Типинг (молекулярная биология)

Типинг ( индуцированные нацеливаемые локальные поражения в геномах ) является методом в молекулярной биологии , который позволяет направлять идентифицировать мутации в специфическом гене . Типинг был введен в 2000 году с использованием модельного растения Arabidopsis thaliana , и расширилась на другие использование и методологии небольшой группой ученых, включая Луку Комай . С тех пор обработка использовалась в качестве метода обратной генетики в других организмах, таких как рыбок данио , кукуруза , пшеница , рис , соя , помидоры и салат .

Обзор

Метод сочетает в себе стандартную и эффективную технику мутагенеза с использованием химического мутагена, такого как этилметаносульфонат (EMS), с чувствительной технологией скрининга ДНК, которая идентифицирует отдельные основы (также называемые точечные мутации) в ген-мишени. Метод обработки зависит от образования ДНК гетеродуплексов , которые образуются, когда несколько аллелей усиливаются с помощью ПЦР , а затем нагреваются и медленно охлаждаются. « Пузырь » образуется при несоответствии двух цепей ДНК, которые затем расщепляют одноцелевой нуклеазой . Затем продукты разделяются по размеру на нескольких разных платформах (см. Ниже).

Несоответствия могут быть связаны с индуцированной мутацией, гетерозиготностью внутри человека или естественным изменением между людьми.

Экотирование ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}^{[ 4 ]} это метод, который использует методы тишины для поиска природных мутаций у людей, обычно для анализа генетики популяции. Декотирование ^{[ 5 ]} является модификацией обработки передачи и экотирования, которая использует недорогой метод для идентификации фрагментов. С момента появления технологий секвенирования NGS , завещания ^{[ 6 ]} Был разработан на основе секвенирования Illumina генов-мишеней, амплифицированных из многомерно объединенных шаблонов, чтобы определить возможные одноклеотидные изменения.

Отдельные ферменты расщепления

Есть несколько источников для одноцепочечных нуклеасов. Первым широко используемым ферментом была нуклеаза бобов мунг , но было показано, что эта нуклеаза обладает высокой неспецифической активностью и работает только при низком pH, что может развить продукты ПЦР и маркированные красители. Первоначальный источник для одной ницевой нуклеазы был от CEL1 или CJE (экстракт сока сельдерея), но другие продукты вышли на рынок, включая ферменты Frontier Genomics Sniperase, которые были оптимизированы для использования на платформах, в которых используются меченные и немабоненные продукты ПЦР (см. Следующий раздел). Трансгром изолировал единый цепенный нуклеазный белок и продает его в качестве рекомбинантной формы. Преимущество рекомбинантной формы состоит в том, что в отличие от ферментных смесей, она не содержит не специфической активности нуклеазы, которая может развить красители на праймерах ПЦР. Недостаток является значительно более высокой стоимостью.

Разделение расщепленных продуктов

Первая статья, описывающая типинг, использовала ВЭЖХ для идентификации мутаций (McCallum et al., 2000a). Метод был сделан более высокой пропускной способностью с использованием рестрикционного фермента CEL-I в сочетании с системой на основе геля на сложности для идентификации мутаций (Colbert et al., 2001). Преимущества использования этой системы заключаются в том, что сайты мутации могут быть легко подтверждены и дифференцированы от шума. Это связано с тем, что для прямого и обратного праймеров можно использовать разные цветные красители. После того, как продукты расщепления будут запущены на геле, их можно просматривать в отдельных каналах, и, как и RFLP, размеры фрагментов в пределах полосы движения в каждом канале должны составлять на полный размер продукта. Преимуществами системы Licor являются разделение больших фрагментов (~ 2 КБ), высокая пропускная способность образца (96 образцов, загруженных на бумажные расчески) и бесплатное программное обеспечение для идентификации мутаций (Gelbuddy). Недостатки в системе Licor приходится заливать гели для плиты и длительное время (~ 4 часа). Методы обработки и экотиллирования в настоящее время используются в капиллярных системах от Advanced Analytical Technologies, Abi и Beckman.

Несколько систем могут быть использованы для разделения продуктов ПЦР, которые не помечены красителями. Простые системы электрофорез с агарозом будут разделять продукты расщепления недорого и со стандартным лабораторным оборудованием. Это было использовано для обнаружения SNP в лососе, и было названо Decotiling. Недостатком этой системы является снижение разрешения по сравнению с полиакриламидными системами. Elchrom Scientific продает гели спреда, которые являются сборными, могут быть высокой пропускной способностью и более чувствительны, чем стандартные полиакриламидные гели. Advanced Analytical Technologies Inc продает предварительную флуоресцентную систему DSDNA FS96, которая представляет собой систему капиллярного электрофореза 96, которая имеет несколько преимуществ по сравнению с традиционными методами; Включая способность разделять большие фрагменты (до 40 КБ), не требуется этап опреснения или осадков, короткие сроки пробега (~ 30 минут), чувствительность до 5pg/ul и отсутствие необходимости в флуоресцентных праймерах.

Центры обработки

В мире существует несколько центров обработки передач, которые сосредоточены на сельскохозяйственных важных видах:

Райс - UC Davis (США)
Кукуруза - Университет Пердью (США)
Brassica Napus - Университет Британской Колумбии (CA)
Brassica Rapa - John Innes Center (Великобритания)
Arabidopsis - исследования рака Фреда Хатчинсона
Соя - Университет Южного Иллинойса (США)
Lotus and Medicago - John Innes Center (Великобритания)]
Пшеница - UC Davis (США)
Горох, помидор - инра (Франция)
Томат - RTGR, Университет Хайдарабада (Индия)

Ссылки

^ Comai, L .; Янг, К.; До, bj; Рейнольдс, Ш; Грин, EA; Кодомо, Калифорния; Enns, LC; Джонсон, JE; Burtner, C.; Одден, Ар; Хеникофф С. (2004). «Эффективное открытие полиморфизмов ДНК в природных популяциях путем экотирования». Заводский журнал . 37 (5): 778–786. doi : 10.1111/j.0960-7412.2003.01999.x . PMID 14871304 .
^ Гилкрист, EJ; Haughn, gw; Ying, cc; Отто, sp; Zhuang, J.; Cheung, D.; Hamberger, B.; О тораби, ф.; Kalynyak, T.; Джонсон, Ли; Bohlmann, J.; Эллис, будь; Дуглас, CJ; Cronk, QCB (2006). «Использование Ecotiling в качестве эффективного инструмента обнаружения SNP для обследования генетических изменений в диких популяциях популяции Trichocarpa». Молекулярная экология . 15 (5): 1367–1378. Bibcode : 2006molec..15.1367G . doi : 10.1111/j.1365-294x.2006.02885.x . PMID 16626459 . S2CID 16198260 .
^ Mejlhede, N.; Kyjovska, Z.; Бэки, Г.; Бурхенн, К.; Расмуссен, SK; Jahoor, A. (2006). «ЭКОТИЛИВАНИЕ для идентификации аллельных изменений в генах устойчивости к мучнистой росе MLO и MLA ячменя» (PDF) . Разведение растений . 125 (5): 461–467. doi : 10.1111/j.1439-0523.2006.01226.x . S2CID 62901355 .
^ Ночь, c.; Piron, F.; Dalmais, M.; Рамка, CF; Morions, E.; Gomez-Guillamon, ML; Truniger, v.; Гомес, П.; Garcia-More, J.; Аранда, Массачусетс; Бандахман А. (2007). Eif4e, чтобы фактор . BMC Biology Plant 7 : Два : 34. 1914064PMC 17584936PMID
^ Гарвин, мистер; Гаррет, AJ (2007). «Deco-Tilling: недорогой метод для обнаружения одноклеотидного полиморфизма, который уменьшает смещение установления». Молекулярная экология Примечания . 7 (5): 735–746. doi : 10.1111/j.1471-8286.2007.01767.x .
^ Цай, Хелен; Хауэлл, Тайсон; Ничер, Ребекка; Миссирий, Виктор; Уотсон, Брайан; НПО, Кэти Дж.; Либерман, Мерик; Фасс, Джозеф; Uauy, Cristobal; Тран, Роберт К.; Хан, Асиф Али; Филков, Владимир; Тай, Томас Х.; Дубковский, Хорхе; Комай, Лука (2011). «Открытие редких мутаций в популяциях: обработка путем секвенирования» . Физиология растений . 156 (3): 1257–1268. doi : 10.1104/pp.110.169748 . PMC 3135940 . PMID 21531898 .

Научная литература

Колберт, т; До, bj; Томпа, R; Рейнольдс, с; Steine, Mn; Yeung, at; McCallum, CM; Comai, L ; HENIKOFF, S (Jun 2001). «Высокопроизводительный скрининг для индуцированных точечных мутаций» . Plant Physiol . 126 (2): 480–4. doi : 10.1104/pp.126.2.480 . PMC 1540114 . PMID 11402178 .
Draper, BW; McCallum, CM; Стаут, JL; Слэйд, AJ; Moens, CB (2004). «Высокопроизводительный метод для идентификации N-этил-N-нитросорои (ENU), индуцированные точечными мутациями у рыбок данио». Рыбок данио: генетика, геномика и информатика . Методы в клеточной биологии. Тол. 77. С. 91–112. doi : 10.1016/s0091-679x (04) 77005-3 . ISBN 9780125641722 Полем PMID 15602907 . {{cite book}}: |journal= игнорируется ( помощь )
McCallum, CM; Comai, L ; Грин, EA; HENIKOFF, S (апрель 2000 г.). «Целевой скрининг на индуцированные мутации». Nat Biotechnol . 18 (4): 455–7. doi : 10.1038/74542 . PMID 10748531 . S2CID 12063367 .
McCallum, CM; Comai, L ; Грин, EA; HENIKOFF, S (Jun 2000). «Нацеливание индуцированных локальных поражений в геномах (обработка) для функциональной геномики растений» . Plant Physiol . 123 (2): 439–42. doi : 10.1104/pp.123.2.439 . PMC 1539256 . PMID 10859174 .
Слэйд, AJ; Fuerstenberg, Si; Loeffler, D; Steine, Mn; Facciotti, D (январь 2005 г.). «Обратный генетический, нетрансгенный подход к улучшению урожая пшеницы путем обработки». Nat Biotechnol . 23 (1): 75–81. doi : 10.1038/nbt1043 . PMID 15580263 . S2CID 12109468 .

Внешние ссылки

[1] Comai, L .; Янг, К.; До, bj; Рейнольдс, Ш; Грин, EA; Кодомо, Калифорния; Enns, LC; Джонсон, JE; Burtner, C.; Одден, Ар; Хеникофф С. (2004). «Эффективное открытие полиморфизмов ДНК в природных популяциях путем экотирования». Заводский журнал . 37 (5): 778–786. doi : 10.1111/j.0960-7412.2003.01999.x . PMID 14871304 .

[2] Гилкрист, EJ; Haughn, gw; Ying, cc; Отто, sp; Zhuang, J.; Cheung, D.; Hamberger, B.; О тораби, ф.; Kalynyak, T.; Джонсон, Ли; Bohlmann, J.; Эллис, будь; Дуглас, CJ; Cronk, QCB (2006). «Использование Ecotiling в качестве эффективного инструмента обнаружения SNP для обследования генетических изменений в диких популяциях популяции Trichocarpa». Молекулярная экология . 15 (5): 1367–1378. Bibcode : 2006molec..15.1367G . doi : 10.1111/j.1365-294x.2006.02885.x . PMID 16626459 . S2CID 16198260 .

[3] Mejlhede, N.; Kyjovska, Z.; Бэки, Г.; Бурхенн, К.; Расмуссен, SK; Jahoor, A. (2006). «ЭКОТИЛИВАНИЕ для идентификации аллельных изменений в генах устойчивости к мучнистой росе MLO и MLA ячменя» (PDF) . Разведение растений . 125 (5): 461–467. doi : 10.1111/j.1439-0523.2006.01226.x . S2CID 62901355 .

[4] Ночь, c.; Piron, F.; Dalmais, M.; Рамка, CF; Morions, E.; Gomez-Guillamon, ML; Truniger, v.; Гомес, П.; Garcia-More, J.; Аранда, Массачусетс; Бандахман А. (2007). Eif4e, чтобы фактор . BMC Biology Plant 7 : Два : 34. 1914064PMC 17584936PMID

[5] Гарвин, мистер; Гаррет, AJ (2007). «Deco-Tilling: недорогой метод для обнаружения одноклеотидного полиморфизма, который уменьшает смещение установления». Молекулярная экология Примечания . 7 (5): 735–746. doi : 10.1111/j.1471-8286.2007.01767.x .

[6] Цай, Хелен; Хауэлл, Тайсон; Ничер, Ребекка; Миссирий, Виктор; Уотсон, Брайан; НПО, Кэти Дж.; Либерман, Мерик; Фасс, Джозеф; Uauy, Cristobal; Тран, Роберт К.; Хан, Асиф Али; Филков, Владимир; Тай, Томас Х.; Дубковский, Хорхе; Комай, Лука (2011). «Открытие редких мутаций в популяциях: обработка путем секвенирования» . Физиология растений . 156 (3): 1257–1268. doi : 10.1104/pp.110.169748 . PMC 3135940 . PMID 21531898 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]