✖


Jump to content

Анализ термического сдвига

Edit links

Анализ термического сдвига ( TSA ) измеряет изменения температуры термической денатурации и, следовательно, стабильности белка в различных условиях, таких как изменения концентрации лекарственного средства, pH буфера или ионной силы , окислительно-восстановительного потенциала или мутации последовательности . Наиболее распространенным методом измерения тепловых сдвигов белков является дифференциальная сканирующая флуориметрия ( DSF ) или термофлуор , в которой используются специализированные флуорогенные красители. [ 1 ]

Связывание низкомолекулярных лигандов может повысить термическую стабильность белка, как описано Дэниелом Кошландом (1958). [ 2 ] и Кай Ульрик Линдерстрем-Ланг и Шеллман (1959). [ 3 ] Почти половине ферментов требуется кофактор ионов металлов . [ 4 ] Термостабильные белки часто более полезны, чем их нетермостабильные аналоги, например, ДНК-полимераза в полимеразной цепной реакции, [ 5 ] поэтому белковая инженерия часто включает добавление мутации для повышения термостабильности. Кристаллизация белков протекает более успешно для белков с более высокой температурой плавления. [ 6 ] а добавление буферных компонентов, стабилизирующих белки, повышает вероятность образования кристаллов белка. [ 7 ] При изучении pH следует учитывать возможное влияние молекулы буфера на термическую стабильность, а также тот факт, что pKa каждой молекулы буфера однозначно меняется с температурой. [ 8 ] Кроме того, каждый раз, когда исследуется заряженный вид, влияние противоиона следует учитывать .

Термическую стабильность белков традиционно исследовали с помощью биохимических анализов , кругового дихроизма или дифференциальной сканирующей калориметрии . Биохимические анализы требуют каталитической активности рассматриваемого белка, а также специфического анализа. Круговой дихроизм и дифференциальная сканирующая калориметрия потребляют большое количество белка и являются методами с низкой пропускной способностью. Термофлуорный анализ был первым высокопроизводительным анализом термического сдвига, а его полезность и ограничения стимулировали изобретение множества альтернативных методов. У каждого метода есть свои сильные и слабые стороны, но все они борются с внутренне неупорядоченными белками без какой-либо четко определенной третичной структуры , поскольку суть анализа термического сдвига заключается в измерении температуры, при которой белок переходит от четко определенной структуры к беспорядку.

Методы

[ редактировать ]

ДСФ-ГТП

[ редактировать ]

Метод DSF-GTP был разработан командой под руководством Патрика Шеффера из Университета Джеймса Кука и опубликован в Moreau et al. 2012. [ 9 ] Развитие дифференциальной сканирующей флуориметрии и высокая производительность термофлюора значительно облегчили проверку условий кристаллизации белков и больших мутантных библиотек в программах структурной геномики, а также лигандов в программах разработки лекарств и функциональной геномики. Эти методы ограничены требованиями как к высокоочищенным белкам, так и к сольватохромным красителям, что вызывает необходимость в более надежных высокопроизводительных технологиях, которые можно использовать с образцами сырого белка. Эта потребность была удовлетворена разработкой новой высокопроизводительной технологии количественного определения стабильности белков и связывания лигандов методом дифференциальной сканирующей флуориметрии белков, меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP). Эта технология основана на том принципе, что изменения в проксимальном окружении GFP, такие как разворачивание и агрегация интересующего белка, можно измерить по его влиянию на флуоресценцию флуорофора. Технология проста, быстра и нечувствительна к изменениям объемов проб, а полезный диапазон температур и pH составляет 30–80 °C и 5–11 соответственно. Система не требует сольватохромных красителей, что снижает риск помех. Образцы белка просто смешивают с тестовыми условиями в 96-луночном планшете и подвергают протоколу кривой плавления с использованием термоциклера реального времени. Данные получаются в течение 1–2 часов и включают уникальные меры контроля качества с помощью сигнала GFP. DSF-GTP применялся для характеристики белков и скрининга небольших соединений. [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]

Термофлюор

[ редактировать ]
Диаграмма

Впервые методика была описана Семисотновым с соавт. (1991) [ 15 ] с использованием 1,8-АНС и кварцевых кювет. Компания 3 Dimensional Pharmaceuticals первой описала высокопроизводительную версию с использованием планшет-ридера. [ 16 ] и Wyeth Research опубликовали вариант метода с SYPRO Orange вместо 1,8-ANS. [ 17 ] SYPRO Orange имеет профиль длины волны возбуждения/эмиссии, совместимый с машинами qPCR , которые практически повсеместно используются в учреждениях, выполняющих исследования в области молекулярной биологии. Название дифференциальная сканирующая флуориметрия (ДСФ) появилось позже. [ 18 ] но термофлуор предпочтительнее, поскольку термофлуор больше не является товарным знаком, а дифференциальную сканирующую флуориметрию легко спутать с дифференциальной сканирующей калориметрией.

SYPRO Orange неспецифически связывается с гидрофобными поверхностями, а вода сильно тушит его флуоресценцию. Когда белок разворачивается, открытые гидрофобные поверхности связывают краситель, что приводит к увеличению флуоресценции за счет исключения воды. Мицеллы моющего средства также связывают краситель и резко увеличивают фоновый шум. Этот эффект уменьшается при переходе на краситель ANS; [ 19 ] однако этот реагент требует УФ-возбуждения. Кривую стабильности и ее среднее значение (температуру плавления T m, также известную как температура гидрофобного воздействия T h ) получают путем постепенного увеличения температуры для разворачивания белка и измерения флуоресценции в каждой точке. Кривые измеряются только для белка и белка + лиганда и Δ T m рассчитывается . Этот метод может не очень хорошо работать для белок-белковых взаимодействий, если один из партнеров взаимодействия содержит большие гидрофобные участки, поскольку трудно проанализировать предотвращение агрегации, стабилизацию нативных складок и стерические препятствия доступу красителя к гидрофобным сайтам. Кроме того, частично агрегированный белок также может ограничивать относительное увеличение флуоресценции при нагревании; в крайних случаях увеличения флуоресценции вообще не будет, поскольку еще до нагревания весь белок уже находится в агрегатах. Знание этого эффекта может быть очень полезным, поскольку высокое относительное увеличение флуоресценции предполагает наличие значительной доли свернутого белка в исходном материале.

Этот анализ позволяет проводить высокопроизводительный скрининг лигандов на целевой белок и широко используется на ранних стадиях открытия лекарств в фармацевтической промышленности, в усилиях по структурной геномике и высокопроизводительной белковой инженерии.

Типичный анализ

[ редактировать ]
  1. Материалы: флюорометр , оснащенный устройством контроля температуры или аналогичным оборудованием (аппараты для ПЦР); подходящий флуоресцентный краситель; подходящий планшет для анализа, такой как 96-луночный планшет для кПЦР .
  2. Растворы соединений. Тестируемые лиганды готовят в виде раствора с 50–100-кратной концентрацией, обычно в диапазоне 10–100 мМ. Для титрования в типичном протоколе эксперимента используется набор из 12 лунок, содержащих 11 различных концентраций тестируемого соединения с одной лункой для отрицательного контроля.
  3. Раствор белка: Обычно целевой белок разбавляют из концентрированного исходного раствора до рабочей концентрации белка ~ 0,5–5 мкМ с красителем в подходящем буфере для анализа. Точные концентрации белка и красителя определяются экспериментальными исследованиями.
  4. Центрифугирование и дозирование масла: Кратковременное центрифугирование (~1000 × g, 1 мин) аналитического планшета для смешивания соединений с белковым раствором, 1–2 мкл силиконового масла для предотвращения испарения на раствор накладывают при нагревании (в некоторых системах используется вместо пластиковых пломб) с последующим дополнительным этапом центрифугирования (~1000×g, 1 мин).
  5. Инструментальная установка: Типичная скорость изменения температуры находится в диапазоне от 0,1 до 10 °C/мин, но обычно в диапазоне 1 °C/мин. Флуоресценцию в каждой лунке измеряют через регулярные промежутки времени, 0,2–1 °C/изображение, в диапазоне температур, охватывающем типичные температуры разворачивания белка 25–95 °C. [ 20 ]

CPM, тиолспецифические красители

[ редактировать ]

Alexandrov et al. (2008) [ 21 ] опубликовали вариант термофлюорного анализа, в котором SYPRO Orange был заменен на N- [4-(7-диэтиламино-4-метил-3-кумаринил)фенил]малеимид (CPM), соединение, которое флуоресцирует только после реакции с нуклеофилом. CPM имеет большое предпочтение тиолам перед другими типичными биологическими нуклеофилами и, следовательно, будет реагировать с боковыми цепями цистеина раньше других. Цистеины обычно находятся внутри свернутого белка, поскольку они гидрофобны. Когда белок денатурирует, тиолы цистеина становятся доступными, и флуоресцентный сигнал можно считывать по прореагировавшему CPM. Длины волн возбуждения и излучения прореагировавшего CPM составляют 387 нм/463 нм, поэтому требуется устройство для считывания флуоресцентных планшетов или аппарат для количественной ПЦР со специализированными фильтрами. Александров и др. успешно применил этот метод на мембранных белках Apelin GPCR и FAAH, а также на β-лактоглобине, который фибриллируется при нагревании, а не превращается в расплавленную глобулу.

DCVJ, красители, чувствительные к жесткости

[ редактировать ]

4-(дициановинил)джулолидин (DCVJ) представляет собой молекулярный роторный зонд, флуоресценция которого сильно зависит от жесткости его окружения. Когда белок денатурирует, флуоресценция DCVJ увеличивается. Сообщается, что он работает с 40 мг/мл антитела. [ 22 ]

Время жизни собственной флуоресценции триптофана

[ редактировать ]

Время жизни флуоресценции триптофана различается для свернутого и развернутого белка. Количественная оценка времени жизни флуоресценции, возбуждаемой УФ-излучением, в различных температурных интервалах дает измерение T m . Важным преимуществом этого метода является отсутствие необходимости добавления репортерных красителей, поскольку триптофан является неотъемлемой частью белка. Это также может быть недостатком, поскольку не все белки содержат триптофан. Время жизни собственной флуоресценции работает с мембранными белками и мицеллами детергентов, но мощный УФ-флуоресцент в буфере может заглушить сигнал, и опубликовано несколько статей, в которых используется метод анализа термического сдвига.

Собственная длина волны флуоресценции триптофана

[ редактировать ]

Длины волн возбуждения и излучения триптофана зависят от ближайшего окружения и поэтому различаются для свернутых и развернутых белков, так же, как и время жизни флуоресценции. В настоящее время на рынке существует как минимум две машины, которые могут считывать этот сдвиг длины волны с высокой производительностью при нагревании образцов. Преимущества и недостатки те же, что и для времени жизни флуоресценции, за исключением того, что в научной литературе имеется больше примеров использования. [ нужна ссылка ]

Статическое рассеяние света

[ редактировать ]

Статическое рассеяние света позволяет контролировать размеры частиц в растворе. Поскольку белки обычно агрегируются при денатурации (или образуют фибриллы), размер обнаруженных видов будет увеличиваться.

Это не требует метки и не зависит от конкретных остатков в составе белка или буфера. Единственное требование состоит в том, чтобы белок действительно агрегировал/фибриллировался после денатурации и чтобы интересующий белок был очищен.

ФастПП

[ редактировать ]

При быстром параллельном протеолизе исследователь добавляет термостабильную протеазу ( термолизин ) и параллельно отбирает образцы при нагревании в термоградиентном циклере. [ 23 ] Необязательно, например, для белков, экспрессируемых на низких уровнях, затем проводят вестерн-блоттинг , чтобы определить, при какой температуре происходит деградация белка. Для чистых или высокообогащенных белков возможно прямое обнаружение в SDS-PAGE, что облегчает прямое количественное определение на основе флуоресценции Commassie. FastPP использует тот факт, что белки становятся все более восприимчивыми к протеолизу при развертывании и что термолизин расщепляет гидрофобные остатки, которые обычно находятся в ядре белков.

Чтобы уменьшить рабочую нагрузку, вестерн-блоттинг можно заменить SDS-PAGE в геле окрашиванием полигистидиновыми метками при условии, что белок имеет такую ​​метку и экспрессируется в адекватных количествах.

FastPP можно использовать на неочищенных сложных смесях белков и белков, слитых с другими белками, такими как GST или GFP , при условии, что последовательность, являющаяся целью вестерн-блоттинга, например, His-tag , напрямую связана с белком. интереса. Однако активность коммерчески доступного термолизина зависит от ионов кальция и денатурирует при температуре чуть выше 85 градусов Цельсия. Таким образом, в буфере должен присутствовать кальций, а хелаторы кальция отсутствовать - другие соединения, которые мешают функции протеазы (например, высокие концентрации детергентов), также могут быть проблематичными.

FASTpp также использовался для мониторинга связанного со связыванием сворачивания внутренне неупорядоченных белков (IDP).

ВЫКЛЮЧАТЬ

[ редактировать ]
Основная статья: Анализ клеточного теплового сдвига

Анализ клеточного термического сдвига (CETSA ® ) [ 24 ] Это биофизический метод, применимый как к живым клеткам, так и к биопсии тканей. СЕТСА ® основано на открытии того, что кривые плавления белков также могут быть получены в интактных клетках и что связывание лекарств приводит к очень значительной термостабилизации белков. При денатурации белки агрегируются и, таким образом, могут быть удалены центрифугированием после лизиса клеток. Стабильные белки, обнаруженные в супернатанте, можно обнаружить; например, с помощью вестерн-блоттинга, альфа-LISA или масс-спектрометрии. CETSA ® -методика очень строгая, воспроизводимая и не склонна к ложноположительным результатам. [ нужна ссылка ] Однако образец или низкомолекулярное соединение может связать белок на пути заданной мишени. Если этот белок вызывает дальнейшую стабилизацию исходного белка-мишени посредством каскадного события, это может проявиться как прямое взаимодействие с мишенью. Преимущество этого метода заключается в том, что он не требует меток и, следовательно, применим для изучения связывания лекарств в широком спектре клеток и тканей. СЕТСА ® также можно проводить на клеточных лизатах по сравнению с интактными клетками, что помогает определить проникновение образца через клеточную мембрану. [ нужна ссылка ]

ТермоФАД

[ редактировать ]

Вариант термофлуора, специфичный для флавинсвязывающих белков. Аналогично термофлюорному анализу связывания, небольшой объем белкового раствора нагревается и отслеживается увеличение флуоресценции в зависимости от температуры. В отличие от термофлуора, внешний флуоресцентный краситель не требуется, поскольку кофактор флавин уже присутствует во флавинсвязывающем белке, и его флуоресцентные свойства изменяются при разворачивании. [ 25 ]

СЕК-ТС

[ редактировать ]

Эксклюзионную хроматографию можно использовать непосредственно для определения стабильности белка в присутствии или в отсутствие лигандов. [ 26 ] Образцы очищенного белка нагревают на водяной бане или в термоциклере , охлаждают, центрифугируют для удаления агрегированных белков и проводят аналитическую ВЭЖХ . По мере достижения температуры плавления и осаждения или агрегации белка высота пика уменьшается, а высота пустого пика увеличивается. Это можно использовать для идентификации лигандов и ингибиторов, а также оптимизации условий очистки. [ 27 ] [ 28 ]

Несмотря на меньшую производительность, чем FSEC-TS, требующую больших количеств очищенного белка, SEC-TS позволяет избежать любого влияния флуоресцентной метки на кажущуюся стабильность белка.

ФСЭК-ТС

[ редактировать ]

При флуоресцентной эксклюзионной хроматографии интересующий белок флуоресцентно метят (например, GFP ) и пропускают через гель-фильтрационную колонку на системе FPLC , оснащенной флуоресцентным детектором. Полученная хроматограмма позволяет исследователю оценить дисперсность и уровень экспрессии меченого белка в текущем буфере. [ 29 ] Поскольку измеряется только флуоресценция, на хроматограмме виден только меченый белок. FSEC обычно используется для сравнения ортологов мембранных белков или скрининговых детергентов для растворения в них конкретных мембранных белков.

Для анализа термостабильности на основе флуоресцентной эксклюзионной хроматографии (FSEC-TS) образцы нагревают так же, как в FastPP и CETSA, а после центрифугирования для удаления осадка супернатант обрабатывают так же, как и FSEC. [ 30 ] В пустом объеме видны более крупные агрегаты, тогда как высота пика интересующего белка уменьшается при достижении температуры разворачивания.

GFP имеет T m ~76 °C, поэтому метод ограничен температурой ниже ~70 °C. [ 30 ]

Анализ термостабильности связывания радиолигандов

[ редактировать ]

GPCRs являются фармакологически важными трансмембранными белками . Их рентгенокристаллические структуры были обнаружены намного позже других трансмембранных белков, представляющих меньший интерес. Трудность получения белковых кристаллов GPCR, вероятно, связана с их высокой гибкостью. Менее гибкие версии были получены путем усечения, мутации и вставки лизоцима Т4 в рекомбинантную последовательность. Одним из методов, которые исследователи использовали для контроля этих изменений, был анализ термостабильности связывания радиолигандов. [ 31 ]

Анализ проводят путем инкубации белка с радиоактивно меченным лигандом белка в течение 30 минут при заданной температуре, затем гасят на льду, пропускают через мини-колонку с гель-фильтрацией и количественно определяют уровни радиации белка, выходящего из колонки. Концентрация радиолиганда достаточно высока для насыщения белка. Денатурированный белок не способен связывать радиолиганд, и белок и радиолиганд будут разделены в мини-колонке гель-фильтрации. При скрининге отбор мутантов будет проводиться по термической стабильности в специфической конформации, т.е., если радиолиганд является агонистом, отбор будет проводиться по конформации связывания агониста, а если он является антагонистом, то скрининг проводится по стабильности конформации связывания антагониста.

Преимущество радиоанализа состоит в том, что он работает с минимальными количествами белка. Но это работа с радиоактивными веществами и большой объем ручного труда. Для интересующего белка должен быть известен лиганд с высоким сродством, и буфер не должен мешать связыванию радиолиганда. Другие анализы термического сдвига также позволяют выбирать конкретные конформации, если в эксперимент добавляется лиганд соответствующего типа.

Сравнение различных подходов

[ редактировать ]
Термофлюор цена за тысячу показов DCVJ Время жизни флуоресценции триптофана Длина волны флуоресценции триптофана Статическое рассеяние света ФастПП ВЫКЛЮЧАТЬ СЕК-ТС ФСЭК-ТС Анализ термостабильности связывания радиолигандов
Очистка Чистый белок Чистый белок Чистый белок в очень высокой концентрации Чистый белок Чистый белок Чистый белок Сложная смесь Сложная смесь Чистый белок Сложная смесь Сложная смесь
Моющие средства Ниже CMC Да Да Да Да Да Да (низкая концентрация) Да Да Да Да
Буфер Избегайте очень высокой концентрации. органические растворители Избегайте тиолов и, возможно, других нуклеофилов. - - - - Термолизин требует ионов кальция. - - - Следует максимизировать аффинность связывания радиолиганда.
Пропускная способность Самый высокий Самый высокий Самый высокий Средний Средний Средний Средний-низкий (если требуется западный) Самый низкий (средний с FRET) Самый низкий Самый низкий Самый низкий
Требования к последовательности Нет Цистеины не на поверхности и не в дисульфидных связях Нет Триптофан Триптофан Нет Последовательность должна содержать гидрофобные остатки (необходимые для расщепления) Для антител Нет Для флуоресцентной метки Нет
Требования к оборудованию машина для ПЦР Аппарат для количественной ПЦР с УФ-возбуждением или флуоресцентным считывателем планшетов машина для ПЦР Высокопроизводительный считыватель времени жизни дифференциальной собственной флуоресценции Высокопроизводительный дифференциальный считыватель длины волны собственной флуоресценции Высокопроизводительный дифференциальный считыватель статического рассеяния света Термический циклер (или водяная баня) и вестерн-блоттинг Термоциклер (или водяная баня) и вестерн-блоттинг (или считыватель FRET) Термоциклер (или водяная баня) и ВЭЖХ Термоциклер (или водяная баня) и FPLC/HPLC с флуоресцентным считывателем Термоциклер (или водяная баня) и сцинтилляционный счетчик.
Этикетки Да + ДМСО Да + ДМСО Да + ДМСО Без этикеток Без этикеток Без этикеток Без этикеток Без этикеток Без этикеток Да Радиолиганд
Возможное влияние флуорофоров в буфере Да Да Да Да Да Нет Нет Нет Нет Да Нет
Слитые белки Нет Возможно Нет Возможно Возможно Нет Необязательный Нет Нет Да Да
Работает с белками, которые фибриллируют при нагревании. Нет Да, по крайней мере, с бета-лактоглобулином Да Да, наверное Да, наверное Да Да (если расщепление происходит быстрее, чем фибриллизация при высокой концентрации TL) Да Да Да Да

Приложения

[ редактировать ]

Скрининг наркотиков без маркировки

[ редактировать ]

Термофлюор широко использовался в кампаниях по скринингу наркотиков. [ 16 ] [ 32 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 17 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 8 ] Поскольку thermofluor обнаруживает сайты связывания с высоким сродством для небольших молекул на белках, он может с одинаковой эффективностью находить совпадения, которые связываются с субсайтами активного сайта, кофакторными сайтами или аллостерическими сайтами связывания. Этот метод обычно требует использования концентраций скринингового соединения, более чем в 10 раз превышающих желаемый порог связывания. Установка 5 мкМ в качестве разумного порога попадания, следовательно, требует концентрации тестируемого лиганда от 50 до 100 мкМ в лунке для образца. Для большинства библиотек лекарственных соединений, где многие соединения не растворяются выше ~100 мкМ, скрининг нескольких соединений, следовательно, невозможен из-за проблем с растворимостью. Термофлюорные скрининги не требуют разработки специальных реагентов для скрининга (например, расщепляемых аналогов субстрата), не требуют каких-либо радиоактивных реагентов и, как правило, менее чувствительны к воздействию соединений, которые химически реагируют с остатками активного центра белка и, следовательно, обнаруживаются. как нежелательные совпадения при проверке активности ферментов.

Оптимизация потенциальных клиентов

[ редактировать ]

Измерения T m с помощью термофлюора могут быть количественно связаны со значениями K d лекарственного средства . [ 36 ] хотя это требует дополнительных калориметрических измерений энтальпии разворачивания целевых белков, определяемой с помощью ДСК. Динамический диапазон термофлюорного анализа очень велик, так что один и тот же анализ можно использовать для обнаружения микромолярных совпадений и оптимизации субнаномолярных отведений, что делает этот метод особенно полезным при разработке соотношений QSAR для оптимизации отведений.

Исследования ферментного механизма

[ редактировать ]

Многие белки требуют одновременного или последовательного связывания нескольких субстратов, кофакторов и/или аллостерических эффекторов. Термофлюорные исследования молекул, которые связываются с субсайтами активного сайта, кофакторными сайтами или аллостерическими сайтами связывания, могут помочь выяснить конкретные особенности ферментативного механизма, которые могут быть важны при разработке эффективных кампаний по скринингу лекарств. [ 37 ] и в характеристике новых ингибирующих механизмов. [ 38 ]

Стабилизация белка для оптимизации изоляции

[ редактировать ]

Можно провести предварительный скрининг Thermofluor с отбором проб в широком диапазоне pH, ионной силы и добавок, таких как добавленные ионы металлов и кофакторы. Создание поверхности реакции белка полезно для установления оптимальных условий анализа и часто может привести к улучшению схемы очистки, необходимой для поддержки кампаний HTS и биофизических исследований. [ 18 ] [ 39 ]

Характеристика сконструированных белков

[ редактировать ]

Многие применения белковой инженерии для открытия лекарств или биофизических приложений включают модификацию аминокислотной последовательности белка посредством усечения, слияния доменов, сайт-специфических модификаций или случайного мутагенеза. Thermofluor предлагает высокопроизводительный метод оценки влияния таких вариаций последовательностей на стабильность белка, а также средства для разработки стабилизирующих условий, если это необходимо. [ 40 ] [ 41 ]

Оптимизация условий кристаллизации белков

[ редактировать ]

Хотя белки представляют собой динамические структуры в растворе, ожидается, что образованию кристаллов белка будет способствовать то, что все молекулы находятся в конформации с наименьшей энергией. Следовательно, термофлюорная оценка условий, стабилизирующих белки, является полезной стратегией для поиска оптимальных условий кристаллизации. [ 7 ] [ 42 ] [ 6 ]

Скрининг ингибиторов белок-белковых взаимодействий модуляторов конформационных изменений белков

[ редактировать ]

Поскольку термофлюор представляет собой анализ без меток, который обнаруживает связывание малых молекул с сайтами связывания с высоким сродством на целевом белке, он хорошо подходит для поиска низкомолекулярных ингибиторов белок-белковых взаимодействий или сайтов аллостерической модуляции. [ 43 ] [ 44 ] Конечно, вопрос о том, является ли белок-белковое взаимодействие в конечном итоге «лекарственным» с помощью небольшой молекулы, требует наличия подходящего сайта связывания на целевом белке, который обеспечивает достаточные локальные энергетические взаимодействия, чтобы обеспечить специфическое связывание лекарства.

ТермоФлюор мембранных белков

[ редактировать ]

Мембранные белки часто выделяют в присутствии гидрофобных солюбилизирующих агентов, которые могут распределять гидрофобно-связывающие красители, такие как 1,8-ANS и SYPRO оранжевый, и генерировать фон флуоресценции, который скрывает наблюдение сигнала плавления термофлюорного белка. Тем не менее, тщательная оптимизация условий (например, во избежание образования мицелл солюбилизирующего агента) часто может обеспечить удовлетворительные условия анализа. [ 19 ] [ 21 ]

Расшифровка белков неизвестной биологической функции

[ редактировать ]

Биохимическая функция белков-мишеней, идентифицированных с помощью методов нокаута генов или протеомики, часто неясна, если они имеют низкую гомологию аминокислотных последовательностей с белками с известной функцией. Во многих случаях некоторую полезную информацию можно получить путем идентификации связывающих кофакторов или аналогов субстрата при классификации функций белков. Информация, полезная при использовании Thermofluor, может помочь в «расшифровке» функции белков, биохимическая функция которых в противном случае могла бы быть неизвестна. [ 45 ] [ 46 ]

Параллельные анализы термического сдвига

[ редактировать ]

Недавние разработки расширили подходы термического сдвига к анализу взаимодействий лигандов в сложных смесях, включая интактные клетки. Первоначальные наблюдения за отдельными белками с использованием быстрого параллельного протеолиза (FastPP) показали, что стабилизация за счет связывания лиганда может придавать устойчивость к протеолитическому расщеплению термолизином. Защиту относительно эталона количественно оценивали либо с помощью окрашивания белков на гелях, либо с помощью вестерн-блоттинга с использованием меченого антитела, направленного на метку, слитую с целевым белком. [ 23 ] CETSA, или анализ клеточного термического сдвига, представляет собой метод, который контролирует эффект стабилизации связывания лекарственного средства посредством предотвращения необратимого осаждения белка, которое обычно инициируется, когда белок становится термически денатурированным. В CETSA аликвоты клеточного лизата временно нагреваются до разных температур, после чего образцы центрифугируются для отделения растворимых фракций от осажденных белков. Присутствие целевого белка в каждой растворимой фракции определяют вестерн-блоттингом и используют для построения кривой плавления CETSA, которая может дать информацию о нацеливании in vivo, распределении лекарственного средства и биодоступности. [ 24 ] И FastPP, и CETSA обычно требуют наличия антител для облегчения обнаружения цели и, следовательно, обычно используются в контекстах, где идентичность цели известна априори. Новые разработки направлены на объединение аспектов подходов FastPP и CETSA путем оценки лиганд-зависимой протеолитической защиты мишеней в клетках с использованием масс-спектроскопии (МС) для обнаружения сдвигов в моделях протеолиза, связанных со стабилизацией белка. [ 47 ] Существующие реализации по-прежнему требуют априорного знания ожидаемых целей для облегчения анализа данных, но улучшения в стратегиях сбора данных MS вместе с использованием улучшенных вычислительных инструментов и структур баз данных потенциально могут позволить использовать этот подход для дешифрования целей de novo в целом. масштаб клеточного протеома. Это было бы большим достижением в открытии лекарств, поскольку позволило бы идентифицировать дискретные молекулярные мишени (а также нецелевые взаимодействия) для лекарств, выявленных с помощью клеточного или фенотипического скрининга лекарств с высоким содержанием.

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Дарт М.Л., Махлейдт Т., Йост Э., Швинн М.К., Роберс М.Б., Ши С., Киркланд Т.А., Киллоран М.П., ​​Уилкинсон Дж.М., Хартнетт Дж.Р., Циммерман К., Вуд К.В. (июнь 2018 г.). «Гомогенный анализ поражения мишени с использованием биолюминесцентного термического сдвига» . Письма ACS по медицинской химии . 9 (6): 546–551. doi : 10.1021/acsmedchemlett.8b00081 . ПМК   6004564 . ПМИД   29937980 .
  2. ^ Кошланд Д.Э. (февраль 1958 г.). «Применение теории специфичности ферментов к синтезу белка» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 44 (2): 98–104. Бибкод : 1958ПНАС...44...98К . дои : 10.1073/pnas.44.2.98 . ПМЦ   335371 . ПМИД   16590179 .
  3. ^ Линдерстрем-Ланг К., Шеллман Дж. А. (1959). «Структура белка и активность ферментов». Ферменты . 1 (2): 443–510.
  4. ^ Уолдрон К.Дж., Резерфорд Дж.К., Форд Д., Робинсон, Нью-Джерси (август 2009 г.). «Металлопротеины и металлоощущение». Природа . 460 (7257): 823–30. Бибкод : 2009Natur.460..823W . дои : 10.1038/nature08300 . ПМИД   19675642 . S2CID   205217922 .
  5. ^ Сайки Р.К., Гельфанд Д.Х., Стоффель С., Шарф С.Дж., Хигучи Р., Хорн Г.Т. и др. (январь 1988 г.). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Наука . 239 (4839): 487–91. Бибкод : 1988Sci...239..487S . дои : 10.1126/science.239.4839.487 . ПМИД   2448875 .
  6. ^ Jump up to: а б Дюпе Ф., Рёвер М., Серул Г., Блот Д., Маркес Х.А. (ноябрь 2011 г.). «Анализ термической стабильности может помочь оценить вероятность кристаллизации биологических образцов» . Акта Кристаллографика. Раздел D. Биологическая кристаллография . 67 (Часть 11): 915–9. дои : 10.1107/s0907444911036225 . ПМИД   22101817 .
  7. ^ Jump up to: а б Ericsson UB, Hallberg BM, Detitta GT, Dekker N, Nordlund P (октябрь 2006 г.). «Высокопроизводительная оптимизация стабильности белков для структурных исследований на основе Thermofluor». Аналитическая биохимия . 357 (2): 289–98. дои : 10.1016/j.ab.2006.07.027 . ПМИД   16962548 .
  8. ^ Jump up to: а б Грофтехауге М.К., Гаджизаде Н.Р., Суонн М.Дж., Пол Э. (январь 2015 г.). «Взаимодействия белка и лиганда, исследованные с помощью анализа термического сдвига (TSA) и интерферометрии двойной поляризации (DPI)» . Акта Кристаллографика. Раздел D. Биологическая кристаллография . 71 (Часть 1): 36–44. дои : 10.1107/s1399004714016617 . ПМК   4304684 . ПМИД   25615858 .
  9. ^ Моро М.Дж., Морин И., Аскин С.П., Купер А., Морленд Н.Дж., Васудеван С.Г., Шеффер П.М. (2012). «Быстрое определение стабильности белков и связывания лигандов методом дифференциальной сканирующей флуориметрии белков, меченных GFP». РСК Прогресс . 2 (31): 11892–11900. Бибкод : 2012RSCAd...211892M . дои : 10.1039/c2ra22368f .
  10. ^ Аскин С., Бонд Т.Э., Соренсон А.Е., Моро М.Дж., Энтони Х., Дэвис Р.А., Шеффер П.М. (февраль 2018 г.). «Селективное разворачивание белков: универсальный механизм действия для разработки необратимых ингибиторов» . Химические коммуникации . 54 (14): 1738–1741. дои : 10.1039/c8cc00090e . hdl : 10072/379894 . ПМИД   29376540 .
  11. ^ Аскин С.П., Бонд Т.Э., Шеффер П.М. (2016). «Анализы на основе зеленого флуоресцентного белка для высокопроизводительной функциональной характеристики и исследований связывания лигандов биотинпротеинлигазы» . Аналитические методы . 8 (2): 418–424. дои : 10.1039/c5ay03064a . ISSN   1759-9660 .
  12. ^ Моро MJ, Шеффер PM (декабрь 2013 г.). «Выявление солевой зависимости комплексов белок-ДНК Tus-Ter с помощью высокопроизводительной дифференциальной сканирующей флуориметрии Tus, меченного GFP» . Молекулярные биосистемы . 9 (12): 3146–54. дои : 10.1039/c3mb70426b . ПМИД   24113739 .
  13. ^ Бонд Т.Э., Соренсон А.Е., Шеффер П.М. (декабрь 2017 г.). «Анализ на основе зеленого флуоресцентного белка для высокопроизводительных исследований связывания лигандов микобактериальной биотинпротеинлигазы» . Микробиологические исследования . 205 : 35–39. дои : 10.1016/j.micres.2017.08.014 . ПМИД   28942842 .
  14. ^ Бонд Т.Э., Соренсон А.Е., Шеффер П.М. (июнь 2017 г.). «Функциональная характеристика биотиновой протеинлигазы Burkholderia pseudomallei: набор инструментов для разработки лекарств против мелиоидоза» . Микробиологические исследования . 199 : 40–48. дои : 10.1016/j.micres.2017.03.007 . ПМИД   28454708 .
  15. ^ Семисотнов Г.В., Родионова Н.А., Разгуляев О.И., Уверский В.Н., Грипас А.Ф., Гильманшин Р.И. (январь 1991 г.). «Исследование промежуточного состояния «расплавленная глобула» при сворачивании белка с помощью гидрофобного флуоресцентного зонда». Биополимеры . 31 (1): 119–28. дои : 10.1002/bip.360310111 . ПМИД   2025683 . S2CID   36272338 .
  16. ^ Jump up to: а б Пантолиано М.В., Петрелла Э.К., Квасноски Дж.Д., Лобанов В.С., Мыслик Дж., Граф Е. и др. (декабрь 2001 г.). «Миниатюрные анализы термического сдвига высокой плотности как общая стратегия открытия лекарств» . Журнал биомолекулярного скрининга . 6 (6): 429–40. дои : 10.1177/108705710100600609 . ПМИД   11788061 .
  17. ^ Jump up to: а б Ло MC, Олаба А., Джин Дж., Коулинг Р., Бард Дж., Маламас М., Эллестад Г. (сентябрь 2004 г.). «Оценка методов термического сдвига на основе флуоресценции для выявления попаданий при открытии лекарств». Аналитическая биохимия . 332 (1): 153–9. дои : 10.1016/j.ab.2004.04.031 . ПМИД   15301960 .
  18. ^ Jump up to: а б Нисен Ф.Х., Берглунд Х., Ведади М. (2007). «Использование дифференциальной сканирующей флуориметрии для обнаружения лигандных взаимодействий, способствующих стабильности белка». Протоколы природы . 2 (9): 2212–21. дои : 10.1038/nprot.2007.321 . ПМИД   17853878 . S2CID   205463850 .
  19. ^ Jump up to: а б Кольштадт М., фон дер Хохт И., Хильберс Ф., Тильманн Ю., Мишель Х. (май 2015 г.). «Разработка анализа Thermofluor для определения стабильности мембранных белков с использованием антипортера Na (+) / H (+) NhaA и цитохром с оксидазы» (PDF) . Акта Кристаллографика. Раздел D. Биологическая кристаллография . 71 (Часть 5): 1112–22. дои : 10.1107/s1399004715004058 . ПМИД   25945577 .
  20. ^ Jump up to: а б Кранц Дж. К., Шалк-Хихи С (2011). «Термические сдвиги белков для идентификации низкомолекулярных фрагментов». Разработка лекарств на основе фрагментов — инструменты, практические подходы и примеры . Методы энзимологии. Том. 493. стр. 277–98. дои : 10.1016/B978-0-12-381274-2.00011-X . ISBN  9780123812742 . ПМИД   21371595 .
  21. ^ Jump up to: а б с Александров А.И., Милени М., Чиен Э.Ю., Хэнсон М.А., Стивенс Р.К. (март 2008 г.). «Микромасштабный флуоресцентный анализ термостабильности мембранных белков» . Структура . 16 (3): 351–9. дои : 10.1016/j.str.2008.02.004 . ПМИД   18334210 .
  22. ^ Менцен Т., Фрисс В. (февраль 2013 г.). «Высокопроизводительный анализ моноклональных антител при температуре плавления методом дифференциальной сканирующей флуориметрии в присутствии поверхностно-активных веществ». Журнал фармацевтических наук . 102 (2): 415–28. дои : 10.1002/jps.23405 . ПМИД   23212746 .
  23. ^ Jump up to: а б Минде Д.П., Морис М.М., Рюдигер С.Г. (2012). «Определение биофизической стабильности белков в лизатах с помощью анализа быстрого протеолиза, FASTpp» . ПЛОС ОДИН . 7 (10): е46147. Бибкод : 2012PLoSO...746147M . дои : 10.1371/journal.pone.0046147 . ПМЦ   3463568 . ПМИД   23056252 .
  24. ^ Jump up to: а б Мартинес Молина Д., Джафари Р., Игнатушченко М., Секи Т., Ларссон Е.А., Дэн С. и др. (июль 2013 г.). «Мониторинг взаимодействия лекарственного средства с мишенями в клетках и тканях с использованием анализа клеточного термического сдвига». Наука . 341 (6141): 84–7. Бибкод : 2013Sci...341...84M . дои : 10.1126/science.1233606 . ПМИД   23828940 . S2CID   5225262 .
  25. ^ Форнерис Ф., Орру Р., Бонивенто Д., Кьярелли Л.Р., Маттеви А. (май 2009 г.). «ThermoFAD, адаптированная к Thermofluor специальная система обнаружения флавинов для сворачивания белков и связывания лигандов» . Журнал ФЭБС . 276 (10): 2833–40. дои : 10.1111/j.1742-4658.2009.07006.x . ПМИД   19459938 .
  26. ^ Манкуссо Р., Карпович Н.К., Чижевский Б.К., Ван Д.Н. (декабрь 2011 г.). «Простой метод скрининга улучшения термостабильности мембранных белков» . Методы . 55 (4): 324–9. дои : 10.1016/j.ymeth.2011.07.008 . ПМК   3220791 . ПМИД   21840396 .
  27. ^ Чижевский Б.К., Ван Д.Н. (март 2012 г.). «Идентификация и характеристика бактериального гидросульфид-ионного канала» . Природа . 483 (7390): 494–7. Бибкод : 2012Natur.483..494C . дои : 10.1038/nature10881 . ПМЦ   3711795 . ПМИД   22407320 .
  28. ^ Манкуссо Р., Грегорио Г.Г., Лю Ц, Ван Д.Н. (ноябрь 2012 г.). «Структура и механизм бактериального натрий-зависимого переносчика дикарбоксилата» . Природа . 491 (7425): 622–6. Бибкод : 2012Natur.491..622M . дои : 10.1038/nature11542 . ПМЦ   3617922 . ПМИД   23086149 .
  29. ^ Кавате Т., Гуо Э. (апрель 2006 г.). «Флуоресцентно-эксклюзионная хроматография для прекристаллизационного скрининга интегральных мембранных белков» . Структура . 14 (4): 673–81. дои : 10.1016/j.str.2006.01.013 . ПМИД   16615909 .
  30. ^ Jump up to: а б Хаттори М., Хиббс Р.Э., Гуо Э. (август 2012 г.). «Анализ термостабильности на основе эксклюзионной хроматографии с обнаружением флуоресценции для предкристаллизационного скрининга мембранных белков» . Структура . 20 (8): 1293–9. дои : 10.1016/j.str.2012.06.009 . ПМЦ   3441139 . ПМИД   22884106 .
  31. ^ Лебон Дж., Беннетт К., Джазайери А., Тейт К.Г. (июнь 2011 г.). «Термостабилизация связанной с агонистом конформации человеческого аденозинового рецептора А (2А)» . Журнал молекулярной биологии . 409 (3): 298–310. дои : 10.1016/j.jmb.2011.03.075 . ПМК   3145977 . ПМИД   21501622 .
  32. ^ Чулли А., Абелл С. (декабрь 2007 г.). «Фрагментарные подходы к ингибированию ферментов» . Современное мнение в области биотехнологии . 18 (6): 489–96. дои : 10.1016/j.copbio.2007.09.003 . ПМЦ   4441723 . ПМИД   17959370 .
  33. ^ ДеСантис К.А., Рейнкинг Дж.Л. (2016). «Использование дифференциальной сканирующей флуориметрии для идентификации лигандов ядерных рецепторов». Суперсемейство ядерных рецепторов . Методы молекулярной биологии. Том. 1443. стр. 21–30. дои : 10.1007/978-1-4939-3724-0_3 . ISBN  978-1-4939-3722-6 . ПМИД   27246332 .
  34. ^ Бергсдорф К., Оттл Дж (ноябрь 2010 г.). «Методы скрининга на основе сходства: их влияние и преимущества для увеличения количества высококачественных потенциальных клиентов». Мнение экспертов об открытии лекарств . 5 (11): 1095–107. дои : 10.1517/17460441.2010.524641 . ПМИД   22827747 . S2CID   207493196 .
  35. ^ Каммингс, доктор медицинских наук, Фарнум, Массачусетс, Нелен М.И. (октябрь 2006 г.). «Универсальные методы скрининга и применение ThermoFluor» . Журнал биомолекулярного скрининга . 11 (7): 854–63. дои : 10.1177/1087057106292746 . ПМИД   16943390 .
  36. ^ Матулис Д., Кранц Дж.К., Салемм Ф.Р., Тодд М.Дж. (апрель 2005 г.). «Термодинамическая стабильность карбоангидразы: измерения аффинности связывания и стехиометрии с использованием ThermoFluor». Биохимия . 44 (13): 5258–66. CiteSeerX   10.1.1.321.614 . дои : 10.1021/bi048135v . ПМИД   15794662 .
  37. ^ Леа В.А., Симеонов А (апрель 2012 г.). «Признаки дифференциальной сканирующей флюорометрии как индикаторы действия ингибитора фермента: тематическое исследование глутатион S-трансферазы» . ПЛОС ОДИН . 7 (4): e36219. Бибкод : 2012PLoSO...736219L . дои : 10.1371/journal.pone.0036219 . ПМК   3340335 . ПМИД   22558390 .
  38. ^ Олд Д.С., Ловелл С., Торн Н., Леа В.А., Мэлони Дж., Шен М. и др. (март 2010 г.). «Молекулярные основы высокоаффинного связывания и стабилизации люциферазы светлячков с помощью PTC124» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 107 (11): 4878–83. Бибкод : 2010PNAS..107.4878A . дои : 10.1073/pnas.0909141107 . ПМЦ   2841876 . ПМИД   20194791 .
  39. ^ Mezzasalma TM, Kranz JK, Chan W, Struble GT, Schalk-Hihi C, Deckman IC и др. (апрель 2007 г.). «Повышение качества и выхода рекомбинантного белка за счет анализа профиля стабильности белка» . Журнал биомолекулярного скрининга . 12 (3): 418–28. дои : 10.1177/1087057106297984 . ПМИД   17438070 .
  40. ^ Неттлшип Дж. Э., Браун Дж., Гровс М.Р., Герлоф А. (2008). «Методы характеристики белков с помощью масс-спектрометрии, анализа термического сдвига (ThermoFluor) и многоуглового или статического рассеяния света». Структурная протеомика . Методы молекулярной биологии. Том. 426. стр. 299–318. дои : 10.1007/978-1-60327-058-8_19 . ISBN  978-1-58829-809-6 . ПМИД   18542872 .
  41. ^ Лавиндер Джей-Джей, Хари С.Б., Салливан Б.Дж., Мэглири Т.Дж. (март 2009 г.). «Высокопроизводительное термическое сканирование: общий метод термосдвигового скрининга с быстрым связыванием красителя для белковой инженерии» . Журнал Американского химического общества . 131 (11): 3794–5. дои : 10.1021/ja8049063 . ПМК   2701314 . ПМИД   19292479 .
  42. ^ Ведади М., Нисен Ф.Х., Аллали-Хассани А., Федоров О.Ю., Финерти П.Дж., Васни Г.А. и др. (октябрь 2006 г.). «Методы химического скрининга для идентификации лигандов, которые способствуют стабильности белков, кристаллизации белков и определению структуры» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 103 (43): 15835–40. Бибкод : 2006PNAS..10315835V . дои : 10.1073/pnas.0605224103 . ПМЦ   1595307 . ПМИД   17035505 .
  43. ^ Грасбергер Б.Л., Лу Т., Шуберт С., Паркс Дж., Карвер Т.Е., Коблиш Х.К. и др. (февраль 2005 г.). «Открытие и сокристаллическая структура бензодиазепиндионовых антагонистов HDM2, которые активируют р53 в клетках». Журнал медицинской химии . 48 (4): 909–12. дои : 10.1021/jm049137g . ПМИД   15715460 .
  44. ^ Шарвериа М., Ребул М., Ван К., Пиколи С., Ленуцца Н., Монтаньяк А. и др. (май 2009 г.). «Новые ингибиторы репликации прионов, нацеленные на предшественника амилоида» . Журнал общей вирусологии . 90 (Часть 5): 1294–1301. дои : 10.1099/vir.0.009084-0 . ПМИД   19264641 .
  45. ^ Тодд М.Дж., Каммингс, доктор медицины, Нелен М.И. (2005). «Афинные анализы для расшифровки белков-мишеней неизвестной функции». Открытие лекарств сегодня: технологии . 2 (3): 267–73. дои : 10.1016/j.ddtec.2005.08.015 . ПМИД   24981946 .
  46. ^ Карвер Т.Э., Бордо Б., Каммингс М.Д., Петрелла Э.К., Пуччи М.Дж., Завадзке Л.Е. и др. (март 2005 г.). «Расшифровка биохимической функции важного гена Streptococcus pneumoniae с использованием технологии ThermoFluor» . Журнал биологической химии . 280 (12): 11704–12. дои : 10.1074/jbc.m413278200 . ПМИД   15634672 .
  47. ^ Савицкий М.М., Рейнхард Ф.Б., Франкен Х., Вернер Т., Савицкий М.Ф., Эберхард Д. и др. (октябрь 2014 г.). «Отслеживание лекарств от рака в живых клетках путем термического профилирования протеома». Наука . 346 (6205): 1255784. doi : 10.1126/science.1255784 . hdl : 10616/42298 . ПМИД   25278616 . S2CID   206558838 .
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Thermal_shift_assay&oldid=1193556304"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: a86302243a0a94920b466e383c74854f__1704359100
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/a8/4f/a86302243a0a94920b466e383c74854f.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Thermal shift assay - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)