Одномолекулярный FRET

Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул (или Фёрстера) (или smFRET ) — это биофизический метод, используемый для измерения расстояний в масштабе 1–10 нанометров в отдельных молекулах , обычно биомолекулах . Это применение FRET , при котором пара донорных и акцепторных флуорофоров возбуждается и обнаруживается на уровне одной молекулы. В отличие от «ансамбля FRET», который обеспечивает сигнал FRET большого количества молекул, FRET одной молекулы способен разрешать сигнал FRET каждой отдельной молекулы. Изменение сигнала smFRET полезно для выявления кинетической информации, которую не могут предоставить ансамблевые измерения, особенно когда система находится в равновесии без изменения ансамблевого/объемного сигнала. Также можно наблюдать гетерогенность между различными молекулами. Этот метод применялся во многих измерениях внутримолекулярной динамики, такой как сворачивание/разворачивание ДНК/РНК/белков и других конформационных изменений, а также межмолекулярной динамики, такой как реакции, связывание, адсорбция и десорбция, которые особенно полезны в химическом зондировании, биоанализах и биосенсорство.

Методология

Измерения FRET одиночных молекул обычно выполняются на флуоресцентных микроскопах с использованием поверхностно-иммобилизованных или свободно диффундирующих молекул. Одиночные пары FRET освещаются с использованием интенсивных источников света, обычно лазеров , чтобы генерировать достаточные сигналы флуоресценции для обнаружения одиночных молекул. Широкопольную многофотонную микроскопию обычно комбинируют с флуоресцентным микроскопом полного внутреннего отражения (TIRF) . Это избирательно возбуждает пары FRET на поверхности измерительной камеры и подавляет шум в объеме образца. Альтернативно, конфокальная микроскопия минимизирует фон, фокусируя флуоресцентный свет на точечном отверстии, чтобы отклонить несфокусированный свет. ^{[ 1 ]} Конфокальный объем имеет диаметр около 220 нм, поэтому его необходимо сканировать поперек, если требуется изображение образца. При конфокальном возбуждении можно проводить измерения гораздо глубже в образце, чем при использовании TIRF. Сигнал флуоресценции обнаруживается либо с помощью сверхчувствительных ПЗС-матриц , либо научных КМОП-камер для широкоугольной микроскопии, либо с помощью SPAD для конфокальной микроскопии. ^{[ 2 ]} Как только станут известны зависимости интенсивности отдельных молекул от времени, эффективность FRET можно вычислить для каждой пары FRET как функцию времени, и, таким образом, можно отслеживать кинетические события в масштабе одной молекулы и строить гистограммы FRET, показывающие распределение состояний в каждую молекулу. Однако данные многих пар FRET необходимо записывать и объединять, чтобы получить общую информацию об образце. ^{[ 3 ]} или динамическая структура. ^{[ 4 ]}

Поверхностно-иммобилизованный

В экспериментах с поверхностной иммобилизацией биомолекулы, помеченные флуоресцентными метками, прикрепляются к поверхности покровного стекла и получаются флуоресцентные изображения (обычно с помощью ПЗС-матрицы или научной КМОП- камеры). ^{[ 5 ]} Сбор данных с помощью камер позволит получить видеоролики об образце, которые необходимо будет обработать для определения интенсивности одиночных молекул с течением времени. Если используется конфокальный микроскоп с детектором SPAD , поиск молекул сначала осуществляется путем сканирования образца. Затем конфокальная точка устанавливается на молекулу и напрямую собирает данные об интенсивности и времени, благодаря чему дрейф образца становится незначительным, или для отслеживания молекулы используется активная петля обратной связи.

Преимущество экспериментов с поверхностной иммобилизацией состоит в том, что многие молекулы можно наблюдать параллельно в течение длительного периода времени до фотообесцвечивания (обычно 1-30 с). Это позволяет нам удобно изучать переходы, происходящие на медленных временных масштабах. Недостатком являются дополнительные биохимические модификации, необходимые для связи молекул с поверхностью, а также возмущения, которые поверхность потенциально может оказывать на молекулярную активность. Кроме того, максимальное временное разрешение интенсивности одиночных молекул ограничено временем сбора данных камеры (обычно> 1 мс).

Свободно-диффузионный

SmFRET также можно использовать для изучения конформаций молекул, свободно диффундирующих в жидком образце. В экспериментах smFRET со свободной диффузией (или smFRET на основе диффузии) одни и те же биомолекулы могут свободно диффундировать в растворе, возбуждаясь небольшим объемом возбуждения (обычно пятном, ограниченным дифракцией ). Всплески фотонов, возникающие при пересечении одиночной молекулой пятна возбуждения, регистрируются детекторами SPAD . Конфокальное пятно обычно фиксируется в заданном положении (сканирование не происходит и изображение не получается). Вместо этого фотоны флуоресценции, испускаемые отдельными молекулами, пересекающими объем возбуждения, регистрируются и накапливаются, чтобы построить распределение различных популяций, присутствующих в образце. В зависимости от сложности этого распределения время сбора данных варьируется от ~ 5 минут до нескольких часов.

Отличительным преимуществом установок, использующих детекторы SPAD, является то, что они не ограничены «частотой кадров» или фиксированным временем интеграции, как при использовании камер. Фактически, в отличие от камер, SPAD производят импульс каждый раз, когда обнаруживается фотон, в то время как необходима дополнительная электроника для «отметки времени» каждого импульса с разрешением 10-50 нс. Высокое временное разрешение конфокальных измерений FRET одиночных молекул позволяет наблюдателям потенциально обнаруживать динамику во временных масштабах всего 10 мкс. Однако обнаружение «медленных» переходов на временных масштабах, превышающих время диффузии (обычно ~ 1 мс), сложнее, чем в экспериментах с поверхностной иммобилизацией, и обычно требует гораздо более длительных сборов.

Обычно флуоресцентное излучение как донорного, так и акцепторного флуорофоров обнаруживается двумя независимыми детекторами, а сигнал FRET рассчитывается на основе соотношения интенсивностей в двух каналах. Некоторые конфигурации установки дополнительно разделяют каждый спектральный канал (донор или акцептор) на две ортогональные поляризации (поэтому требуется 4 детектора) и позволяют измерять как FRET, так и анизотропию флуоресценции одновременно . В других конфигурациях одновременно регистрируются 3 или 4 спектральных канала для одновременного измерения нескольких пар FRET. как непрерывные, так и импульсные лазеры В качестве источников возбуждения могут использоваться . При использовании импульсных лазеров подходящее оборудование для сбора данных может измерять время прибытия фотонов относительно последнего лазерного импульса с пикосекундным разрешением в так называемом методе сбора данных с коррелированным по времени подсчетом одиночных фотонов (TCSPC). В этой конфигурации каждый фотон характеризуется макровременем (т.е. грубой временной меткой 10-50 нс) и микровременем (т.е. задержкой по отношению к последнему лазерному импульсу). Последний можно использовать для извлечения информации о сроке службы и получения сигнала FRET.

Анализ данных

Типичные данные smFRET для системы с двумя красителями представляют собой временные траектории интенсивностей флуоресцентного излучения донорного красителя и акцепторного красителя, называемые двумя каналами. Для получения излучения двух красителей в основном используются два метода: (1) накопительное измерение использует фиксированное время экспозиции камер для каждого кадра, таких как камеры PMT, APD, EMCCD и CMOS; (2) временная последовательность прибытия одиночных фотонов, измеренная с помощью детекторов ФЭУ или APD. Принцип заключается в использовании оптических фильтров или дихроичных зеркал для разделения излучений двух красителей и измерения их по двум каналам. установка с использованием двух половин камеры с зарядовой связью (ПЗС). Например, в литературе описана ^{[ 6 ]}

В системе с двумя красителями сигналы излучения затем используются для расчета эффективности FRET между красителями с течением времени. Эффективность FRET — это количество фотонов, испускаемых акцепторным красителем, по отношению к сумме излучений донора и акцепторного красителя. Временные траектории, полученные в каждом эксперименте, могут содержать сигналы неполной или неправильной маркировки или даже агрегатов. Чтобы учесть это, несколько исследовательских групп разработали сложные инструменты для выбора временных трасс на основе множества метрик. ^{[ 7 ]}^{[ 8 ]} или используя глубокую нейронную сеть. ^{[ 9 ]} Обычно возбуждается только донорный краситель, но еще более точную информацию можно получить, если возбуждать донорный и акцепторный краситель поочередно. ^{[ 10 ]} В схеме с одним возбуждением излучение донорных и акцепторных красителей представляет собой просто количество фотонов, собранных для двух красителей, деленное на эффективность сбора фотонов двух каналов соответственно, которая является функцией эффективности сбора, фильтра и оптической эффективности. и эффективность камеры в двух диапазонах длин волн. Эти эффективности могут быть откалиброваны для данной инструментальной установки.

FRET={\frac {\tfrac {I_{A}}{\eta _{A}Q_{A}}}{{\tfrac {I_{A}}{\eta _{A}Q_{A}}}+{\tfrac {I_{D}}{\eta _{D}Q_{D}}}}}.

где FRET — эффективность FRET системы с двумя красителями за определенный период времени, $I_{A}$ и $I_{D}$ измерены количества фотонов акцепторного и донорного каналов соответственно в один и тот же период времени, $\eta _{A}$ и $\eta _{D}$ — эффективность сбора фотонов двух каналов, и $Q_{A}$ и $Q_{D}$ — квантовый выход двух красителей. Таким образом, $I/\eta$ вычисляет фактическое количество фотонов, испускаемых красителем. Если эффективность сбора фотонов в двух каналах одинакова и фактическое расстояние FRET не интересует, можно установить два $\eta$ = 1, и оба квантовых выхода также равны 1.

Для данных накопительного излучения smFRET временные траектории содержат в основном следующую информацию: (1) переходы состояний, (2) шум, (3) размытие камеры (аналог размытия в движении ), (4) фотомигание и фотообесцвечивание красителей. Информация о переходе состояний — это информация, которую требуется типичному измерению. Однако остальные сигналы мешают анализу данных и поэтому должны быть устранены.

Список пакетов программного обеспечения можно найти на сайте KinSoftChallenge. ^{[ 11 ]} Отчет о результатах сравнения этих программных пакетов можно найти здесь. ^{[ 12 ]}^{[ 13 ]}

Шум

Шумовой сигнал излучения красителя обычно содержит шум считывания камеры, дробовый шум и белый шум , а также шум реальной выборки, каждый из которых имеет различное распределение шума из-за разных источников. Шум реального образца возникает из-за теплового возмущения системы, что приводит к расширению расстояния FRET, неравномерному распределению ориентации красителя, изменениям эмиссии красителя, быстрому мерцанию и кинетике, превышающей время интегрирования. Медленные изменения эмиссии красителя, вероятно, считаются ложноположительными состояниями, которых следует экспериментально избегать, выбирая разные красители. Остальные шумы исходят от путей возбуждения и обнаружения, особенно от камеры. В конце концов, шум необработанных данных о выбросах представляет собой комбинацию шумов с распределением Пуассона и распределением Гаусса . Шумы в каждом канале иногда (например, для однофотонных детекторов) можно упростить до суммирования зависящего от интенсивности гауссовского шума (чем выше отсчет, тем больше шум; это комбинация гауссовского и пуассоновского шума с большей амплитудой, который может быть представлена функцией Гаусса) и фоновый шум Пуассона (независимый от количества сигналов). Последний шум доминирует, когда канал находится в состоянии ВЫКЛ или низкой интенсивности (рисунок справа). Шумы можно аппроксимировать распределением Гаусса, особенно при относительно большом количестве сигналов. Затем шумы в двух каналах объединяются в нелинейное уравнение, указанное выше, для расчета значений FRET. Таким образом, шум на траекториях smFRET очень сложен. Шум асимметричен выше и ниже средних значений FRET, и его величина изменяется к двум концам (0 и 1) значений FRET из-за изменения неопределенностей каналов A и D. Большую часть шума можно уменьшить путем объединения данных (см. рисунок) за счет потери временного разрешения. См. GitHub (postFRET) для примера кодов MATLAB для моделирования временных траекторий smFRET без шума и с ним (ссылка GitHub). ^{[ 14 ]}).

Размытие камеры

Сигнал размытия камеры возникает из-за дискретного характера измерений. Сигнал излучения не соответствует реальному сигналу перехода, поскольку один или оба являются стохастическими (случайными). Когда происходит переход состояний между считыванием двух интервалов считывания выбросов, сигнал представляет собой среднее значение двух частей в одном и том же измерительном окне, что затем влияет на точность идентификации состояния и, в конечном итоге, на анализ констант скорости. Это не представляет проблемы, когда частота измерения намного превышает скорость перехода, но становится настоящей проблемой, когда они приближаются друг к другу (рисунок справа). Чтобы отразить эффект размытия камеры в моделируемых траекториях smFRET, необходимо смоделировать данные с более высоким временным разрешением (например, в 10 раз быстрее), чем время сбора данных, а затем объединить данные в окончательные траектории. См. GitHub (postFRET). ^{[ 14 ]} например, коды MATLAB для моделирования временных траекторий smFRET с более быстрым временным разрешением, а затем привязывают их к временному разрешению измерения (времени интегрирования) для имитации эффекта размытия камеры.

Фотомигание и фотообесцвечивание

Временные траектории также содержат информацию о фотомигании и фотообесцвечивании двух красителей. Эту информацию необходимо удалить, что создает пробелы во временной траектории, из-за которых информация FRET теряется. Информацию о фотомигании и фотообесцвечивании можно удалить для типичной системы красителей с относительно длинными интервалами фотомигания и временем жизни фотообесцвечивания, которые были выбраны при измерении. Таким образом, они представляют меньшую проблему для анализа данных. Однако это станет большой проблемой, если будет использоваться краситель с короткими интервалами мигания или длительным временем жизни в темном состоянии. Для решения этих двух проблем были разработаны специальные химические решения, такие как растворы поглотителей кислорода или тушители триплетного состояния.

Алгоритмы идентификации состояния

Для анализа данных было разработано несколько методов анализа данных, таких как методы определения порогов, методы скрытой марковской модели (HMM) и методы идентификации точки перехода. Методы порогового определения просто устанавливают порог между двумя соседними состояниями на траекториях smFRET. Значения FRET выше порога принадлежат одному состоянию, а значения ниже — другому. Этот метод работает для данных с очень высоким соотношением сигнал/шум, поэтому имеет различимые состояния FRET. Этот метод интуитивно понятен и имеет долгую историю применения. Пример исходного кода можно найти в программном обеспечении postFRET. ^{[ 14 ]} HMM основаны на алгоритмах, которые статистически рассчитывают функции вероятности каждого присвоения состояния, т.е. добавляют штрафы к менее вероятному назначению. Типичные пакеты программного обеспечения с открытым исходным кодом можно найти в Интернете, например HaMMy, vbFRET, ebFRET, SMART, SMACKS, MASH-FRET и т. д. ^{[ 15 ]}^{[ 16 ]}^{[ 17 ]} Анализ точек перехода или анализ точек изменений (CPA) использует алгоритмы для определения того, когда происходит переход на временной траектории, с использованием статистического анализа. Например, CPA на основе теории информации Фишера и метода Стьюдента (STASI, с открытым исходным кодом, ссылка на GitHub). ^{[ 18 ]}^{[ 19 ]}) идентифицирует переходы между состояниями и минимизирует длину описания, выбирая оптимальное количество состояний, т.е. балансируя штраф за шум и общее количество состояний.

Анализ ставок

Примеры реакционных сетей с разным количеством состояний smFRET. Константы скорости могут равняться нулю, когда переходы между некоторыми состояниями запрещены, которые можно измерить с помощью smFRET.

После идентификации состояний их можно использовать для расчета расстояний передачи энергии резонанса Фёрстера и констант скорости перехода между состояниями. Для параллельной матрицы реакций между состояниями константы скорости каждого перехода не могут быть извлечены из среднего времени жизни каждого перехода, которое фиксируется как обратная сумма констант скорости. Времена жизни переходов из одного состояния во все другие состояния «одинаковы» для одной молекулы. Однако константы скорости можно рассчитать на основе функций вероятности — количества каждого перехода за общее время состояния, из которого он переходит. ^{[ 20 ]}

k_{if}={\frac {N_{if}}{\sum _{f=1}^{f=n}t_{if}}}={\frac {N_{if}}{t_{i}}}

где i - начальное состояние, f - конечное состояние перехода, N - количество этих переходов во временных траекториях, n - общее количество состояний, k - константа скорости, t - время каждого состояния до переход происходит. Например, измеряются временные траектории smFRET длительностью 130 секунд. Общее время пребывания молекулы в первом состоянии t ₁ = 100 секунд (с), во втором состоянии t ₂ = 20 с и в третьем состоянии t ₃ = 10 с. За 100 с молекула остается в первом состоянии, она переходит во второе состояние 70 раз и переходит в третье состояние 30 раз в конце времени пребывания, константа скорости перехода из состояния 1 в состояние 2 равна k ₁₂ = 70/100 = 0,7 с ⁻¹, константа скорости из состояния 1 в состояние 3 равна k ₁₃ = 30/100 = 0,3 с. ⁻¹. Обычно вероятности длин 70-кратного или 30-кратного перехода (времени пребывания) распределяются экспоненциально (рисунок справа). Среднее время пребывания двух распределений первого состояния, т.е. двух времен жизни, τ ₁₂ и τ ₁₃ , одинаково для этих двух переходов и составляет 1 с (рисунок справа). Число переходов N может быть общим количеством переходов между состояниями или подобранной амплитудой экспоненциальной функции затухания накопленной гистограммы времен пребывания состояний. Последнее работает только для хорошо управляемых распределений времени пребывания. Система, находящаяся в равновесии, в которой каждое состояние параллельно переходит во все остальные в реакциях первого порядка, представляет собой особый случай для облегчения понимания. Когда система не находится в равновесии, это уравнение все еще остается в силе, но при его использовании следует проявлять осторожность.

Интерпретация приведенного выше уравнения просто основана на предположении, что каждая молекула одинакова, эргодической гипотезе . Существование каждого состояния просто представлено его общим временем, которое является его «концентрацией». Таким образом, Скорость перехода в любое другое состояние — это число переходов, нормированное на эту концентрацию. Численно временную концентрацию можно преобразовать в числовую концентрацию, чтобы имитировать ансамблевое измерение. ^{[ 20 ]} Поскольку отдельные молекулы такие же, как и все другие молекулы, мы можем предположить, что временная траектория представляет собой случайную комбинацию множества молекул, каждая из которых занимает очень короткий период времени, скажем 𝛿 t . Таким образом, «концентрация» молекулы в состоянии n равна c _n = t _n / 𝛿 t . Среди всех этих «молекул», если N _nf переходит в состояние f в течение этого времени измерения 𝛿 t , скорость перехода по определению равна r = N _nf / 𝛿 t = k _nf c _n . Таким образом k _{nf знак} равно N _nf / t _n .

Можно видеть, что измерение константы скорости одной молекулы зависит только от эргодической гипотезы, о которой можно судить, если измерено статистически достаточное количество одиночных молекул и наблюдаются ожидаемые хорошие распределения времени пребывания. Гетерогенность среди отдельных молекул также можно наблюдать, если каждая молекула имеет различимый набор состояний или набор констант скорости.

Снизить уровень неопределенности

Уровень неопределенности анализа скорости можно оценить на основе многочисленных экспериментальных испытаний, бутстреп- анализа и анализа ошибок аппроксимации. Неправильное присвоение состояний является распространенным источником ошибок во время анализа данных, которые возникают из-за расширения состояний, шума и размытия камеры. Объединение данных , скользящее среднее и вейвлет-преобразование могут помочь уменьшить эффект расширения состояния и шума, но усилит эффект размытия камеры.

Эффект размытия камеры можно уменьшить за счет более высокой частоты дискретизации, что зависит от разработки более чувствительной камеры, специального анализа данных или того и другого. Традиционно в HMM точки данных до и после перехода специально назначаются, чтобы уменьшить вероятность неправильного назначения этих точек данных состояниям между переходами. Однако у этого метода есть ограничение в работе. Когда частота перехода приближается к частоте дискретизации, слишком много данных размывается для работы этого метода (см. выше рисунок размытия камеры). Сообщается, что экспериментальный подход с использованием импульсного лазера частично преодолевает эффект размытия камеры без очень быстрой камеры. ^{[ 21 ]} Идея состоит в том, чтобы освещать только очень короткий период в каждом цикле сбора данных с камеры, чтобы избежать усреднения сигнала в каждом цикле.

Сообщается также, что двухэтапный метод анализа данных повышает точность анализа размытых камерой данных. Идея состоит в том, чтобы смоделировать траекторию методом Монте-Карло и сравнить ее с экспериментальными данными. При правильных условиях и моделирование, и экспериментальные данные будут содержать одинаковую степень размытия информации и шума. Эта смоделированная траектория является лучшим ответом, чем необработанные экспериментальные данные, поскольку ее основная истина «известна». Этот метод имеет открытый исходный код, доступный как postFRET. ^{[ 22 ]} (ссылка на GitHub ^{[ 14 ]}) и МАШ-ЛАДА. ^{[ 16 ]} Этот метод также может немного скорректировать эффект негауссовского шума, который вызывает трудности с точной идентификацией состояний с использованием статистических методов.

Текущий анализ данных для smFRET по-прежнему требует большой осторожности и специальной подготовки, требуя, чтобы алгоритмы глубокого обучения сыграли роль в освобождении труда при анализе данных.

Преимущества

Сравнение схематических результатов объемного (оранжевый), ансамблевого FRET (черный) и smFRET-измерений системы с тремя состояниями (1-3). Массовые измерения усредняют, а ансамблевые измерения суммируют все состояния, а smFRET разрешает каждое состояние, подсчитывая популяцию молекул в каждом состоянии с течением времени. Кинетическая информация скрыта при объемных и ансамблевых измерениях, но ее можно наблюдать при измерении smFRET путем анализа переходов между каждым состоянием с течением времени.

SmFRET позволяет проводить более точный анализ гетерогенных популяций и имеет ряд преимуществ по сравнению с ансамблевым FRET.

Одним из преимуществ изучения расстояний в отдельных молекулах является то, что гетерогенные популяции можно изучать более точно, используя значения, специфичные для каждой молекулы, а не вычислять среднее значение на основе ансамбля. Это позволяет изучать конкретные однородные популяции внутри гетерогенной популяции. Например, если две существующие гомологичные популяции в гетерогенной популяции имеют разные значения FRET, ансамблевый анализ FRET даст средневзвешенное значение FRET, представляющее популяцию в целом. Таким образом, полученное значение FRET не дает данных о двух разных популяциях. Напротив, smFRET сможет различать две популяции и позволит анализировать существующие гомологичные популяции. ^{[ 23 ]}

SmFRET также обеспечивает динамическое временное разрешение отдельной молекулы, чего невозможно достичь с помощью ансамблевых измерений FRET. Ансамбль FRET обладает способностью обнаруживать густонаселенные переходные состояния , которые накапливаются в популяции, но ему не хватает способности характеризовать промежуточные соединения , которые являются недолговечными и не накапливаются. Этот предел устраняется с помощью smFRET, который предлагает прямой способ наблюдения за промежуточными продуктами отдельных молекул независимо от их накопления. Когда вы наблюдаете за молекулой достаточно долгое время, будут происходить события переходного состояния, которые длятся достаточно долго, чтобы отличить его от шума или расширения других состояний. Таким образом, smFRET демонстрирует способность захватывать временные субпопуляции в гетерогенной среде. ^{[ 24 ]}

Кинетическая информация в равновесной системе теряется на уровне ансамбля, поскольку ни одна из концентраций реагентов и продуктов не меняется с течением времени. Однако на уровне одиночных молекул перенос между реагентами и продуктами может происходить с измеримой высокой скоростью и стохастически уравновешиваться во времени. Таким образом, отслеживание временной траектории конкретной молекулы позволяет напрямую измерить константу скорости каждой стадии перехода, включая интермедиаты, которые скрыты на уровне ансамбля из-за их низких концентраций. Это позволяет использовать smFRET для изучения ДНК , РНК и белков динамики сворачивания . Подобно сворачиванию белка , сворачивание ДНК и РНК проходит через многочисленные взаимодействия, пути сворачивания и промежуточные соединения, прежде чем достичь своего нативного состояния.

Также показано, что SmFRET использует трехцветную систему лучше, чем ансамблевый FRET. Используя два флуорофора-акцептора вместо одного, FRET может наблюдать несколько участков коррелированных движений и пространственных изменений в любой сложной молекуле. Это показано в исследовании Холлидей- Джанкшен . SmFRET с трехцветной системой дает представление о синхронизированных движениях трех спиральных участков соединения и о почти полном отсутствии его параллельных состояний. Ансамбль FRET также может использовать трехцветную систему. Однако любые очевидные преимущества перевешиваются требованиями трехцветной системы, включая четкое разделение сигналов флуорофоров. Для четкого различия сигнала перекрытие FRET должно быть небольшим, но это также ослабляет силу FRET. SmFRET корректирует ограничения перекрытия, используя полосовые фильтры и дихроичные зеркала , которые продвигают сигнал между двумя акцепторами флуоресценции и устраняют любые эффекты просачивания. ^{[ 25 ]}

Приложения

Основным применением smFRET является анализ мельчайших биохимических нюансов, которые способствуют сворачиванию белков . В последние годы было разработано множество методов исследования взаимодействий одиночных молекул, которые участвуют в сворачивании и разворачивании белков. Методы силового зондирования с использованием атомно-силовой микроскопии и лазерного пинцета предоставили информацию о стабильности белка. smFRET позволяет исследователям исследовать молекулярные взаимодействия с помощью флуоресценции. Резонансный перенос энергии Форстера (FRET) был впервые применен к одиночным молекулам Ха и др. и применен к сворачиванию белков в работе Хохштрассера, Вайса и др. Преимущество smFRET в целом для анализа молекулярных взаимодействий заключается в возможности напрямую тестировать взаимодействия отдельных молекул без необходимости усреднения ансамблей данных. При анализе сворачивания белков ансамблевые эксперименты включают измерение множества белков , находящихся в различных переходных состояниях между свернутым и развернутым состоянием . При усреднении структура белка, которую можно вывести из совокупности данных, дает лишь элементарную структурную модель сворачивания белка. Однако истинное понимание сворачивания белка требует расшифровки последовательности структурных событий на путях сворачивания между свернутым и развернутым состояниями. Именно в этой конкретной области исследований smFRET очень применим.

В исследованиях FRET рассчитываются соответствующие эффективности FRET в результате наблюдения с временным разрешением событий сворачивания белков . Эти эффективности FRET затем можно использовать для определения расстояний между молекулами как функции времени. Когда белок переходит между свернутым и развернутым состояниями, соответствующие расстояния между молекулами могут указывать на последовательность молекулярных взаимодействий, которые приводят к сворачиванию белка. ^{[ 26 ]}

Другое применение smFRET — для изучения динамики сворачивания ДНК и РНК. ^{[ 27 ]} Обычно два разных местоположения нуклеотида метят донорным и акцепторным красителями. Изменение расстояния между двумя точками меняется со временем из-за сворачивания и разворачивания нуклеотида, а также случайной диффузии двух точек с течением времени внутри каждого окна измерения и между разными окнами. Из-за сложности траектории складывания/разворачивания измерить процесс на уровне ансамбля крайне сложно. Таким образом, smFRET становится ключевым методом в этой области. Помимо проблем анализа данных smFRET, одна задача состоит в том, чтобы пометить несколько интересующих позиций, другая связана с двухточечной динамикой для расчета общих путей сворачивания.

Одномолекулярный FRET также можно применять для изучения конформационных изменений соответствующих мотивов каналов в определенных каналах . Например, меченые тетрамерные калиевые каналы KirBac были помечены донорными и акцепторными флуорофорами в определенных сайтах, чтобы понять структурную динамику внутри липидной мембраны , что позволило им обобщить аналогичную динамику для аналогичных мотивов в других эукариотических каналах Kir или даже катионных каналах в общий. Использование smFRET в этом эксперименте позволяет визуализировать конформационные изменения, которые невозможно увидеть, если просто усреднить макроскопические измерения. Это приведет к ансамблевому анализу, а не к анализу отдельных молекул и конформационных изменений внутри, что позволит нам обобщить аналогичную динамику для аналогичных мотивов в других эукариотических каналах.

Структурная динамика канала KirBac была тщательно проанализирована как в открытом, так и в закрытом состояниях, в зависимости от присутствия лиганда PIP2 . Часть результатов, полученных с помощью smFRET, продемонстрировала структурную жесткость внеклеточной области. Селективный фильтр и внешнюю петлю области селективного фильтра метили флуорофорами и наблюдали конформационное взаимодействие. Отдельные траектории smFRET убедительно продемонстрировали эффективность FRET около 0,8 без колебаний, независимо от состояния канала. ^{[ 28 ]}

Недавно метод FRET с одной молекулой был применен для количественного обнаружения целевой ДНК и выявления полиморфизма одиночных нуклеотидов. В отличие от ансамблевого FRET, FRET с одной молекулой позволяет отслеживать события связывания мишени в реальном времени. Кроме того, низкий фон и высокое соотношение сигнал/шум, наблюдаемые при использовании метода одиночной молекулы FRET, приводят к сверхчувствительности (предел обнаружения в фемтомолярном диапазоне). предел обнаружения.

Ограничения

Несмотря на приблизительные оценки, ограничением smFRET является сложность определения правильного расстояния, необходимого для передачи энергии. Требование точной оценки расстояния порождает серьезную проблему, поскольку флуоресценция донорных и акцепторных флуорофоров, а также передача энергии зависят от окружающей среды и ориентации красителей, которая может варьироваться в зависимости от гибкости того, где находится флуорофоры связаны. Кроме того, фактическое расстояние данного состояния может быть динамическим, а измеренное значение представляет собой среднее расстояние в течение периода времени сбора данных. Однако этот вопрос не особенно актуален, когда оценку расстояния между двумя флуорофорами не требуется определять с точной и абсолютной точностью. ^{[ 6 ]}

Извлечение кинетической информации из сложной биологической системы со скоростью перехода около нескольких миллисекунд или ниже остается сложной задачей. Текущее временное разрешение таких измерений обычно находится на уровне миллисекунд, а в некоторых отчетах - на уровне микросекунд. Существует теоретическое ограничение фотофизики красителей. Время жизни возбужденного состояния типичной молекулы органического красителя составляет около 1 наносекунды. Чтобы получить статистическую достоверность значений FRET, требуются десятки и сотни фотонов, что обеспечивает наилучшее временное разрешение порядка 1 микросекунды. Чтобы достичь этого предела, требуется очень сильный свет (плотность мощности порядка 1×10 ¹⁰ Вт м ⁻², 10 ⁷ Солнца, обычно достигаемого путем фокусировки лазерного луча с помощью микроскопа), которые часто вызывают фотоповреждения органических молекул. Другим ограничением является время жизни красителя при фотообесцвечивании, которое зависит от интенсивности света и окислительно-восстановительного стресса окружающей среды. Время фотообесцвечивания типичного органического красителя в типичных экспериментальных условиях (плотность мощности лазера всего несколько солнц) составляет несколько секунд или несколько минут с помощью растворов поглотителей кислорода. Таким образом, кинетические события длительностью более нескольких минут трудно исследовать с помощью органических красителей. Вместо органических красителей необходимо использовать другие зонды с более длительным сроком службы, такие как квантовые точки, полимерные точки и полностью неорганические красители.

Ссылки

^ Мёрнер В.Е., Фромм Д.П. (1 августа 2003 г.). «Методы флуоресцентной спектроскопии и микроскопии одиночных молекул». Обзор научных инструментов . 74 (8): 3597–3619. Бибкод : 2003RScI...74.3597M . дои : 10.1063/1.1589587 . ISSN 0034-6748 . S2CID 11615310 .
^ Мишале X, Кольер Р.А., Скалиа Г, Ингарджиола А, Лин Р., Мийо Дж.Э., Вайс С., Зигмунд О.Х., Тремсин А.С., Валлерга Й.В., Ченг А., Леви М., Ахарони Д., Арисака К., Вилла Ф, Геррьери Ф., Панцери Ф. , Речь I, Гулинатти А, Заппа Ф, Гиони М, Кова С (февраль 2013). «Разработка новых детекторов счета фотонов для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул» . Философские труды Лондонского королевского общества. Серия Б, Биологические науки . 368 (1611): 20120035. doi : 10.1098/rstb.2012.0035 . ПМЦ 3538434 . ПМИД 23267185 .
^ Ха Т., Эндерле Т., Оглтри Д.Ф., Чемла Д.С., Селвин П.Р., Вайс С. (июнь 1996 г.). «Исследование взаимодействия между двумя одиночными молекулами: резонансный перенос энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (13): 6264–8. Бибкод : 1996PNAS...93.6264H . дои : 10.1073/pnas.93.13.6264 . ПМК 39010 . ПМИД 8692803 .
^ Хелленкамп Б., Вортманн П., Кандзия Ф., Захариас М., Хьюгель Т. (февраль 2017 г.). «Многодоменная структура и коррелированная динамика, определяемая самосогласованными сетями FRET» . Природные методы . 14 (2): 176–182. дои : 10.1038/nmeth.4081 . ПМЦ 5289555 . ПМИД 27918541 .
^ Кастантин М., Шварц Д.К. (декабрь 2011 г.). «Соединение редких конформаций ДНК и динамики поверхности с помощью резонансной передачи энергии одной молекулы» . АСУ Нано . 5 (12): 9861–9. дои : 10.1021/nn2035389 . ПМЦ 3246573 . ПМИД 21942411 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Рой Р., Хонг С., Ха Т (июнь 2008 г.). «Практическое руководство по одномолекулярным FRET» . Природные методы . 5 (6): 507–16. дои : 10.1038/nmeth.1208 . ПМЦ 3769523 . ПМИД 18511918 .
^ Преус С., Ноер С.Л., Хильдебрандт Л.Л., Гуднасон Д., Биркедал В. (июль 2015 г.). «iSMS: программное обеспечение для FRET-микроскопии одиночных молекул». Природные методы . 12 (7): 593–594. дои : 10.1038/nmeth.3435 . ПМИД 26125588 . S2CID 30222505 .
^ Джуэтт, Мануэль Ф (февраль 2016 г.). «Одномолекулярное изображение неравновесных молекулярных ансамблей в миллисекундном масштабе времени» . Природные методы . 13 (4): 341–344. дои : 10.1038/nmeth.3769 . ПМЦ 4814340 . ПМИД 26878382 .
^ Томсен Дж., Слетфьердинг М.Б., Йенсен С.Б., Стелла С., Пол Б., Малле М.Г. и др. (ноябрь 2020 г.). «DeepFRET, программное обеспечение для быстрой и автоматизированной классификации данных FRET одиночных молекул с использованием глубокого обучения» . электронная жизнь . 9 : e60404. doi : 10.7554/eLife.60404 . ПМК 7609065 . ПМИД 33138911 .
^ Хеллемкамп Б., Шмид С. и др. (сентябрь 2018 г.). «Прецизионность и достоверность измерений FRET одиночных молекул — многолабораторное сравнительное исследование» . Природные методы . 15 (9): 669–676. дои : 10.1038/s41592-018-0085-0 . ПМК 6121742 . ПМИД 30171252 .
^ «KinSoftChallenge — инструменты» .
^ «Вывод кинетических констант скорости на основе траекторий FRET одиночных молекул - слепой эталон инструментов кинетического анализа». bioRxiv 10.1101/2021.11.23.469671 .
^ Гётц М, Барт А, Бор С.С., Бёрнер Р., Чен Дж., Кордес Т., Эри Д.А., Гебхардт С., Хаджич М.К., Гамильтон Г.Л., Хацакис Н.С., Хьюгель Т., Кисли Л., Лэмб Д.С., де Ланнуа С., Ман С., Дунукара Д, де Риддер Д, Санабриа Х, Шимпф Дж, Зайдель К.А., Сигел Р.К., Слетфьердинг МБ, Томсен Дж., Фоллмар Л., Ваннингер С., Венингер К.Р., Сюй П., Шмид С. (сентябрь 2022 г.). «Слепой тест инструментов анализа для определения кинетических констант скорости на основе траекторий FRET одиночных молекул» . Природные коммуникации . 13 (1): 5402. Бибкод : 2022NatCo..13.5402G . дои : 10.1038/s41467-022-33023-3 . ПМЦ 9474500 . ПМИД 36104339 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и «GitHub — nkchenjx/PostFRET: метод подбора данных FRET для одиночных молекул в два этапа для повышения точности» . Гитхаб . 5 ноября 2020 г.
^ Даниал Х.С., Гарсиа-Саес А.Дж. (октябрь 2017 г.). «Повышение уверенности в визуализации одиночных молекул». Современное мнение в области структурной биологии . 46 : 24–30. дои : 10.1016/j.sbi.2017.04.007 . ПМИД 28482279 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Бёрнер Р., Коверко Д., Хаджич М.К., Кениг С.Л., Риттер М., Сигель Р.К. (2018). «Моделирование экспериментов по флуоресценции одиночных молекул с помощью камеры» . ПЛОС ОДИН . 13 (4): e0195277. Бибкод : 2018PLoSO..1395277B . дои : 10.1371/journal.pone.0195277 . ПМК 5898730 . ПМИД 29652886 .
^ Шмид С., Гетц М., Хьюгель Т. (2016). «Анализ одиночных молекул за пределами времени пребывания: демонстрация и оценка в равновесии и выходе из него» . Биофизический журнал . 111 (7): 1375–1384. arXiv : 1605.08612 . Бибкод : 2016BpJ...111.1375S . дои : 10.1016/j.bpj.2016.08.023 . ПМК 5052450 . ПМИД 27705761 .
^ «Код поиска состояния STaSI FRET Landes Lab» . Гитхаб. 6 марта 2019 г.
^ Шуанг Б., Купер Д., Тейлор Дж.Н., Кисли Л., Чен Дж., Ван В. и др. (сентябрь 2014 г.). «Быстрый переход и идентификация состояний (STASI) для дискретного анализа данных одиночных молекул» . Журнал физической химии . 5 (18): 3157–3161. дои : 10.1021/jz501435p . ПМК 4167035 . ПМИД 25247055 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Чен Дж., Пайл Дж.Р., Сай Пьекко К.В., Коломейский А.Б., Ландес К.Ф. (июль 2016 г.). «Двухэтапный метод анализа данных smFRET». Журнал физической химии Б. 120 (29): 7128–7132. doi : 10.1021/acs.jpcb.6b05697 . ПМИД 27379815 .
^ Николсон Д.А., Несбитт-диджей (2021). «Доведение кинетических измерений одиночных молекул с помощью камеры до предела захвата кадров с помощью стробоскопического smFRET» . Журнал физической химии Б. 125 (23): 6080–6089. дои : 10.1021/acs.jpcb.1c01036 . ПМИД 34097408 . S2CID 235369132 .
^ Чен Дж., Пайл Дж.Р., Сай Пьекко К.В., Коломейский А.Б., Ландес К.Ф. (июль 2016 г.). «Двухэтапный метод анализа данных smFRET». Журнал физической химии Б. 120 (29): 7128–32. doi : 10.1021/acs.jpcb.6b05697 . ПМИД 27379815 . S2CID 4782546 .
^ Ха Т (сентябрь 2001 г.). «Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции». Методы . 25 (1): 78–86. дои : 10.1006/meth.2001.1217 . ПМИД 11558999 . S2CID 13893394 .
^ Хинтердорфер П., ван Ойен А., ред. (2009). Справочник по биофизике одиночных молекул (1-е изд.). Дордрехт: Спрингер. ISBN 978-0-387-76497-9 .
^ Хон С., Джу С., Ха Т (август 2004 г.). «Одномолекулярная трехцветная ЛАДА» . Биофизический журнал . 87 (2): 1328–37. Бибкод : 2004BpJ....87.1328H . дои : 10.1529/biophysj.104.043935 . ПМЦ 1304471 . ПМИД 15298935 .
^ Шулер Б., Итон, Вашингтон (февраль 2008 г.). «Складывание белков, изученное с помощью FRET одиночных молекул» . Современное мнение в области структурной биологии . 18 (1): 16–26. дои : 10.1016/j.sbi.2007.12.003 . ПМЦ 2323684 . ПМИД 18221865 .
^ Чен Дж., Поддар Н.К., Таузин Л.Дж., Купер Д., Коломейский А.Б., Ландес К.Ф. (25 сентября 2014 г.). «Одномолекулярные FRET-исследования динамики разворачивания шпильки ДНК ВИЧ-TAR» . Журнал физической химии Б. 118 (42): 12130–12139. дои : 10.1021/jp507067p . ПМК 4207534 . ПМИД 25254491 .
^ Ван С., Вафабахш Р., Боршель В.Ф., Ха Т., Николс К.Г. (январь 2016 г.). «Структурная динамика ворот калиевых каналов, выявленная с помощью FRET одиночной молекулы» . Структурная и молекулярная биология природы . 23 (1): 31–36. дои : 10.1038/nsmb.3138 . ПМЦ 4833211 . ПМИД 26641713 .

Внешние ссылки

[1] Мёрнер В.Е., Фромм Д.П. (1 августа 2003 г.). «Методы флуоресцентной спектроскопии и микроскопии одиночных молекул». Обзор научных инструментов . 74 (8): 3597–3619. Бибкод : 2003RScI...74.3597M . дои : 10.1063/1.1589587 . ISSN 0034-6748 . S2CID 11615310 .

[2] Мишале X, Кольер Р.А., Скалиа Г, Ингарджиола А, Лин Р., Мийо Дж.Э., Вайс С., Зигмунд О.Х., Тремсин А.С., Валлерга Й.В., Ченг А., Леви М., Ахарони Д., Арисака К., Вилла Ф, Геррьери Ф., Панцери Ф. , Речь I, Гулинатти А, Заппа Ф, Гиони М, Кова С (февраль 2013). «Разработка новых детекторов счета фотонов для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул» . Философские труды Лондонского королевского общества. Серия Б, Биологические науки . 368 (1611): 20120035. doi : 10.1098/rstb.2012.0035 . ПМЦ 3538434 . ПМИД 23267185 .

[3] Ха Т., Эндерле Т., Оглтри Д.Ф., Чемла Д.С., Селвин П.Р., Вайс С. (июнь 1996 г.). «Исследование взаимодействия между двумя одиночными молекулами: резонансный перенос энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (13): 6264–8. Бибкод : 1996PNAS...93.6264H . дои : 10.1073/pnas.93.13.6264 . ПМК 39010 . ПМИД 8692803 .

[4] Хелленкамп Б., Вортманн П., Кандзия Ф., Захариас М., Хьюгель Т. (февраль 2017 г.). «Многодоменная структура и коррелированная динамика, определяемая самосогласованными сетями FRET» . Природные методы . 14 (2): 176–182. дои : 10.1038/nmeth.4081 . ПМЦ 5289555 . ПМИД 27918541 .

[5] Кастантин М., Шварц Д.К. (декабрь 2011 г.). «Соединение редких конформаций ДНК и динамики поверхности с помощью резонансной передачи энергии одной молекулы» . АСУ Нано . 5 (12): 9861–9. дои : 10.1021/nn2035389 . ПМЦ 3246573 . ПМИД 21942411 .

[Roy_2008-6] Перейти обратно: ^а ^б Рой Р., Хонг С., Ха Т (июнь 2008 г.). «Практическое руководство по одномолекулярным FRET» . Природные методы . 5 (6): 507–16. дои : 10.1038/nmeth.1208 . ПМЦ 3769523 . ПМИД 18511918 .

[7] Преус С., Ноер С.Л., Хильдебрандт Л.Л., Гуднасон Д., Биркедал В. (июль 2015 г.). «iSMS: программное обеспечение для FRET-микроскопии одиночных молекул». Природные методы . 12 (7): 593–594. дои : 10.1038/nmeth.3435 . ПМИД 26125588 . S2CID 30222505 .

[8] Джуэтт, Мануэль Ф (февраль 2016 г.). «Одномолекулярное изображение неравновесных молекулярных ансамблей в миллисекундном масштабе времени» . Природные методы . 13 (4): 341–344. дои : 10.1038/nmeth.3769 . ПМЦ 4814340 . ПМИД 26878382 .

[9] Томсен Дж., Слетфьердинг М.Б., Йенсен С.Б., Стелла С., Пол Б., Малле М.Г. и др. (ноябрь 2020 г.). «DeepFRET, программное обеспечение для быстрой и автоматизированной классификации данных FRET одиночных молекул с использованием глубокого обучения» . электронная жизнь . 9 : e60404. doi : 10.7554/eLife.60404 . ПМК 7609065 . ПМИД 33138911 .

[10] Хеллемкамп Б., Шмид С. и др. (сентябрь 2018 г.). «Прецизионность и достоверность измерений FRET одиночных молекул — многолабораторное сравнительное исследование» . Природные методы . 15 (9): 669–676. дои : 10.1038/s41592-018-0085-0 . ПМК 6121742 . ПМИД 30171252 .

[11] «KinSoftChallenge — инструменты» .

[12] «Вывод кинетических констант скорости на основе траекторий FRET одиночных молекул - слепой эталон инструментов кинетического анализа». bioRxiv 10.1101/2021.11.23.469671 .

[13] Гётц М, Барт А, Бор С.С., Бёрнер Р., Чен Дж., Кордес Т., Эри Д.А., Гебхардт С., Хаджич М.К., Гамильтон Г.Л., Хацакис Н.С., Хьюгель Т., Кисли Л., Лэмб Д.С., де Ланнуа С., Ман С., Дунукара Д, де Риддер Д, Санабриа Х, Шимпф Дж, Зайдель К.А., Сигел Р.К., Слетфьердинг МБ, Томсен Дж., Фоллмар Л., Ваннингер С., Венингер К.Р., Сюй П., Шмид С. (сентябрь 2022 г.). «Слепой тест инструментов анализа для определения кинетических констант скорости на основе траекторий FRET одиночных молекул» . Природные коммуникации . 13 (1): 5402. Бибкод : 2022NatCo..13.5402G . дои : 10.1038/s41467-022-33023-3 . ПМЦ 9474500 . ПМИД 36104339 .

[postFRET_Github-14] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и «GitHub — nkchenjx/PostFRET: метод подбора данных FRET для одиночных молекул в два этапа для повышения точности» . Гитхаб . 5 ноября 2020 г.

[15] Даниал Х.С., Гарсиа-Саес А.Дж. (октябрь 2017 г.). «Повышение уверенности в визуализации одиночных молекул». Современное мнение в области структурной биологии . 46 : 24–30. дои : 10.1016/j.sbi.2017.04.007 . ПМИД 28482279 .

[e0195277-16] Перейти обратно: ^а ^б Бёрнер Р., Коверко Д., Хаджич М.К., Кениг С.Л., Риттер М., Сигель Р.К. (2018). «Моделирование экспериментов по флуоресценции одиночных молекул с помощью камеры» . ПЛОС ОДИН . 13 (4): e0195277. Бибкод : 2018PLoSO..1395277B . дои : 10.1371/journal.pone.0195277 . ПМК 5898730 . ПМИД 29652886 .

[17] Шмид С., Гетц М., Хьюгель Т. (2016). «Анализ одиночных молекул за пределами времени пребывания: демонстрация и оценка в равновесии и выходе из него» . Биофизический журнал . 111 (7): 1375–1384. arXiv : 1605.08612 . Бибкод : 2016BpJ...111.1375S . дои : 10.1016/j.bpj.2016.08.023 . ПМК 5052450 . ПМИД 27705761 .

[18] «Код поиска состояния STaSI FRET Landes Lab» . Гитхаб. 6 марта 2019 г.

[19] Шуанг Б., Купер Д., Тейлор Дж.Н., Кисли Л., Чен Дж., Ван В. и др. (сентябрь 2014 г.). «Быстрый переход и идентификация состояний (STASI) для дискретного анализа данных одиночных молекул» . Журнал физической химии . 5 (18): 3157–3161. дои : 10.1021/jz501435p . ПМК 4167035 . ПМИД 25247055 .

[postFRET-20] Перейти обратно: ^а ^б Чен Дж., Пайл Дж.Р., Сай Пьекко К.В., Коломейский А.Б., Ландес К.Ф. (июль 2016 г.). «Двухэтапный метод анализа данных smFRET». Журнал физической химии Б. 120 (29): 7128–7132. doi : 10.1021/acs.jpcb.6b05697 . ПМИД 27379815 .

[21] Николсон Д.А., Несбитт-диджей (2021). «Доведение кинетических измерений одиночных молекул с помощью камеры до предела захвата кадров с помощью стробоскопического smFRET» . Журнал физической химии Б. 125 (23): 6080–6089. дои : 10.1021/acs.jpcb.1c01036 . ПМИД 34097408 . S2CID 235369132 .

[22] Чен Дж., Пайл Дж.Р., Сай Пьекко К.В., Коломейский А.Б., Ландес К.Ф. (июль 2016 г.). «Двухэтапный метод анализа данных smFRET». Журнал физической химии Б. 120 (29): 7128–32. doi : 10.1021/acs.jpcb.6b05697 . ПМИД 27379815 . S2CID 4782546 .

[23] Ха Т (сентябрь 2001 г.). «Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции». Методы . 25 (1): 78–86. дои : 10.1006/meth.2001.1217 . ПМИД 11558999 . S2CID 13893394 .

[24] Хинтердорфер П., ван Ойен А., ред. (2009). Справочник по биофизике одиночных молекул (1-е изд.). Дордрехт: Спрингер. ISBN 978-0-387-76497-9 .

[25] Хон С., Джу С., Ха Т (август 2004 г.). «Одномолекулярная трехцветная ЛАДА» . Биофизический журнал . 87 (2): 1328–37. Бибкод : 2004BpJ....87.1328H . дои : 10.1529/biophysj.104.043935 . ПМЦ 1304471 . ПМИД 15298935 .

[26] Шулер Б., Итон, Вашингтон (февраль 2008 г.). «Складывание белков, изученное с помощью FRET одиночных молекул» . Современное мнение в области структурной биологии . 18 (1): 16–26. дои : 10.1016/j.sbi.2007.12.003 . ПМЦ 2323684 . ПМИД 18221865 .

[27] Чен Дж., Поддар Н.К., Таузин Л.Дж., Купер Д., Коломейский А.Б., Ландес К.Ф. (25 сентября 2014 г.). «Одномолекулярные FRET-исследования динамики разворачивания шпильки ДНК ВИЧ-TAR» . Журнал физической химии Б. 118 (42): 12130–12139. дои : 10.1021/jp507067p . ПМК 4207534 . ПМИД 25254491 .

[28] Ван С., Вафабахш Р., Боршель В.Ф., Ха Т., Николс К.Г. (январь 2016 г.). «Структурная динамика ворот калиевых каналов, выявленная с помощью FRET одиночной молекулы» . Структурная и молекулярная биология природы . 23 (1): 31–36. дои : 10.1038/nsmb.3138 . ПМЦ 4833211 . ПМИД 26641713 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]

[ 21 ]

[ 22 ]

[ 23 ]

[ 24 ]

[ 25 ]

[ 26 ]

[ 27 ]

[ 28 ]