Парный концевой тег
Парные метки (PET) (иногда «Paired-End diTags» или просто «ditags») представляют собой короткие последовательности на 5'- и 3'-концах фрагмента ДНК , которые достаточно уникальны, поэтому (теоретически) существуют только вместе. один раз в геноме , что делает последовательность ДНК между ними доступной при поиске (если доступны данные о последовательности полного генома) или при дальнейшем секвенировании (поскольку сайты-метки достаточно уникальны, чтобы служить места отжига праймеров ). Теги с парными концами (ПЭТ) существуют в библиотеках ПЭТ без промежуточной ДНК, то есть ПЭТ «представляет» более крупный фрагмент генома или кДНК , состоящий из короткой 5'-линкерной последовательности, короткой 5'-последовательности метки, короткая 3'-метка последовательности и короткая 3'-линкерная последовательность. Концептуально было показано, что 13 пар оснований достаточно для однозначного сопоставления тегов. [ 1 ] Однако более длинные последовательности более практичны для однозначного сопоставления операций чтения . Эндонуклеазы (обсуждаемые ниже) , используемые для производства ПЭТ, дают более длинные метки (18/20 пар оснований и 25/27 пар оснований), но последовательности из 50–100 пар оснований будут оптимальными как для картирования, так и для экономической эффективности. [ 1 ] После извлечения ПЭТ из множества фрагментов ДНК они соединяются (конкатенируются) вместе для эффективного секвенирования. можно секвенировать 20–30 тегов . В среднем с помощью метода Сэнгера , который имеет большую длину считывания, [ 1 ] Поскольку последовательности тегов короткие, отдельные ПЭТ хорошо подходят для секвенирования следующего поколения , которое имеет короткую длину считывания и более высокую пропускную способность. Основными преимуществами секвенирования ПЭТ являются его меньшая стоимость за счет секвенирования только коротких фрагментов, обнаружение структурных вариантов в геноме и повышенная специфичность при обратном выравнивании с геномом по сравнению с одиночными метками, которые задействуют только один конец фрагмента ДНК.
Создание библиотеки ПЭТ
[ редактировать ]
Библиотеки ПЭТ обычно готовят двумя общими методами: на основе клонирования и без клонирования.
На основе клонирования
[ редактировать ]Фрагментированную геномную ДНК или комплементарную ДНК (кДНК), представляющую интерес, клонируют в плазмидные векторы . Сайты клонирования фланкированы адаптерными последовательностями, которые содержат сайты рестрикции для эндонуклеаз (обсуждаются ниже). Вставки лигируются с плазмидными векторами, а затем отдельные векторы трансформируются в E.coli, образуя ПЭТ-библиотеку. Последовательности ПЭТ получают путем очистки плазмиды и расщепления специфической эндонуклеазой, оставляя две короткие последовательности на концах векторов. Во внутримолекулярных (разбавленных) условиях векторы рециркулируются и лигируются, в результате чего в векторе остаются только дитаги. Последовательности, уникальные для клона, теперь объединены в пары. В зависимости от метода секвенирования следующего поколения последовательности ПЭТ могут оставаться единичными, димеризованными или объединяться в длинные цепи. [ 1 ]
На основе клонирования
[ редактировать ]Вместо клонирования адаптеры, содержащие последовательность эндонуклеазы, лигируются к концам фрагментированной геномной ДНК или кДНК. Затем молекулы самоциркулируют и перевариваются эндонуклеазой, высвобождая ПЭТ. [ 1 ] Перед секвенированием эти ПЭТ лигируют с адаптерами, с которыми отжигают праймеры ПЦР для амплификации. Преимущество создания библиотеки на основе клонирования заключается в том, что она сохраняет фрагменты или кДНК неповрежденными для будущего использования. Однако процесс строительства гораздо дольше, чем безклонирующий метод. разработали вариации конструкции библиотеки Компании , занимающиеся секвенированием следующего поколения, в соответствии с их соответствующими технологиями. [ 1 ]
Эндонуклеазы
[ редактировать ]MmeI (тип IIS) и EcoP15I (тип III) В отличие от других эндонуклеаз, эндонуклеазы рестрикции разрезают ниже своих сайтов связывания-мишени. MmeI разрезает 18/20 пар оснований ниже по течению [ 2 ] и EcoP15I разрезает 25/27 пар оснований ниже по течению. [ 3 ] Поскольку эти ферменты рестрикции связываются с целевыми последовательностями, расположенными в адаптерах, они разрезают и высвобождают векторы, которые содержат короткие последовательности фрагмента или кДНК, лигированные с ними, образуя ПЭТ.
ПЭТ-приложения
[ редактировать ]
- ДНК-ПЭТ : поскольку ПЭТ представляет собой связь между метками, использование ПЭТ при повторном секвенировании генома имеет преимущества перед использованием одиночных считываний . Это приложение называется парным конечным секвенированием , в просторечии известное как секвенирование двуствольного дробовика . Уникальное привязывание одной половины пары к одному месту генома позволяет картировать другую половину, которая является неоднозначной. Неоднозначные чтения — это те, которые сопоставляются более чем с одним местоположением. Эта повышенная эффективность снижает стоимость секвенирования, поскольку эти неоднозначные последовательности или чтения обычно отбрасываются. Связность последовательностей ПЭТ также позволяет обнаруживать структурные вариации: инсерции , делеции , дупликации , инверсии , транслокации . [ 1 ] [ 4 ] Во время создания библиотеки PET все фрагменты могут быть выбраны так, чтобы все они имели определенный размер. Таким образом, ожидается, что после картирования последовательности ПЭТ будут постоянно находиться на определенном расстоянии друг от друга. Несоответствие этого расстояния указывает на структурные различия между последовательностями ПЭТ. Например (рисунок справа): делеция в секвенированном геноме будет иметь чтения, которые располагаются дальше, чем ожидалось в эталонном геноме, поскольку эталонный геном будет содержать сегмент ДНК, которого нет в секвенированном геноме.
- ChIP-PET : Совместное использование иммунопреципитации хроматина ( ChIP ) и ПЭТ используется для обнаружения областей ДНК, связанных интересующим белком. ChIP-PET имеет преимущество перед секвенированием одиночного чтения за счет уменьшения неоднозначности генерируемых чтений. Преимущество перед гибридизацией чипов ( ChIP-Chip ) заключается в том, что массивы тайлов гибридизации не обладают той статистической чувствительностью, которую имеет чтение последовательностей. Однако ChIP-PET, ChIP-Seq [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] и чип-чип [ 8 ] все они были весьма успешными. [ 1 ]
- ChIA-PET : применение секвенирования ПЭТ для анализа взаимодействия хроматина. Это общегеномная стратегия обнаружения de novo долгосрочных взаимодействий между элементами ДНК, связанными белковыми факторами. [ 9 ] Первый ChIA-PET был разработан Fullwood et al. . (2009) [ 9 ] создать карту взаимодействий между хроматином, связанным с рецептором эстрогена α (ER-α) в обработанных эстрогеном клетках аденокарциномы молочной железы человека . [ 9 ] ChIA-PET — это объективный способ анализа взаимодействий и структур хроматина более высокого порядка, поскольку он может обнаруживать взаимодействия между неизвестными элементами ДНК. Напротив, методы 3C и 4C используются для обнаружения взаимодействий с участием определенной целевой области генома. ChIA-PET аналогичен поиску слитых генов с помощью RNA-PET в том смысле, что парные метки соответствуют различным областям генома. [ 1 ] Однако ChIA-PET предполагает искусственное лигирование между различными фрагментами ДНК, расположенными в разных геномных регионах, а не естественное слияние двух геномных регионов, как в RNA-PET.
- РНК-ПЭТ : это приложение используется для изучения транскриптома : транскриптов, генных структур и экспрессии генов. [ 1 ] [ 10 ] Библиотека ПЭТ создается с использованием полноразмерных кДНК, поэтому дитаги представляют собой 5'-кепированные и 3'-концевые сигнатуры полиА отдельных транскриптов. Поэтому РНК-ПЭТ особенно полезна для разграничения границ транскрипционных единиц. Это поможет идентифицировать альтернативные сайты начала транскрипции и сайты полиаденилирования генов. [ 1 ] РНК-ПЭТ также можно использовать для обнаружения слитых генов и транс-сплайсинга , но необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы различить их. [ 11 ] Другие методы определения границ транскриптов включают стратегии с одной меткой CAGE , SAGE и самую последнюю версию SuperSAGE , где CAGE и 5' SAGE определяют сайты начала транскрипции, а 3' SAGE определяют сайты полиаденилирования . [ 1 ] Преимущества секвенирования ПЭТ перед этими методами заключаются в том, что ПЭТ идентифицирует оба конца транскриптов и в то же время обеспечивает большую специфичность при обратном картировании генома. Секвенирование кДНК может выявить структуру транскриптов в мельчайших подробностях, но этот подход намного дороже, чем секвенирование РНК-ПЭТ, особенно для характеристики всего транскриптома . [ 10 ] Основным ограничением РНК-ПЭТ является отсутствие информации об организации внутренних экзонов транскриптов. Следовательно, РНК-ПЭТ не подходит для обнаружения альтернативного сплайсинга . Кроме того, если используется процедура клонирования , создайте библиотеку кДНК перед созданием ПЭТ, кДНК, которые трудно клонировать (из-за длинных транскриптов), будут иметь меньший охват. [ 10 ] Точно так же транскрипты (или изоформы транскриптов) с низким уровнем экспрессии, вероятно, также будут недостаточно представлены.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л Фуллвуд, MJ; Вэй, CL; Лю, ET; Руан, Ю. (2009). «Секвенирование ДНК следующего поколения парных концевых меток (ПЭТ) для анализа транскриптома и генома» . Геномные исследования . 19 (4): 521–532. дои : 10.1101/гр.074906.107 . ПМЦ 3807531 . ПМИД 19339662 .
- ^ Морган, доктор медицинских наук; Бхатия, ТК; Ловаско, Л.; Дэвис, ТБ (2008). «MmeI: минимальная система рестрикции-модификации типа II, которая модифицирует только одну цепь ДНК для защиты хозяина» . Исследования нуклеиновых кислот . 36 (20): 6558–6570. дои : 10.1093/nar/gkn711 . ПМК 2582602 . ПМИД 18931376 .
- ^ Мацумура, Х.; Райх, С.; Ито, А.; Сайто, Х.; Камун, С.; Зима, П.; Каль, Г.; Рейтер, М.; Крюгер, Д.Х.; Тераучи, Р. (2003). «Анализ экспрессии генов взаимодействия растения-хозяина и патогена с помощью SuperSAGE» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 100 (26): 15718–15723. Бибкод : 2003PNAS..10015718M . дои : 10.1073/pnas.2536670100 . ПМК 307634 . ПМИД 14676315 .
- ^ МакКернан, К.Дж.; и др. (2009). «Последовательность и структурные вариации в геноме человека, обнаруженные с помощью короткого массового параллельного секвенирования лигирования с использованием двухосновного кодирования» . Геномные исследования . 19 (9): 1527–1541. дои : 10.1101/гр.091868.109 . ПМЦ 2752135 . ПМИД 19546169 .
- ^ Барский, А.; Каддапа, С.; Цюи, К.; Ро, Тайвань; Шонес, Делавэр; Ван, З.; Вэй, Г.; Чепелев И.; Чжао, К. (2007). «Профилирование метилирования гистонов в геноме человека с высоким разрешением» . Клетка . 129 (4): 823–837. дои : 10.1016/j.cell.2007.05.009 . ПМИД 17512414 . S2CID 6326093 .
- ^ Джонсон, Д.С.; Мортазави, А.; Майерс, Р.М.; Уолд, Б. (2007). «Полногеномное картирование взаимодействий белка и ДНК in vivo» . Наука . 316 (5830): 1497–1902. Бибкод : 2007Sci...316.1497J . дои : 10.1126/science.1141319 . ПМИД 17540862 . S2CID 519841 .
- ^ Чен, X.; Сюй, Х.; Юань, П.; Фанг, Ф.; Хасс, М.; Вега, В.Б.; Вонг, Э.; Орлов Ю.Л.; Чжан, В.; Цзян, Дж.; Лох, ЮХ; Йео, ХК; Йо, ZX; Наранг, В.; Говиндараджан, КР; Леонг, Б.; Шахаб, А.; Руан, Ю.; Бурк, Г.; Сунг, ВК; Кларк, Северная Дакота; Вэй, CL; Нг, ХХ (2008). «Интеграция внешних сигнальных путей с основной транскрипционной сетью эмбриональных стволовых клеток» . Клетка . 133 (6): 1106–1117. дои : 10.1016/j.cell.2008.04.043 . ПМИД 18555785 . S2CID 1768190 .
- ^ Ву, Дж.; Смит, Лейтенант; Пласс, К.; Хуанг, TH (2006). «ЧИП-чип достиг совершеннолетия для полногеномного функционального анализа». Исследования рака . 66 (14): 6899–7702. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-06-0276 . ПМИД 16849531 .
- ^ Jump up to: а б с Фуллвуд, MJ; и др. (2009). «Интерактивный хроматин человека, связанный с эстрогеновым рецептором-альфа» . Природа . 462 (7269): 58–64. Бибкод : 2009Natur.462...58F . дои : 10.1038/nature08497 . ПМЦ 2774924 . ПМИД 19890323 .
- ^ Jump up to: а б с Нг, П.; Вэй, CL; Сунг, ВК; Чиу, КП; Липович Л.; Анг, CC; Гупта, С.; Шахаб, А.; Ридван, А.; Вонг, CH; Лю, ET; Руан, Ю. (2005). «Анализ сигнатуры идентификации гена (ГИС) для характеристики транскриптома и аннотации генома». Природные методы . 2 (2): 105–111. дои : 10.1038/nmeth733 . ПМИД 15782207 . S2CID 14288213 .
- ^ Руан, Ю.; Оой, ХС; Чу, Юго-Запад; Чиу, КП; Чжао, XD; Шринивасан, КГ; Яо, Ф.; Чу, CY; Лю, Дж.; Арияратне, П.; Бин, В.Г.; Кузнецов В.А.; Шахаб, А.; Сунг, ВК; Бурк, Г.; Паланисами, Н.; Вэй, CL (2007). «Транскрипты слияния и транскрибируемые ретротранспонированные локусы, обнаруженные посредством комплексного анализа транскриптома с использованием diTags с парными концами (PET)» . Геномные исследования . 17 (6): 828–838. дои : 10.1101/гр.6018607 . ЧВК 1891342 . ПМИД 17568001 .