Секвенирование полонии
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( сентябрь 2017 г. ) |
Секвенирование полонии — это недорогой, но высокоточный метод мультиплексного секвенирования , который можно использовать для параллельного «считывания» миллионов иммобилизованных последовательностей ДНК. Эта техника была впервые разработана группой доктора Джорджа Чёрча в Гарвардской медицинской школе . В отличие от других методов секвенирования, технология секвенирования Polony представляет собой открытую платформу со свободно загружаемым программным обеспечением и протоколами с открытым исходным кодом. Кроме того, аппаратное обеспечение этого метода можно легко настроить с помощью общедоступной эпифлуоресцентной микроскопии и проточной ячейки/системы с компьютерным управлением. Секвенирование полонии обычно выполняется на библиотеке парных концевых меток , в которой каждая молекула матрицы ДНК имеет длину 135 п.о. с двумя парными геномными метками длиной 17–18 п.о., разделенными и фланкированными общими последовательностями. Текущая длина считывания этого метода составляет 26 оснований на ампликон и 13 оснований на метку, оставляя зазор в 4–5 оснований в каждой метке.
Рабочий процесс
[ редактировать ]
Протокол секвенирования Polony можно разбить на три основные части: построение библиотеки парных концевых меток, амплификацию матрицы и секвенирование ДНК.
Создание библиотеки парных конечных тегов
[ редактировать ]Этот протокол начинается со случайного разделения тестируемой геномной ДНК на плотное распределение размеров. Затем разрезанные молекулы ДНК подвергаются ремонту концов и обработке с A-хвостом. Обработка концов преобразует любые поврежденные или несовместимые выступающие концы ДНК в 5'-фосфорилированную ДНК с тупыми концами, обеспечивая немедленное лигирование тупых концов, в то время как обработка A-хвостов добавляет букву A к 3'-концу разрезанной ДНК. Молекулы ДНК длиной 1 т.п.н. отбираются путем загрузки в гель с 6% TBE PAGE. На следующем этапе молекулы ДНК циркуляризируются с помощью синтетических олигонуклеотидов длиной 30 п.н. с Т-хвостом (T30), которые содержат два обращенных наружу сайта узнавания MmeI, и полученная циркулярная ДНК подвергается репликации по катящемуся кругу . Затем амплифицированные кольцевые молекулы ДНК расщепляются MmeI (эндонуклеазой рестрикции типа IIs), которая разрезается на расстоянии от сайта узнавания, высвобождая фрагмент T30, фланкированный метками длиной 17–18 п.н. (длиной ≈70 п.н.). Молекулы с парными метками необходимо восстановить на концах перед лигированием олигонуклеотидов-праймеров ePCR (эмульсионной ПЦР) (FDV2 и RDV2) к их обоим концам. Полученные в результате молекулы библиотеки длиной 135 п.н. выбираются по размеру и Ник перевел . Наконец, амплифицируйте молекулы библиотеки с парными концевыми метками длиной 135 пар оснований с помощью ПЦР , чтобы увеличить количество библиотечного материала и устранить посторонние продукты лигирования за один шаг. Полученная матрица ДНК состоит из последовательности FDV длиной 44 п.н., проксимальной метки длиной 17–18 п.н., последовательности T30, дистальной метки длиной 17–18 п.н. и последовательности RDV размером 25 п.н.
Усиление шаблона
[ редактировать ]Эмульсионная ПЦР
[ редактировать ]Моноразмерные шарики, покрытые парамагнитным стрептавидином, предварительно загружены двойным прямым праймером биотина. Стрептавидин имеет очень сильное сродство к биотину , поэтому прямой праймер прочно связывается с поверхностью гранул. Затем готовят водную фазу с предварительно загруженными гранулами, смесью ПЦР, прямым и обратным праймерами и библиотекой парных концевых меток. Его смешивают и взбалтывают с масляной фазой для создания эмульсии. В идеале каждая капля воды в масляной эмульсии имеет одну крупинку и одну молекулу матричной ДНК, что позволяет проводить миллионы невзаимодействующих амплификаций в объеме миллилитра при выполнении ПЦР.
Разрушение эмульсии
[ редактировать ]После амплификации эмульсию с предыдущего этапа разрушают с помощью изопропанола и детергентного буфера (10 мМ Трис, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0, 100 мМ NaCl, 1% (по объему), Triton X-100, 1% (по объему). ) SDS), после чего следует серия встряхивания, центрифугирования и магнитной сепарации. Полученное решение представляет собой суспензию пустых, клональных и неклональных шариков, которые возникают из капель эмульсии, которые изначально содержат ноль, одну или несколько молекул матрицы ДНК соответственно. Усиленный шарик может быть обогащен на следующем этапе.
Обогащение бисером
[ редактировать ]Обогащение амплифицированных шариков достигается за счет гибридизации с более крупными немагнитными полистироловыми шариками низкой плотности, которые предварительно загружены биотинилированными захватывающими олигонуклеотидами (последовательность ДНК, которая комплементарна последовательности ампликона ePCR). Затем смесь центрифугируют для отделения комплекса амплифицированных и захватывающих шариков от неамплифицированных шариков. Амплифицированный комплекс захватывающих шариков имеет более низкую плотность и, следовательно, останется в надосадочной жидкости, в то время как неамплифицированные шарики образуют осадок. Супернатант собирают и обрабатывают NaOH, который разрушает комплекс. Парамагнитные усиленные шарики отделяются от немагнитных захватывающих шариков магнитной сепарацией. Этот протокол обогащения способен в пять раз обогащать амплифицированные шарики.
Укупорка бисера
[ редактировать ]Целью кэпирования шариков является присоединение «кэпирующего» олигонуклеотида к 3'-концу как неудлиненных прямых праймеров ePCR, так и к сегменту RDV матричной ДНК. Используемый колпачок представляет собой аминогруппу, которая предотвращает лигирование флуоресцентных зондов с этими концами и в то же время способствует последующему связыванию матричной ДНК с аминосиланизированным покровным стеклом проточной клетки.
Расположение покровных стекол
[ редактировать ]Сначала покровные стекла промывают и обрабатывают аминосиланом, что обеспечивает последующее ковалентное связывание с ними матричной ДНК и устраняет любое флуоресцентное загрязнение. Усиленные, обогащенные шарики смешивают с акриламидом и выливают в неглубокую форму, образованную предметным стеклом с тефлоновой маской. Немедленно поместите покровное стекло, обработанное аминосиланом, поверх акриламидного геля и дайте полимеризоваться в течение 45 минут. Затем переверните стопку слайдов/покровных стекол и извлеките предметное стекло из геля. Покровные стекла, обработанные силаном, будут ковалентно связываться с гелем, а тефлон на поверхности предметного стекла позволит лучше удалить предметное стекло из акриламидного геля. Затем покровные стекла прикрепляются к корпусу проточной кюветы, и все неприкрепленные шарики удаляются.
секвенирование ДНК
[ редактировать ]Биохимия секвенирования Polony в основном опирается на дискриминационную способность лигаз и полимераз. Сначала через клетки пропускают серию якорных праймеров, которые гибридизуются с синтетическими олигонуклеотидными последовательностями на ближайшем 3'- или 5'-конце проксимальных или дистальных меток геномной ДНК длиной 17-18 п.н. Затем проводят ферментативную реакцию лигирования якорного праймера с популяцией вырожденных нонамеров , меченных флуоресцентными красителями.
Дифференциально помеченные нонамеры:
5' Cy5‐NNNNNNNNT
5' Cy3‐NNNNNNNNA
5' TexasRed‐NNNNNNNNC
5' 6FAM‐NNNNNNNNG
Нонамеры, меченные флуорофором, отжигаются с меточными последовательностями с разным успехом в соответствии со стратегией, аналогичной стратегии вырожденных праймеров , но вместо подчинения полимеразам нонамеры избирательно лигируются с прилегающей ДНК - якорным праймером. Фиксация молекулы флуорофора обеспечивает флуоресцентный сигнал, который указывает, есть ли A, C, G или T в позиции запроса на метке геномной ДНК. После четырехцветной визуализации комплексы якорный праймер/нонамер удаляются, и начинается новый цикл с замены якорного праймера. Представлена новая смесь нонамеров с флуоресцентной меткой, для которой позиция запроса смещается на одно основание дальше в метку геномной ДНК.
5' Cy5‐NNNNNNNTN
5' Cy3‐NNNNNNNAN
5' TexasRed‐NNNNNNNCN
5' 6FAM‐NNNNNNNGN
Таким образом можно запросить семь оснований от 5'-3'-направления и шесть оснований от 3'-конца. Конечным результатом является длина считывания 26 оснований за серию (13 оснований от каждой парной метки) с промежутком от 4 до 5 оснований в середине каждой метки.
Анализ и программное обеспечение
[ редактировать ]Секвенирование полонии генерирует миллионы 26 чтений за прогон, и эту информацию необходимо нормализовать и преобразовать в последовательность. Это можно сделать с помощью программного обеспечения, разработанного Church Lab. Все программное обеспечение бесплатное и может быть загружено с сайта. [1]
Инструменты
[ редактировать ]Инструмент для секвенирования, используемый в этом методе, может состоять из общедоступного флуоресцентного микроскопа и проточной кюветы с компьютерным управлением. В 2005 году необходимые инструменты стоили около 130 000 долларов США. [ нужна ссылка ] Специализированная машина для секвенирования полоний Polonator была разработана в 2009 году и продана компанией Dover за 170 000 долларов США . [2] [3] Он включал программное обеспечение с открытым исходным кодом, реагенты и протоколы и был предназначен для использования в проекте «Персональный геном» . [4]
Сила и слабости
[ редактировать ]Секвенирование полонии обеспечивает высокую производительность и высокую согласованную точность секвенирования ДНК на основе общедоступного и недорогого инструмента. Кроме того, это очень гибкий метод, который позволяет применять различные варианты, включая BAC (бактериальную искусственную хромосому) и повторное секвенирование бактериального генома, а также метки SAGE (серийный анализ экспрессии генов) и секвенирование штрих-кода. Кроме того, техника секвенирования полоний рассматривается как открытая система, в которой используется все, включая разработанное программное обеспечение, протокол и реагенты.
Однако, хотя сбор необработанных данных может достигать 786 гигабит, полезен только 1 бит информации из 10 000 собранных бит. Еще одной проблемой этого метода является единообразие относительного усиления отдельных целей. Неравномерная амплификация может снизить эффективность секвенирования и считается самым большим препятствием в этой технике.
История
[ редактировать ]Секвенирование полоний — это развитие технологии полонии конца 1990-х и 2000-х годов. [5] В 2003 году были разработаны методы секвенирования полоний in situ с использованием одноосновательного расширения, которое могло обеспечить считывание 5-6 оснований. [6] К 2005 году эти ранние попытки были пересмотрены и направлены на разработку существующей технологии секвенирования полоний. [7] Концепция секвенирования полоний с высокой степенью параллелизма и лигирования легла в основу более поздних технологий секвенирования, таких как ABI Solid Sequencing .
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Секвенирование с открытым исходным кодом» . arep.med.harvard.edu . Проверено 17 сентября 2017 г.
- ^ «После этапа раннего доступа обновленный Polonator готов к выпуску по цене 170 тысяч долларов» . ГеномВеб . 05 мая 2009 г. Проверено 17 сентября 2017 г.
- ^ «Полонатор Дувра не пострадал от реструктуризации Danaher, говорит чиновник» . ГеномВеб . 08.09.2009 . Проверено 17 сентября 2017 г.
- ^ «Полонатор» . 03.04.2015. Архивировано из оригинала 3 апреля 2015 г. Проверено 17 сентября 2017 г.
- ^ Адесси, К.; Мэттон, Г.; Аяла, Г.; Туркатти, Дж.; Мермод, Джей-Джей; Майер, П.; Кавасима, Э. (15 октября 2000 г.). «Твердофазная амплификация ДНК: характеристика механизмов прикрепления праймеров и амплификации» . Исследования нуклеиновых кислот . 28 (20): Е87. дои : 10.1093/нар/28.20.e87 . ISSN 1362-4962 . ПМЦ 110803 . ПМИД 11024189 .
- ^ Шендюр, Джей; Поррека, Грегори Дж.; Реппас, Никос Б.; Линь, Сяося; Маккатчеон, Джон П.; Розенбаум, Авраам М.; Ван, Майкл Д.; Чжан, Кун; Митра, Роби Д. (9 сентября 2005 г.). «Точное мультиплексное секвенирование полонии эволюционировавшего бактериального генома» . Наука . 309 (5741): 1728–1732. Бибкод : 2005Sci...309.1728S . дои : 10.1126/science.1117389 . ISSN 0036-8075 . ПМИД 16081699 . S2CID 11405973 .
- ^ Шендюр, Джей; Поррека, Грегори Дж.; Реппас, Никос Б.; Линь, Сяося; Маккатчеон, Джон П.; Розенбаум, Авраам М.; Ван, Майкл Д.; Чжан, Кун; Митра, Роби Д. (9 сентября 2005 г.). «Точное мультиплексное секвенирование полонии эволюционировавшего бактериального генома» . Наука . 309 (5741): 1728–1732. Бибкод : 2005Sci...309.1728S . дои : 10.1126/science.1117389 . ISSN 0036-8075 . ПМИД 16081699 . S2CID 11405973 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- «Сверхнизкая стоимость секвенирования» . Гарвардские молекулярные технологии.
- «Полонатор» . Дуврские системы. Архивировано из оригинала 21 мая 2013 г.