Иммуноанализ объемного оптоволокна
 Прототип иммуноанализа с объемным оптоволокном | |
| Акроним | СОФИЯ |
|---|---|
| Использование | Медицина, безопасность пищевых продуктов, промышленность, ветеринария |
| Известные эксперименты | Обнаружение прионов в моче и крови доклинических носителей |
| изобретатель | Лос-Аламосская национальная лаборатория и SUNY |
| Модель | Прототип |
Иммуноанализ с объемным оптоволокном ( SOFIA ) представляет собой сверхчувствительную платформу для диагностики in vitro, включающую узел объемного оптического волокна , улавливающий флуоресцентное излучение всего образца. Определяющими характеристиками этой технологии являются чрезвычайно высокий предел обнаружения , чувствительность и динамический диапазон . Чувствительность SOFIA измеряется на уровне аттограмм (10 −18 g), что делает его примерно в один миллиард раз более чувствительным, чем традиционные диагностические методы. Благодаря расширенному динамическому диапазону SOFIA способен различать уровни аналита в образце более чем на 10 порядков , что способствует точному титрованию . [ нужна ссылка ]
SOFIA как диагностическая платформа имеет широкий спектр приложений. Несколько исследований уже продемонстрировали беспрецедентную способность SOFIA обнаруживать природные прионы в крови и моче носителей заболеваний. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] Ожидается, что это приведет к созданию первого надежного прижизненного скринингового теста на vCJD , BSE , скрепи , CWD и другие трансмиссивные губчатые энцефалопатии . [ 4 ] Учитывая чрезвычайную чувствительность этой технологии, ожидаются дополнительные уникальные применения, в том числе испытания in vitro на другие нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и Паркинсона . [ 3 ]
SOFIA была разработана в результате совместного исследовательского проекта Лос-Аламосской национальной лаборатории и государственного университета Нью-Йорка и поддерживалась Министерства обороны Национальной программой исследования прионов .
Фон
[ редактировать ]Обычный метод проведения лазерно-индуцированной флуоресценции, а также других типов спектроскопических измерений, таких как инфракрасная , ультрафиолетовая-видимая спектроскопия , фосфоресценция и т. д., заключается в использовании небольшого прозрачного лабораторного сосуда, кюветы , для содержания образца в быть проанализированы. [ нужна ссылка ]
Для проведения измерения кювета наполняется исследуемой жидкостью, а затем освещается лазером, сфокусированным через одну из сторон кюветы. Линза размещается на одной из сторон кюветы, расположенной под углом 90° от входного окна, для сбора индуцированного лазером флуоресцентного света. Лишь небольшой объем кюветы фактически освещается лазером и производит заметное спектроскопическое излучение. Выходной сигнал значительно снижается, поскольку линза улавливает только около 10% спектроскопического излучения из-за соображений телесного угла. Этот метод используется уже не менее 75 лет; еще до появления лазера, когда для возбуждения флуоресценции использовались обычные источники света. [ 5 ]
SOFIA решает проблему низкой эффективности сбора, поскольку она собирает почти весь флуоресцентный свет, излучаемый анализируемым образцом, увеличивая количество сигнала флуоресценции примерно в 10 раз по сравнению с обычными приборами.
Технологические преимущества
[ редактировать ]SOFIA — это устройство и метод улучшения оптической геометрии для улучшения спектроскопического обнаружения аналитов в образце. Изобретение уже продемонстрировало свою функциональность в качестве устройства и метода сверхчувствительного обнаружения прионов и других низкоактивных аналитов. SOFIA сочетает в себе специфичность, присущую моноклональным антителам в захвате антигена, с чувствительностью технологии объемного оптического обнаружения. Для обнаружения чрезвычайно низких уровней сигнала в качестве детектора системы используется малошумящий фотоэлектрический диод. SOFIA использует лазер для освещения микрокапиллярной трубки, в которой находится образец. Затем собранный из образца свет направляется на передающую оптику из оптических волокон. Затем свет оптически фильтруется для обнаружения, которое выполняется как измерение тока, усиленное шумом с помощью синхронного усиления цифровой обработки сигнала. Результаты отображаются на компьютере и программном обеспечении, предназначенном для сбора данных. [ нужна ссылка ]
Преимущества такой матрицы обнаружения многочисленны. Прежде всего, это позволяет использовать очень маленькие образцы при низкой концентрации для оптимального исследования с использованием метода лазерно-индуцированной флуоресценции. Эта система обнаружения на основе оптоволокна адаптируется к существующему оборудованию для обнаружения коротких импульсов , которое изначально было разработано для секвенирования отдельных молекул ДНК. Геометрия также пригодна для использования в схемах короткоимпульсного лазера и обнаружения одиночных молекул. Многопортовая геометрия системы обеспечивает эффективную электронную обработку сигналов с каждого плеча устройства. Наконец, что, пожалуй, самое главное, оптоволоконные кабели практически на 100% эффективны при оптической передаче, имея затухание менее 10 дБ /км. Таким образом, после развертывания для использования на объекте информация о флуоресценции может быть передана по оптоволоконному кабелю в удаленное место, где можно выполнить обработку и анализ данных.
Компоненты СОФИИ
[ редактировать ]SOFIA включает в себя контейнер для образцов многолуночного планшета, автоматизированное средство для последовательной транспортировки образцов из контейнера для образцов многолуночного планшета в прозрачный капилляр, содержащийся внутри держателя образца, источник возбуждения, имеющий оптическую связь с образцом, при этом излучение источника возбуждения направлено вдоль длина капилляра, при этом излучение индуцирует сигнал, излучаемый образцом, и по меньшей мере одну линейную решетку. [ нужна ссылка ]
Шаги в СОФИИ
[ редактировать ]Подготовка к анализу
[ редактировать ]После амплификации и последующего концентрирования целевого аналита образцы метят флуоресцентным красителем с использованием антитела для специфичности, а затем, наконец, загружают в микрокапиллярную трубку. Эта трубка помещена в специально сконструированное устройство и полностью окружена оптическими волокнами, улавливающими весь свет, излучаемый при возбуждении красителя с помощью лазера. [ 6 ]
Обработка инструментов
[ редактировать ]Это оборудование представляет собой спектроскопический (светособирающий) прибор и соответствующий метод быстрого обнаружения и анализа аналитов в образце. Образец облучается источником возбуждения, имеющим оптическую связь с образцом. Источник возбуждения может включать в себя, помимо прочего, лазер, лампу-вспышку, дуговую лампу, светоизлучающий диод и т.п.
На рисунке 1 изображена текущая версия системы SOFIA. Четыре линейные матрицы (101) проходят от держателя проб (102), в котором находится удлиненный прозрачный контейнер для проб, открытый с обоих концов, до концевого порта (103). Дистальный конец концевого порта (104) вставлен в узел концевого порта (200). Линейные массивы (101) содержат множество оптических волокон, имеющих первый конец и второй конец, причем множество оптических волокон необязательно окружены защитной и/или изолирующей оболочкой. Оптические волокна расположены линейно, что означает, что они по существу копланарны друг другу, образуя удлиненный ряд волокон.
Приложения
[ редактировать ]Представляющий интерес аналит может иметь биологическую или химическую природу и, например, может включать только химические фрагменты (токсины, метаболиты, лекарства и остатки лекарств), пептиды , белки, клеточные компоненты, вирусы и их комбинации. Представляющий интерес аналит может находиться либо в жидкости, либо в поддерживающей среде, такой как гель.
СОФИЯ продемонстрировала свой потенциал как устройство с широким спектром применения. К ним относятся клинические применения, такие как выявление заболеваний, обнаружение предрасположенности к патологиям, установление диагноза и отслеживание эффективности назначенного лечения, а также доклинические применения, такие как предотвращение попадания токсинов и других патогенных агентов в продукты, предназначенные для потребления человеком:
- Клиническое применение – SOFIA может использоваться как для проведения качественных тестов (положительных или отрицательных результатов) для обнаружения или идентификации бактерий или вирусов, так и для количественных тестов (измерения веществ) для обнаружения или количественной оценки биологических констант или маркеров, которые представляют собой вещества, вырабатываемые организмом. при наличии, например, инфекционного заболевания (для определения вирусной нагрузки, например, при терапии СПИДа, или уровня токсичности при выявлении злоупотребления наркотиками).
- Доклинические применения. В качестве иммуноанализа SOFIA потенциально может использоваться в более широком масштабе для мониторинга качества продуктов питания, фармацевтических препаратов, косметики или воды, а также общих параметров окружающей среды и сельскохозяйственной продукции. Способность обнаруживать и проверять бактерии и токсины в широком спектре продуктов является растущей и более сложной потребностью, о чем может свидетельствовать рост заболеваемости болезнями пищевого и животного происхождения, такими как кишечная палочка, сальмонелла , ГЭКРС, птичий грипп. грипп и т. д.
Прижизненный тест на прионные заболевания
[ редактировать ]SOFIA использовалась для быстрого обнаружения аномальной формы прионного белка ( PrP наук ) в образцах биологических жидкостей, таких как кровь или моча. ПрП наук является маркерным белком, используемым в диагностике трансмиссивных губчатых энцефалопатий (TSE), примеры которых включают губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (т.е. «коровье бешенство»), скрепи у овец и болезнь Крейцфельдта-Якоба у людей. В настоящее время не существует быстрых средств прижизненного обнаружения PrP. наук в разбавленных количествах, в которых он обычно появляется в жидкостях организма. Преимущество SOFIA состоит в том, что она требует минимальной подготовки проб и позволяет размещать электронное диагностическое оборудование за пределами зоны содержания.
Фон
[ редактировать ]ТГЭ, или прионные заболевания, представляют собой инфекционные нейродегенеративные заболевания млекопитающих, которые включают губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота, хроническую истощающую болезнь оленей и лосей, скрепи у овец и болезнь Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ) у людей. ТГЭ могут передаваться от хозяина к хозяину при проглатывании инфицированных тканей или при переливании крови. Клинические симптомы ТГЭ включают потерю движений и координации, а также деменцию у людей. Инкубационный период у них составляет от нескольких месяцев до нескольких лет, но после появления клинических признаков они быстро прогрессируют, не поддаются лечению и неизменно заканчиваются летальным исходом. Попытки снизить риск ТГЭ привели к значительным изменениям в производстве и торговле сельскохозяйственной продукцией, лекарствами, косметикой, донорской кровью и тканями, а также биотехнологической продукцией. Посмертное невропатологическое исследование ткани головного мозга животного или человека остается «золотым стандартом» диагностики ТГЭ и является очень специфичным, но не таким чувствительным, как другие методы. [ 7 ]
Для повышения безопасности пищевых продуктов было бы полезно проверять всех животных на прионные заболевания с помощью прижизненного доклинического тестирования, т.е. тестирования до появления симптомов. Однако ПрП наук уровни очень низки у предсимптомных хозяев. Кроме того, ПрП наук Как правило, они неравномерно распределяются в тканях организма, при этом самые высокие концентрации постоянно обнаруживаются в тканях нервной системы, а очень низкие концентрации - в легкодоступных жидкостях организма, таких как кровь или моча. Следовательно, любой такой тест потребуется для обнаружения чрезвычайно малых количеств PrP и дифференциации PrP. С и ПрП наук .
Текущий ПрП наук методы обнаружения требуют много времени и включают посмертный анализ после того, как у подозрительных животных проявляются один или несколько симптомов заболевания. Современные методы диагностики основаны главным образом на выявлении физико-химических различий между PrP С и ПрП наук которые на сегодняшний день являются единственными надежными маркерами ТГЭ. Например, наиболее широко используемые диагностические тесты используют относительную к протеазам. устойчивость PrP наук в образцах мозга для различения PrP С и ПрП наук , в сочетании с обнаружением на основе антител PK -резистентной части PrP наук . До сих пор не удалось обнаружить прионные заболевания с помощью традиционных методов, таких как полимеразная цепная реакция, серология или анализы на клеточных культурах. Нуклеиновая кислота, специфичная для агента, еще не идентифицирована, и инфицированный хозяин не вызывает реакции антител.
Конформально измененная форма PrP С это ПрП наук . Некоторые группы считают, что ПрП наук является инфекционным агентом (прионным агентом) при ТГЭ, в то время как другие группы этого не делают. ПрП наук может быть невропатологическим продуктом болезненного процесса, компонентом инфекционного агента, самим инфекционным агентом или чем-то еще. Независимо от того, какова его фактическая функция в болезненном состоянии, PrP наук явно специфически связан с болезненным процессом, и его обнаружение указывает на заражение возбудителем, вызывающим прионные заболевания.
СОФИЯ как прижизненный тест на прионные заболевания
[ редактировать ]СОФИЯ предоставляет, среди прочего, методы диагностики прионных заболеваний путем обнаружения PrP. наук в биологических образцах. Образцами могут быть ткань головного мозга, нервная ткань, кровь, моча, лимфатическая жидкость , спинномозговая жидкость или их комбинация. Отсутствие ПрП наук указывает на отсутствие заражения инфекционным агентом до пределов обнаружения методов. Обнаружение присутствия PrP наук указывает на заражение инфекционным агентом, связанным с прионной болезнью. Заражение прионным агентом может быть обнаружено как на предсимптомной, так и на симптоматической стадии прогрессирования заболевания.
Эти и другие улучшения были достигнуты с помощью SOFIA. [ 3 ] Чувствительность и специфичность SOFIA устраняют необходимость расщепления PK для различения нормальных и аномальных изоформ PrP. Дальнейшее обнаружение PrP наук В плазме крови проблема была решена с помощью ограниченной циклической амплификации неправильного сворачивания белков (PMCA) с последующей SOFIA. Благодаря чувствительности SOFIA циклы PMCA могут быть сокращены, что снижает вероятность спонтанного PrP. наук формирование и выявление ложноположительных проб. SOFIA отвечает потребностям повышенной чувствительности при обнаружении прионных заболеваний у животных, инфицированных ТГЭ как с предсимптомной, так и с симптомами, включая людей, путем предоставления методов анализа с использованием высокочувствительного оборудования, которое требует меньше подготовки проб, чем ранее описанные методы, в сочетании с недавно разработанными Мабс против ПрП. Метод настоящей версии SOFIA обеспечивает уровни чувствительности, достаточные для обнаружения ПрП. наук в ткани мозга. В сочетании с ограниченным количеством sPMCA способы настоящего изобретения обеспечивают уровни чувствительности, достаточные для обнаружения PrP. наук в плазме крови, тканях и других жидкостях, собранных прижизненно [ нужна ссылка ] .
Эти методы сочетают в себе специфичность антител к захвату и концентрации антигена с чувствительностью технологии обнаружения по окружающему оптическому волокну. В отличие от ранее описанных методов обнаружения PrP наук в гомогенатах головного мозга эти методы, когда они используются для изучения гомогенатов головного мозга, не используют затравочную полимеризацию, амплификацию или ферментативное расщепление (например, протеиназой К или «ПК»). Это важно, поскольку в предыдущих отчетах указывалось на существование PrP. наук изоформы с различной чувствительностью к ФК, что снижает надежность анализа. Чувствительность этого анализа делает его подходящим в качестве платформы для быстрого анализа обнаружения прионов в биологических жидкостях. Помимо прионных заболеваний, этот метод может предоставить средства для быстрого и высокопроизводительного тестирования широкого спектра инфекций и расстройств.
Хотя около 40 циклов sPMCA в сочетании с иммунопреципитацией оказались недостаточными для PrP. наук обнаружение в плазме методом ИФА или вестерн-блоттинга, PrP наук также было обнаружено, что его легко измерить методами SOFIA. Ограниченное количество циклов, необходимое для существующей платформы анализа, практически исключает возможность получения связанных с PMCA ложноположительных результатов, подобных тем, о которых сообщалось ранее (Thorne and Terry, 2008). [ 8 ]
Другие клинические применения
[ редактировать ]Благодаря быстрому развитию исследований биомаркеров многие инфекции и расстройства, которые невозможно диагностировать с помощью тестирования in vitro , становятся все более возможными. Прогнозируется, что SOFIA будет иметь более широкое применение при разработке диагностических тестов на инфекции и расстройства, выходящие за рамки прионных заболеваний. [ 3 ] Основное потенциальное применение — лечение других заболеваний, связанных с неправильным сворачиванием белков, в частности болезни Альцгеймера. [ 7 ]
Опубликованные исследования
[ редактировать ]В исследовании 2011 года сообщалось об обнаружении прионов в моче естественно и перорально инфицированных овец клиническим возбудителем скрепи, а также перорально инфицированных доклинических и инфицированных белохвостых оленей с клиническим хроническим истощающим заболеванием (CWD). Это первый отчет об обнаружении прионов PrP. наук из мочи овец или оленьих, больных естественным или доклиническим заболеванием прионом. [ 1 ]
Исследование 2010 года продемонстрировало, что умеренное количество циклической амплификации неправильного сворачивания белков (PMCA) в сочетании с новой схемой обнаружения SOFIA может использоваться для обнаружения PrP. наук в необработанной протеазой плазме доклинических и клинических овец скрепи и белохвостых оленей с хронической истощающей болезнью после естественного и экспериментального заражения. Связанная с заболеванием форма прионного белка (PrP наук ), возникающий в результате конформационного изменения нормальной (клеточной) формы прионного белка (PrP С ), считается центральным в нейропатогенезе и служит единственным надежным молекулярным маркером для диагностики прионных заболеваний. В то время как самые высокие уровни PrP наук присутствуют в ЦНС, разработка разумного диагностического анализа требует использования жидкостей организма, которые обычно содержат чрезвычайно низкие уровни PrP. наук . ПрП наук был обнаружен в крови больных животных с помощью технологии PMCA. Однако сообщалось, что повторная циклическая обработка в течение нескольких дней, необходимая для PMCA материала крови, приводит к снижению специфичности (ложноположительные результаты). Чтобы создать анализ на PrP наук В крови, которая одновременно высокочувствительна и специфична, исследователи использовали ограниченное серийное исследование PMCA (sPMCA) с SOFIA. Они не обнаружили какого-либо усиления sPMCA при добавлении полиадениловой кислоты, а также не было необходимости соответствовать генотипам PrP. С и ПрП наук источники эффективного усиления. [ 2 ]
Исследование 2009 года показало, что SOFIA в своем нынешнем формате способна обнаруживать менее 10 аттограмм (акг) рекомбинантного PrP хомяка, овцы и оленя. Около 10 мкг ПрП наук в мозге хомяков, инфицированных 263K, можно обнаружить аналогичные нижние пределы PrP наук обнаружение в мозге инфицированных скрепи овец и оленей, инфицированных хронической истощающей болезнью. Эти пределы обнаружения позволяют разбавлять обработанный и необработанный протеазой материал выше точки, в которой PrP С , неспецифические белки или другие посторонние материалы могут мешать PrP наук обнаружение сигнала и/или специфичность. Это не только снимает вопрос о специфичности PrP. наук обнаружения, но и повышает чувствительность, поскольку возможность частичного PrP наук протеолиз больше не является проблемой. SOFIA, вероятно, приведет к раннему прижизненному выявлению трансмиссивных энцефалопатий, а также может использоваться с дополнительными протоколами целевой амплификации. SOFIA представляет собой чувствительный способ обнаружения специфических белков, участвующих в патогенезе и/или диагностике заболеваний, выходящих за рамки трансмиссивных губчатых энцефалопатий. [ 3 ]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Рубинштейн, Р.; и др. (сентябрь 2011 г.). «Обнаружение прионового заболевания, кинетика PMCA и IgG в моче овец, естественно/экспериментально зараженных скрепи, и оленей с доклинической/клинической хронической истощающей болезнью» . Журнал вирусологии . 85 (17): 9031–9038. дои : 10.1128/jvi.05111-11 . ПМК 3165845 . ПМИД 21715495 .
- ^ Jump up to: а б Рубинштейн, Р.; и др. (2010). «Иммуноанализ оптического волокна Prion Surround (SOFIA): сверхчувствительный анализ для обнаружения PrP» . Журнал общей вирусологии . 91 (Часть 7): 1883–1892. дои : 10.1099/vir.0.020164-0 . ПМИД 20357038 .
- ^ Jump up to: а б с д и Чанг, Б.; и др. (2009). «Иммуноанализ оптического волокна Prion Surround (SOFIA): сверхчувствительный анализ для обнаружения PrP». Журнал вирусологических методов . 159 (1): 15–22. дои : 10.1016/j.jviromet.2009.02.019 . ПМИД 19442839 .
- ^ «Национальная программа исследований прионов» (PDF) . CDRMP, Министерство обороны . Проверено 27 февраля 2012 г.
- ^ «ВОЛОКОННО-ОПТИЧЕСКАЯ СБОРКА ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИОННОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ» . Заявка на патент США 20110042585 . Проверено 19 августа 2011 г.
- ^ «Обнаружение прионов в крови» (PDF) . Микробиология сегодня. : 195. Август 2010. Архивировано из оригинала (PDF) 31 марта 2012 года . Проверено 21 августа 2011 г.
- ^ Jump up to: а б «Иммуноанализ объемного оптического волокна (SOFIA)» (PDF) . Лос-Аламосская национальная лаборатория . Проверено 19 августа 2011 г.
- ^ Брейтуэйт, SL (осень 2010 г.). «Оптимизация, адаптация и применение циклической амплификации неправильного сворачивания белков для обнаружения прионов в плазме крови» (PDF) . Департамент биологических наук Университета Альберты . Проверено 27 февраля 2012 г.
{{cite journal}}: Для цитирования журнала требуется|journal=( помощь )