Щелочной лизис

Щелочной лизис или щелочная экстракция — это метод, используемый в молекулярной биологии для выделения плазмидной ДНК из бактерий.

Метод

Бактерии, содержащие плазмиду интересующую , сначала культивируют , затем образец центрифугируют , чтобы сконцентрировать клеточный материал (включая ДНК ) в осадок на дне содержащего сосуд. Супернатант отбрасывают, а осадок затем ресуспендируют в содержащем ЭДТА физиологическом буфере, . Целью ЭДТА является хелатирование катионов двухвалентных металлов, таких как Mg. ²⁺ и Ca ²⁺ , которые необходимы для функционирования ферментов, разрушающих ДНК ( ДНКазы ), а также служат для дестабилизации фосфатного остова ДНК и клеточной стенки. Глюкоза в буфере будет поддерживать осмотическое давление клетки, чтобы предотвратить разрыв клетки. Трис в буфере сохранит pH клетки на уровне 8,0, а РНКаза удалит РНК, что нарушит эксперимент.

Отдельно сильный щелочной раствор, состоящий из детергента додецилсульфата натрия (SDS) и сильного основания, такого как гидроксид натрия готовят и затем добавляют (NaOH). Полученную смесь инкубируют несколько минут. За это время детергент разрушает клеточные мембраны и позволяет щелочи вступить в контакт и денатурировать как хромосомную , так и плазмидную ДНК.После разрыва клеточной мембраны с помощью SDS содержимое клетки нейтрализует NaOH; поэтому pH лизиса снижается с 12,8 до 12,3. Поэтому, если бактериальных клеток недостаточно, дополнительный NaOH будет генерировать небольшие фрагменты ДНК. Но 0,5 М L-аргинина, который может обеспечить стабильный pH, можно использовать вместо 0,1 М гидроксида натрия.

Наконец, ацетат калия добавляют . Это подкисляет раствор и позволяет ренатурировать плазмидную ДНК, но не хромосомную ДНК, которая осаждается из раствора. Другая функция калия – вызвать осаждение додецилсульфата натрия и, таким образом, удаление моющего средства. Проводится заключительное центрифугирование, и на этот раз осадок содержит только мусор и его можно выбросить. Содержащий плазмиду супернатант осторожно удаляют и могут подвергать дальнейшей очистке или использовать для анализа, например, для гель-электрофореза .

Другое использование

Кроме того, щелочной лизис иногда используется для извлечения генетического материала растений. Растительные клетки подвергают воздействию сильнощелочного раствора, содержащего детергент (обычно цвиттер-ионный или неионный детергент, такой как Твин 20 ), и смесь инкубируют при высокой температуре. Этот метод используется не так часто из-за склонности гидроксида натрия повреждать генетический материал, уменьшая размер фрагмента ДНК.

Ссылки

• Щелочной лизис на молекулярной кухне Мамы Джи
• Бирнбойм Х.К., Доли Дж. (ноябрь 1979 г.). «Процедура быстрой щелочной экстракции для скрининга рекомбинантной плазмидной ДНК» . Нуклеиновые кислоты Рез . 7 (6): 1513–23. дои : 10.1093/нар/7.6.1513 . ПМЦ   342324 . ПМИД   388356 .