Вставка РНК
Вставка РНК — это транскрипт РНК известной последовательности и количества, используемый для калибровки измерений в РНК анализах гибридизации , таких как с микрочипами ДНК эксперименты , RT-qPCR и RNA-Seq . [1]
Вставка предназначена для связывания с молекулой ДНК с соответствующей последовательностью , известной как контрольный зонд . [2] [3] [4] Этот процесс специфического связывания называется гибридизацией . Известное количество введенной РНК смешивают с экспериментальным образцом во время подготовки. [2] Степень гибридизации между вставками и контрольными зондами используется для нормализации результатов гибридизации образца РНК. [2]
История
[ редактировать ]Анализы гибридизации нуклеиновых кислот использовались на протяжении десятилетий для обнаружения специфических последовательностей ДНК или РНК. [5] с предшественником ДНК-микрочипа, использованным еще в 1965 году. [6] В таких анализах олигонуклеотиды положительного контроля необходимы для обеспечения стандарта для сравнения концентрации целевой последовательности, а также для проверки и корректировки неспецифического связывания ; то есть случайное связывание РНК с некомплементарными последовательностями ДНК. [7] Эти элементы управления стали известны как «всплески». [1] С появлением микрочипов ДНК в 1990-х годах. [8] и коммерциализации высокопроизводительных методов секвенирования и анализов обнаружения РНК, производители «наборов» для гибридизационного анализа начали предоставлять предварительно разработанные вставки. [1] В случае экспрессии генов анализа на микрочипах или секвенирования РНК (RNA-seq) используются вставки РНК.
Производство
[ редактировать ]Вставки РНК можно синтезировать любым способом создания РНК синтетическим путем или с использованием клеток для транскрипции ДНК в РНК in vivo (в клетках). [1] РНК можно производить in vitro (бесклеточно) с использованием РНК-полимеразы и ДНК с желаемой последовательностью. [1] Крупные производители биотехнологий производят РНК синтетически с помощью высокопроизводительных методов и предоставляют растворы добавок РНК в заранее определенной концентрации. [1] Бактерии, содержащие ДНК (обычно на плазмидах ) для транскрипции в шипы, также коммерчески доступны. [1] Очищенную РНК можно хранить в течение длительного времени в буферном растворе при низкой температуре. [1]
Приложения
[ редактировать ]
ДНК-микрочипы
[ редактировать ]ДНК-микрочипы представляют собой твердые поверхности, обычно небольшой чип, с которыми короткие полимеры ДНК известной последовательности ковалентно связаны . [6] Когда образец неизвестной РНК пропускается через массив, основания РНК соединяются с комплементарной ДНК и связываются с ней . [6] Связанные транскрипты можно обнаружить, что указывает на наличие РНК с соответствующей последовательностью. [6] Анализы на микрочипах ДНК полезны при изучении экспрессии генов , поскольку многие транскрипты мРНК, присутствующие в клетке, могут быть обнаружены одновременно. [6] Вставки РНК известного количества могут обеспечить базовый сигнал для сравнения с сигналом от транскриптов неизвестного количества, так что данные можно нормализовать внутри массива и между различными массивами. [2]
Секвенирование
[ редактировать ]Секвенирование РНК (RNA-Seq) выполняется путем обратной транскрипции РНК в комплементарную ДНК (кДНК) и высокопроизводительного секвенирования кДНК. [9] Такие высокопроизводительные методы могут быть подвержены ошибкам, и для обнаружения и исправления уровней ошибок необходимы известные средства контроля. [9] Контрольные элементы с добавлением РНК могут обеспечить меру чувствительности и специфичности эксперимента по секвенированию РНК. [9]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час Ян IV (2006). «Использование внешнего контроля в экспериментах на микрочипах». ДНК-микрочипы, Часть B: Базы данных и статистика . Методы энзимологии. Том. 411. стр. 50–63. дои : 10.1016/S0076-6879(06)11004-6 . ISBN 9780121828165 . ПМИД 16939785 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Фардин П., Моретти С., Биазотти Б., Риккарди А., Бонасси С., Варесио Л. (2007). «Нормализация микроматрицы низкой плотности с использованием внешнего контроля всплеска: анализ профиля экспрессии клеточных линий макрофагов» . БМК Геномика . 8:17 . дои : 10.1186/1471-2164-8-17 . ПМК 1797020 . ПМИД 17229315 .
- ^ Уилкс Т., Ло Х., Фой Калифорния (2007). «Качество данных микроматрицы - обзор текущих событий». ОМИКС . 11 (1): 1–13. дои : 10.1089/omi.2006.0001 . ПМИД 17411392 .
- ^ Шустер Э.Ф., Блан Э., Партридж Л., Торнтон Дж.М. (2007). «Оценка и коррекция неспецифического связывания в крупномасштабном эксперименте по всплеску» . Геном Биол . 8 (6): 126 р. дои : 10.1186/gb-2007-8-6-r126 . ПМК 2394775 . ПМИД 17594493 .
- ^ Южный, Эдвин М. (2001). «ДНК-микрочипы: история и обзор». ДНК-массивы . Методы молекулярной биологии. Том. 170. Хумана Пресс. стр. 1–15 . дои : 10.1385/1-59259-234-1:1 . ISBN 9780896038226 . ПМИД 11357674 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и Гиллеспи, Д.; Шпигельман, С. (июль 1965 г.). «Количественный анализ гибридов ДНК-РНК с ДНК, иммобилизованной на мембране». Журнал молекулярной биологии . 12 (3): 829–842. дои : 10.1016/s0022-2836(65)80331-x . ISSN 0022-2836 . ПМИД 4955314 .
- ^ Ян, Ивана В. (1 января 2006 г.). «[4] Использование внешнего контроля в экспериментах с микрочипами». ДНК-микрочипы, Часть B: Базы данных и статистика . Методы энзимологии. Том. 411. Академик Пресс. стр. 50–63. дои : 10.1016/S0076-6879(06)11004-6 . ISBN 9780121828165 . ПМИД 16939785 .
- ^ Шена, Марк; Шалон, Дари; Дэвис, Рональд В.; Браун, Патрик О. (20 октября 1995 г.). «Количественный мониторинг закономерностей экспрессии генов с помощью микрочипа комплементарной ДНК». Наука . 270 (5235): 467–470. Бибкод : 1995Sci...270..467S . дои : 10.1126/science.270.5235.467 . ISSN 0036-8075 . ПМИД 7569999 .
- ^ Перейти обратно: а б с Цзян, Личунь; Шлезингер, Феликс; Дэвис, Кэрри А.; Чжан, Ю; Ли, Ренхуа; Салит, Марк; Гингерас, Томас Р.; Оливер, Брайан (1 сентября 2011 г.). «Синтетические стандарты для экспериментов по секвенированию РНК» . Геномные исследования . 21 (9): 1543–1551. дои : 10.1101/гр.121095.111 . ISSN 1088-9051 . ПМК 3166838 . ПМИД 21816910 .