Центробежный микрофлюидный биочип

Лабораторный диск для анализа структуры белков методом малоуглового рентгеновского рассеяния

Центробежный микрофлюидный биочип или центробежный микрожидкостный биодиск — это разновидность технологии «лаборатория на чипе» , также известная как «лаборатория на диске», которая может использоваться для интеграции таких процессов, как разделение, смешивание, реакция. и обнаружение молекул наноразмера на одной платформе, включая компакт-диск или DVD . Этот тип микрофлюидного биочипа основан на принципе микрофлюидики, позволяющем использовать преимущества неинерционной накачки; для устройств «лаборатория на чипе», использующих неинерционные клапаны и переключатели под действием центробежной силы и эффекта Кориолиса , это делается для того, чтобы распределять жидкости по дискам в строго параллельном порядке.

Этот биодиск представляет собой интеграцию множества технологий в разных областях. Дизайнер должен быть знаком с процессом биологического тестирования, прежде чем проектировать сложные микроструктуры на компакт-диске. Для завершения полного процесса тестирования следует использовать некоторые основные компоненты, такие как клапаны, смесительные узлы и сепараторы. Основными принципами, применяемыми в таких микрофлюидных структурах, являются центробежная сила , эффект Кориолиса и поверхностное натяжение . методы микрообработки , включая нанесение рисунка , фотолитографию и травление При условии, что конструкция проверена, следует использовать . После успешного завершения процесса тестирования на биодиске запускается метод обнаружения. В этой области учеными предложено множество методов. Самый популярный метод — иммуноанализ , который широко используется при биологическом тестировании. Последний шаг — получение данных с биодиска с помощью привода компакт-дисков и модификация программного или аппаратного обеспечения, которое может обеспечить эту функцию. Примером метода является чтение данных с биодиска с использованием обычного привода компакт-дисков со специальным программным обеспечением, преимуществом которого является низкая стоимость.

Как только центробежный микрофлюидный биочип будет разработан достаточно хорошо, чтобы его можно было производить в больших масштабах, предполагается, что он окажет широкое влияние на промышленность, а также на медицинское обслуживание, особенно в развивающихся странах, где высокоточное оборудование недоступно. Люди в развитых странах, которые готовы проводить такие регулярные проверки на дому, также могут получить пользу от этой технологии.

История

Центробежная микрофлюидная платформа, включая чип и устройство, уже почти 40 лет находится в центре внимания академических и промышленных исследований. В системе был адаптирован ряд анализов, ориентированных в первую очередь на биомедицинские применения. Платформа добилась успеха в качестве исследовательского или клинического инструмента и в последнее время получила дальнейшую коммерциализацию. Тем не менее, эта микрофлюидная технология «лаборатория на чипе» за последние 10–15 лет пережила стремительный рост, и новые разработки в области центробежных микрофлюидных технологий имеют потенциал для широкого использования этой платформы. Поэтому были разработаны различные платформы для работы с жидкостями для реализации таких единичных операций, как отбор проб, предварительная подготовка проб, подача реагентов, дозирование, аликвотирование, клапаны, маршрутизация, смешивание, инкубация, промывка, а также аналитическое или препаративное разделение. Интеграция такой подготовки проб, инкубации и анализа на автономном диске в устройство, которое контролирует вращение для автоматической работы, способствует диагностике «образец-ответ» на биомедицинской платформе по месту оказания медицинской помощи .

Доктор Марк Маду из Калифорнийского университета в Ирвине является одним из лидеров в области центробежных микрофлюидных биочипов. Он выполнил несколько исследовательских проектов в этой области и добился таких успехов, как пневматическая откачка в центробежных микрофлюидных платформах, интеграция трехмерного диэлектрофореза с углеродными электродами и серийные сифонные клапаны. Члены его группы работают над такими проектами, как лизис клеток, ПЦР-карты, гибридизация ДНК, диагностика сибирской язвы и обнаружение респираторных вирусов (см. Внешние ссылки). Доктор Хуа-Чжун Юй из SFU.ca также добился большого прогресса в этой области, предложив новый метод цифрового молекулярного диагностического считывания и новый метод обнаружения ДНК на пластиковом компакт-диске. (см. внешние ссылки) Доктор Ган Логан Лю из UIUC в настоящее время также занимается этой областью (см. внешние ссылки).

Проектирование конструкции

Конструкция конструкции основана на принципе микрофлюидики и в платформе использованы типовые компоненты. Было разработано множество структур для центробежных микрожидкостных биочипов, но еще более интересные из них еще не выпущены. Группа Маду изобрела конструкцию клапанной камеры в 2004 году. В последние годы Саки Кондо представил вертикальную конструкцию для транспортировки жидкостей, которая превратила дизайн в трехмерную концепцию. Группа Маду также изобрела конструкцию с последовательным сифонным клапаном, которая значительно упрощает управление потоком. Хун Чен создал спиральный микроканал, который позволяет проводить параллельные испытания с большим количеством этапов.

Принцип

Принцип центробежного микрофлюидного биочипа включает в себя основные силы частицы, а также принцип управления потоком.

Псевдосилы, действующие в центробежной микрофлюидике. В то время как центробежная сила всегда действует радиально наружу, сила Кориолиса действует перпендикулярно как ω, так и скорости жидкости, а сила Эйлера пропорциональна угловому ускорению.

Для частицы в потоке основными силами являются центробежная сила , сила Кориолиса , сила Эйлера и сила вязкости .

Центробежная сила играет роль насоса в текущей жидкости. Он предлагает основной источник для передачи жидкости, текущей от внутреннего радиуса CD к внешнему радиусу. Величина центробежной силы определяется радиусом расположения частицы и скоростью вращения. Формула плотности центробежной силы:

$f_{\mathrm {\omega } }=N{\omega }^{2}r.$

где N - массовая плотность жидкости, ω - и угловая частота r - (радиальное) расстояние между частицей и центром диска.

Формула плотности силы Кориолиса:

$f_{\mathrm {C} }=2N{\omega }u.$

где u — скорость потока .

Сила Кориолиса возникает, когда жидкость имеет составляющую скорости в радиальном направлении. Эта сила обычно меньше центробежной силы, когда скорость вращения недостаточно высока. Когда дело доходит до высокой угловой частоты , сила Кориолиса влияет на поток жидкости, который часто используется для разделения потока жидкости в сепарационной установке.

Другая основная сила — это сила Эйлера , которую часто определяют как ускорение угловой частоты. Например, когда компакт-диск вращается с постоянной скоростью, сила Эйлера относительно медленная. Формула плотности силы Эйлера:

$f_{\mathrm {E} }=Nr{\frac {d{\omega }}{dt}}.$

Что касается частицы в потоке жидкости, вязкая сила равна:

$f_{\mathrm {v} }=v{\frac {\partial ^{2}u}{\partial x^{2}}}.$

v — вязкость жидкости.

Что касается всего потока жидкости, то поверхностное натяжение играет важную роль в управлении потоком. Когда поток проходит через различное поперечное сечение, поверхностное натяжение уравновешивает центробежную силу и в результате блокирует поток жидкости. Более высокая скорость вращения необходима, если жидкость хочет попасть в следующую камеру. Таким образом, благодаря поверхностному натяжению процесс течения разделяется на несколько этапов, что упрощает реализацию управления потоком.

Типичный компонент

В центробежной микрофлюидной структуре имеются различные типичные узлы, включая клапаны, устройства измерения объема, смешивания и переключения потока. Эти типы юнитов могут составлять структуры, которые можно использовать различными способами.

Клапаны

Пассивные клапаны, приводимые в действие исключительно центробежными силами: (a) капиллярные, (b) гидрофобные, (c) разрывное уплотнение, (d) центробежно-пневматическое избыточное давление, (e) центробежно-пневматическое под давлением, (f) коллекторная камера с удаленной вентиляцией (например, , путем смачивания растворимой пленки56), (g) впускная камера с удаленной вентиляцией (например, с помощью конструкции клепсидры), (h) капиллярный сифон, (i) переливной сифон и (j) пневматический сифонный клапан.

Принцип работы клапанов – баланс между центробежной силой и поверхностным натяжением. Когда центробежная сила меньше поверхностного натяжения, поток жидкости будет удерживаться в исходной камере; когда центробежная сила преобладает над поверхностным натяжением из-за более высокой скорости вращения, поток жидкости сломает клапан и перетечет в следующую камеру. Это можно использовать для управления процессом потока, просто управляя скоростью вращения диска.

Наиболее часто используемые клапаны включают гидрофильный клапан, гидрофобный клапан, сифонный клапан и жертвенный клапан.

Что касается гидрофильных и гидрофобных клапанов, то возникновение поверхностного натяжения практически одинаково. Именно внезапное изменение поперечного сечения канала создает поверхностное натяжение. Поток жидкости будет удерживаться в гидрофильном канале, когда поперечное сечение внезапно станет большим, тогда как поток будет удерживаться, когда поперечное сечение гидрофобного канала внезапно сузится.

Сифонный клапан основан на явлении сифона. Когда поперечное сечение канала достаточно мало, жидкость в камере может течь по каналу за счет поверхностного натяжения. В отличие от гидрофильных или гидрофобных клапанов, в этой модели поверхностное натяжение действует как насос, а центробежная сила действует как сопротивление.

Жертвенный клапан – это метод, контролируемый лазерным излучением. Эти жертвенные клапаны состоят из наночастиц оксида железа, диспергированных в парафине . При возбуждении лазерным диодом наночастицы оксида железа внутри воска действуют как интегрированные наноразмерные нагревательные элементы, вызывая быстрое плавление воска при относительно низких интенсивностях возбуждения лазерным диодом. Работа клапана не зависит от скорости вращения или расположения клапанов и, следовательно, позволяет проводить более сложные биологические анализы, интегрированные в диск.

Измерение объема

Принцип аликвотирования.

Измерение объема — типичная функция центробежной струйной техники для достижения определенного количества жидкого реагента. Этого можно добиться, просто подключив к камере переливной канал. Как только жидкость окажется на уровне переливного канала, остальная часть жидкости будет направлена ​​в камеру для отходов, соединенную с переливным каналом.

Смешивание

Смешивание является важной функцией микрофлюидики, которая объединяет различные реагенты для последующего анализа. Поскольку жидкость ограничена микромасштабной областью, смешивание становится затруднительным из-за низкого числа Рейнольдса при ламинарном потоке. Это указывает на то, что здесь происходит не конвективное перемешивание, а диффузия, ограничивающая процесс перемешивания. Эту проблему можно решить несколькими методами. Типичный способ — вращение диска в разные стороны, а именно вращение по часовой стрелке и против часовой стрелки .

Переключение потока

Переключение потока необходимо при подаче реагентов в разные камеры. Распространенным методом переключения потока в центробежном устройстве является использование силы Кориолиса внутри Y-образной конструкции. Когда скорость вращения слишком низкая, поток жидкости будет следовать по первоначальному пути; когда скорость вращения достаточно высока, что почти соответствует центробежной силе, поток жидкости будет направлен в другую камеру.

Другие

При необходимости в микрофлюидных платформах также используются другие функции, такие как седиментация. Из-за разной массы и радиуса разных частиц эти частицы можно разделить по вязкости и скорости. Таким способом можно добиться осаждения различных частиц.

Материалы

Многие структуры могут быть сформированы с использованием наиболее распространенной технологии быстрого прототипирования — мягкой литографии с полидиметилсилоксаном (ПДМС). ПДМС — недорогой прозрачный эластомерный полимер с эластичными механическими свойствами при комнатной температуре. В лаборатории ПДМС смешивают небольшими порциями, разливают в формы, например, из полиметилметакрилата (ПММА) с микромасштабными характеристиками, и отверждают при умеренных температурах от минут до часов. Открытые каналы ПДМС закрываются путем приклеивания компонента, несущего канал, к предметному стеклу или второму плоскому куску ПДМС. Входные и выходные отверстия можно легко сформировать с помощью перфораторов. Хотя многие модификации поверхности не являются постоянными для ПДМС из-за его относительно высокой подвижности цепи по сравнению с полимерами, ПДМС по-прежнему остается актуальным в качестве материала для микрофлюидных применений.

термопласты Также находят применение . Использование технических термопластов имеет множество преимуществ, хотя большинство из этих преимуществ еще не реализовано. Лишь немногие виды пластика оказались подходящими для медицинских микрофлюидных применений. К ним относятся ПММА , полистирол , поликарбонат и различные циклические полиолефиновые материалы. ПММА обладает хорошими оптическими свойствами для флуоресценции, а режимы УФ-детектирования относительно легко герметизировать сами по себе. Они доступны в сортах, подходящих как для литья под давлением, так и для компрессионного формования. Полистирол — это материал, известный своими аналитическими разработками. Поликарбонаты имеют высокую температуру стеклования, но плохие оптические свойства для флуоресцентного обнаружения. Циклические полиолефины обладают лучшим сочетанием оптических и механических свойств.

Обнаружение

Отправка сигнала

Подготовка проб

Прежде чем молекулы вступят в реакцию с реагентами, их следует подготовить к реакциям. Наиболее типичным является разделение центробежной силой. В случае с кровью, например, осаждения клеток крови из плазмы можно добиться, вращая биодиск в течение некоторого времени. После разделения все молекулярные диагностические анализы требуют этапа лизиса клеток/вируса, чтобы высвободить геномный и протеомный материал для последующей обработки. Типичные методы лизиса включают химический и физический метод. Метод химического лизиса, который является самым простым, использует химические моющие средства или ферменты для разрушения мембран. Физический лизис может быть достигнут с помощью системы взбивания шариков на диске. Лизис происходит за счет столкновений и сдвига между шариками и клетками, а также за счет сдвига при трении вдоль стенок камеры лизиса.

ИФА/ФИА

ИФА (иммуноферментный анализ) и ФИА (флуоресцентный иммуноанализ) представляют собой два метода иммуноанализа . Иммуноанализы являются стандартными инструментами, используемыми в клинической диагностике. Эти тесты основаны на специфическом обнаружении либо антитела, либо антигена и обычно выполняются путем мечения интересующего антитела/антигена различными способами, такими как флуоресцентные или ферментативные метки. Однако промывка, смешивание и инкубация всегда занимают много времени. При интеграции в микрожидкостные биодиски время обнаружения становится чрезвычайно коротким, и такие типы тестов могут широко использоваться в этой области.

В методе ELISA ферменты используются для получения обнаруживаемого сигнала от комплекса антитело-антиген. На первом этапе любой присутствующий антиген будет связываться с захватывающими антителами, нанесенными на поверхность канала. Затем обнаруживают антитела, добавляемые для связывания с антигеном. Вторичное антитело, связанное с ферментом, следует за детектирующими антителами и связывается с ними. Наконец, когда добавляется субстрат, он преобразуется ферментом в обнаруживаемую форму. Основываясь на этом принципе, Сержи Мораис провел мультиплексные микроиммуноанализы на универсальном цифровом диске. Этот мультиплексный анализ позволяет достичь предела обнаружения (IC10) 0,06 мкг/л и чувствительности (IC50) 0,54 мкг/л.

В дополнение к типичным анализам ELISA, флуоресцентные иммуноанализы (FIA) также вводятся на центробежном микрофлюидном устройстве. Принцип ФИА почти такой же, как и ИФА; Наиболее существенное отличие состоит в том, что вместо ферментов используются флуоресцентные метки.

Анализ нуклеиновых кислот

При детектировании нуклеиновых кислот с использованием ген-специфической амплификации нуклеиновых кислот с помощью флуоресцентного красителя или зонда микрочипы нуклеиновых кислот, такие как микрочипы ДНК, стали важными инструментами для генетического анализа, профилирования экспрессии генов и генетической диагностики. При ген-специфической амплификации нуклеиновой кислоты для амплификации целевого генетического маркера с помощью ДНК-связывающего флуоресцентного красителя используют стандартную ПЦР или изотермическую амплификацию, такую ​​как петлевая изотермическая амплификация (LAMP), или для этого применяют специфичный для последовательности зонд. генерация сигнала. Флуоресценцию можно обнаружить в модифицированном приводе CD/DVD или дисковом устройстве.

В микрочипах нуклеиновых кислот процесс иммобилизации зонда и амплификации сигнала можно разделить на пять этапов. Поверхность микроканала сначала облучают УФ-светом в присутствии озона для получения гидрофильной поверхности с высокой плотностью групп карбоновой кислоты (шаг 1). Затем молекулы-зонды (биотин, ДНК или IgG плазмы человека) ковалентно прикрепляются к поверхности полиуглерода посредством амидного связывания (этап 2). Позже целевые молекулы помечаются флуоресцентными метками, и эта меченная биотином целевая ДНК гибридизуется с ДНК-зондом, иммобилизованным на диске (шаг 3). Впоследствии наночастицы золота связываются с мишенью через конъюгат стрептавидина (шаг 4). Затем на золотое «семя» наносится серебро (шаг 5), чтобы увеличить размер частиц от нескольких до нескольких сотен нанометров. Усиление флуоресценции будет обнаружено системой обнаружения в приводе компакт-дисков.

Прием сигнала

Система обнаружения должна комплектоваться компонентом приема сигнала. Существует примерно три типа систем, которые можно использовать для обнаружения. Первый — это модификация аппаратного и программного обеспечения, то есть необходимо модифицировать привод CD/DVD и одновременно разрабатывать программное обеспечение. Этот тип потребует лишней рабочей силы и затрат и может оказаться неуниверсальным в развивающихся странах или регионах проживания коренного населения. Второй тип — это модификация программного обеспечения с использованием стандартного оборудования. Это означает, что обнаружение может быть достигнуто путем разработки специального программного обеспечения для интерпретации на таких платформах, как C++, без внесения каких-либо изменений в оборудование. В-третьих, это стандартное аппаратное обеспечение и существующее программное обеспечение, а это означает, что обнаружение можно реализовать, просто используя существующее оборудование. Ману Паллапа описал новый протокол для считывания и количественной оценки анализов связывания биотина со стрептавидином с помощью стандартного оптического привода с использованием текущего программного обеспечения для анализа данных компакт-диска (IsoBuster). Оба последних типа важны при столкновении с различными ситуациями.

Независимо от того, какой тип системы обнаружения используется, важным фактором является метод считывания. В основном существует два метода считывания: AAS (полученные аналоговые сигналы) и ERD (обнаружение ошибок чтения). В методе ААС для определения мультианалитов на DVD аналоговые сигналы, получаемые непосредственно с фотодиода CD/DVD-привода, хорошо коррелируют с оптической плотностью продуктов реакции. Метод ERD основан на анализе ошибок чтения. Он может использовать тот же цифровой универсальный диск и стандартный привод DVD без какого-либо дополнительного оборудования.

ЭРД

В методе ERD положение и уровень результирующей ошибки считывания соответствуют физическому местоположению и интенсивности сигнала биоанализа соответственно. Затем ошибки сравниваются с идеально записанным компакт-диском, чтобы определить время, когда была считана одна определенная ошибка. Существует несколько бесплатных диагностических программ CD-качества, таких как PlexTools Professional, Kprobe и CD-DVD Speed, которые можно использовать для доступа к статистической информации об ошибках в приводе CD/DVD и для создания графика, отображающего изменение частота ошибок блоков как функция времени воспроизведения. Например, в типичном компакт-диске CD-R емкостью 700 МБ, содержащем 79,7 минут аудиоданных, радиус возникновения ошибки можно рассчитать по следующему уравнению:

$r={\sqrt {{t \over 79.7}(58^{2}-25^{2})+25^{2}}}$

t — время считывания, а r — радиус местоположения.

ААС

В методе AAS набор сервосистем (сервофокусировка, отслеживание, салазки и шпиндель) удерживает лазерный луч сфокусированным на спиральной дорожке и обеспечивает вращение диска и движение лазерной головки во время сканирования. Плата усиления/обнаружения (DAB) интегрирована в привод CD/DVD и включает в себя фотодатчик и электронную схему для усиления радиочастотного сигнала, извлекаемого из фотодиодного преобразователя. Фотодатчик генерирует триггерный сигнал при обнаружении триггерной метки. Оба сигнала передаются на плату сбора данных USB2.0 (DAQ) для оцифровки и количественного анализа.

См. также

• лаборатория на чипе
• тестирование на месте оказания медицинской помощи
• диагностическое тестирование
• МЭМС
• Иммуноанализ

Ссылки

• Горкин, Роберт (2010). «Центробежная микрофлюидика для биомедицинских применений». Лаборатория на чипе . 10 (14): 1758–73. arXiv : 1802.05610 . дои : 10.1039/b924109d . ПМИД   20512178 .
• Дюкри, Йенс (2007). «Центробежная микрофлюидная платформа Bio-Disk». Дж. Микромехан. Микроинж . 17 (7): 103–115. дои : 10.1088/0960-1317/17/7/s07 .
• Зигрист, Джонатан (2010). «Серийный сифонный клапан для центробежных микрофлюидных платформ» (PDF) . Микрофлюид Нанофлюид . 9 : 55–63. дои : 10.1007/s10404-009-0523-5 .
• Ли, Юньчао (2008). «Цифровая молекулярная диагностика: чтение биоанализов с дисков с помощью стандартных компьютерных накопителей». Анальный. Хим . 80 (21): 8216–8223. дои : 10.1021/ac8012434 . ПМИД   18821732 .
• Ли, Юньчао (2007). «Обнаружение ДНК на пластике: протокол активации поверхности для преобразования поликарбонатных подложек в платформы биочипов». Анальный. Хим . 79 (2): 426–433. дои : 10.1021/ac061134j . ПМИД   17222004 .
• Бреннер, Тило (2005). «Частотно-зависимое управление поперечным потоком в центробежной микрофлюидике». Лаборатория на чипе . 5 (2): 146–150. дои : 10.1039/b406699e . ПМИД   15672127 .
• Лай, Сийи (2004). «Разработка компактной дискообразной микрофлюидной платформы для иммуноферментного анализа». Анальный. Хим . 76 (7): 1832–1837. дои : 10.1021/ac0348322 . ПМИД   15053640 .
• Кондо, Саки (2010). «Вертикальная транспортировка жидкости через структуру капиллярного пучка с использованием центробежной силы». Микросистем Технол . 16 (8–9): 1577–1580. дои : 10.1007/s00542-010-1111-z .
• Чен, Хун (2010). «Вращающийся микрофлюидный чип для анализа окрашивания». Таланта . 81 (4–5): 1203–1208. дои : 10.1016/j.talanta.2010.02.011 . ПМИД   20441885 .
• Клапперих, Екатерина (2009). «Микрофлюидная диагностика: время отраслевых стандартов» . Эксперт преподобный мед. Устройства . 6 (3): 211–213. дои : 10.1586/erd.09.11 . ПМИД   19419277 .
• Мораис, Сержи (2009). «Мультиплексные микроиммуноанализы на универсальном цифровом диске». Анальный. Хим . 81 (14): 5646–5654. дои : 10.1021/ac900359d . ПМИД   19522512 .
• Паллапа, Ману (2010). «Программное обеспечение количественного анализа биоанализов на компакт-диске». Датчики и исполнительные механизмы . 148 (2): 620–623. дои : 10.1016/j.snb.2010.05.045 .
• Мораис, Сержи (2008). «Аналитическая перспектива использования компакт-дисковой технологии в иммуносенсировании». Анальная биоанальная химия . 391 (8): 2837–2844. дои : 10.1007/s00216-008-2224-4 . ПМИД   18597081 .

Внешние ссылки

• Лаборатория BioMEMS Марка Маду в Калифорнийском университете в Ирвине
• Лаборатория YKCho FRUITS в UNIST
• Веб-страница Хуа-Чжун Юя в ЮФУ
• Веб-страница исследований банды Логана Лью на биодиске
• Публикация в лаборатории на чипе