 21499307 .
- ^ Судья Адам; Марджори Роббинс; Иран Таваколи; Ясна Леви; Лина Ху; Анна Фронда; Эллен Амбегия; Кевин МакКлинток; Ян Маклачиан (2009). «Подтверждение RNAi-опосредованного механизма действия средств лечения рака на основе SiRNA у мышей» . Журнал клинических исследований . 119 (3): 661–673. дои : 10.1172/jci37515 . ПМЦ 2648695 . ПМИД 19229107 .