Флуоресцентная прижизненная визуализирующая микроскопия

Флуоресцентная микроскопия с отображением времени жизни или FLIM - это метод визуализации, основанный на различиях в скорости экспоненциального затухания фотонного излучения флуорофора из образца. Его можно использовать в качестве метода визуализации в конфокальной микроскопии , микроскопии двухфотонного возбуждения и многофотонной томографии.

Для создания изображения в FLIM используется время жизни флуоресценции (FLT) флуорофора, а не его интенсивность. Время жизни флуоресценции зависит от локального микроокружения флуорофора, что исключает любые ошибочные измерения интенсивности флуоресценции из-за изменения яркости источника света, интенсивности фонового света или ограниченного фотообесцвечивания. Преимущество этого метода также заключается в минимизации эффекта рассеяния фотонов в толстых слоях образца. Поскольку измерения в течение всего срока службы зависят от микросреды, они используются в качестве индикатора pH . ^{[ 1 ]} вязкость ^{[ 2 ]} химических веществ и концентрация . ^{[ 3 ]}^{[ 4 ]}

Время жизни флуоресценции

Флуорофор , возбуждаемый , фотоном с определенной вероятностью, основанной на перейдет в основное состояние скорости распада по ряду различных путей распада (радиационного и/или безызлучательного). Чтобы наблюдать флуоресценцию, одним из этих путей должно быть спонтанное испускание фотона. В описании ансамбля излучаемая флуоресценция будет затухать со временем в соответствии с

I(t)=I_{0}e^{-t/\tau }

где

{\frac {1}{\tau }}=\sum k_{i}

.

В приведенном выше $t$ это время, $\tau$ – время жизни флуоресценции, $I_{0}$ — начальная флуоресценция при $t=0$ , и $k_{i}$ — это скорости для каждого пути затухания, по крайней мере один из которых должен быть скоростью затухания флуоресценции. $k_{f}$ . Что еще более важно, продолжительность жизни, $\tau$ не зависит от начальной интенсивности и излучаемого света. Это можно использовать для проведения измерений, не основанных на интенсивности, при химическом зондировании. ^{[ 5 ]}

Измерение

Визуализация времени жизни флуоресценции дает изображения с интенсивностью каждого пикселя, определяемой $\tau$ , который позволяет просматривать контраст между материалами с разными скоростями затухания флуоресценции (даже если эти материалы флуоресцируют точно на одной и той же длине волны), а также создает изображения, которые показывают изменения в других путях затухания, например, при визуализации FRET .

Импульсное освещение

Время жизни флуоресценции можно определить во временной области с помощью импульсного источника. Когда популяция флуорофоров возбуждается ультракоротким или дельта -импульсом света, флуоресценция с временным разрешением будет затухать экспоненциально, как описано выше. Однако если импульс возбуждения или отклик обнаружения широкий, измеренная флуоресценция d(t) не будет чисто экспоненциальной. Инструментальная функция отклика IRF(t) будет свернута или смешана с функцией затухания F(t).

${d}(t)={IRF}(t)\otimes {F}(t)$

Инструментальный отклик источника, детектора и электроники можно измерить, как правило, по рассеянному возбуждающему свету. Восстановление функции затухания (и соответствующих времен жизни) создает дополнительные проблемы, поскольку деление в частотной области имеет тенденцию производить высокий шум, когда знаменатель близок к нулю.

ТЦСПЦ

Обычно используется коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов ( TCSPC ), поскольку он компенсирует изменения интенсивности источника и амплитуды одиночных фотонных импульсов. Используя коммерческое оборудование TCSPC, можно записать кривую затухания флуоресценции с временным разрешением до 405 фс. ^{[ нужна ссылка ]} ^{[ 6 ]} Записанная гистограмма затухания флуоресценции подчиняется статистике Пуассона , которая учитывается при определении степени соответствия во время аппроксимации. Более конкретно, TCSPC записывает время, в которое отдельные фотоны обнаруживаются быстрым однофотонным детектором (обычно фотоумножителем ( ФЭУ ) или однофотонным лавинным фотодиодом (SPAD)) относительно возбуждающего лазерного импульса. Записи повторяются для нескольких лазерных импульсов, и после достаточного количества записанных событий можно построить гистограмму количества событий во всех этих записанных моментах времени. Затем эту гистограмму можно подогнать к экспоненциальной функции, которая содержит интересующую функцию экспоненциального затухания срока службы, и соответственно можно извлечь параметр срока службы. Многоканальные системы ФЭУ с 16 ^{[ 7 ]} до 64 элементов были коммерчески доступны, тогда как недавно продемонстрированные системы КМОП с однофотонными лавинными диодами (SPAD)-TCSPC FLIM могут предложить еще большее количество каналов обнаружения и дополнительные недорогие опции. ^{[ 8 ]}

Метод стробирования

В этом методе до сих пор используется импульсное возбуждение. Прежде чем импульс достигнет образца, часть света отражается дихроичным зеркалом и обнаруживается фотодиодом, который активирует генератор задержки, управляющий стробируемым оптическим усилителем (ГОИ), который расположен перед ПЗС-детектором. GOI допускает обнаружение только в течение той части времени, когда он открыт после задержки. Таким образом, с помощью регулируемого генератора задержки можно собирать излучение флуоресценции после нескольких времен задержки, охватывающих временной диапазон затухания флуоресценции образца. ^{[ 9 ]}^{[ 10 ]} В последние годы на рынок вышли интегрированные ПЗС-камеры с усиленной матрицей. Эти камеры состоят из усилителя изображения, ПЗС-сенсора и встроенного генератора задержки. Камеры ICCD с кратчайшим временем стробирования до 200 пс и шагом задержки 10 пс позволяют использовать FLIM с субнаносекундным разрешением. В сочетании с эндоскопом этот метод используется для интраоперационной диагностики опухолей головного мозга. ^{[ 11 ]}

Фазовая модуляция

Время жизни флуоресценции можно определить в частотной области методом фазовой модуляции. В этом методе используется источник света, который является импульсным или модулированным на высокой частоте (до 500 МГц), например светодиод, диодный лазер или источник непрерывного излучения в сочетании с электрооптическим модулятором или акустооптическим модулятором . Флуоресценция (а) демодулирована и (б) сдвинута по фазе; обе величины связаны с характерными временами затухания флуорофора. Кроме того, будут модулироваться y-компоненты синусоидальных волн возбуждения и флуоресценции, а срок службы можно определить по коэффициенту модуляции этих y-компонентов. Следовательно, два значения срока службы можно определить методом фазовой модуляции. Времена жизни определяются посредством процедур подгонки этих экспериментальных параметров. Преимуществом FLIM на основе ФЭУ или камеры является быстрое получение изображений за весь срок службы, что делает его пригодным для таких приложений, как исследование живых клеток. ^{[ 12 ]}

Анализ

Цель алгоритма анализа — извлечь кривую чистого затухания из измеренного затухания и оценить время жизни(й). Последнее обычно достигается путем подбора одной или нескольких экспоненциальных функций. Для решения этой проблемы были разработаны различные методы. Наиболее широко используемым методом является итеративная повторная свертка методом наименьших квадратов, основанная на минимизации взвешенной суммы остатков. В этом методе теоретические кривые экспоненциального затухания свернуты с функцией отклика прибора, которая измеряется отдельно, и наилучшее соответствие находится путем итеративного расчета остатков для различных входных данных до тех пор, пока не будет найден минимум. Для совокупности наблюдений $d({{t}_{i}})$ сигнала флуоресценции во временном интервале i оценка времени жизни осуществляется путем минимизации:

${{\chi }^{2}}=\sum \limits _{i}{{\left[{{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau )\right]}^{2}}$

Помимо экспериментальных трудностей, включая функцию отклика прибора, зависящую от длины волны, математическая обработка проблемы итеративной деконволюции непроста и представляет собой медленный процесс, который на заре FLIM делал непрактичным попиксельный анализ. Неподходящие методы привлекательны, поскольку они предлагают очень быстрое решение для оценки срока службы. Одним из основных и простых методов в этой категории является метод быстрого определения срока службы (RLD). RLD рассчитывает времена жизни и их амплитуды напрямую, разделяя кривую затухания на две части одинаковой ширины. $\delta$ т. е. Анализ проводится путем интегрирования кривой затухания через равные промежутки времени. $\delta$ т:

${\begin{matrix}{{D}_{0}}=\sum \limits _{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t}&{{D}_{1}}=\sum \limits _{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t}\\\end{matrix}}$

Ii — записанный сигнал в i-м канале, а K — количество каналов. Срок службы можно оценить, используя:

$\tau =\delta t/\ln({{D}_{0}}/{{D}_{1}})$

Для многоэкспоненциального распада это уравнение дает среднее время жизни. Этот метод можно расширить для анализа биэкспоненциального затухания. Одним из основных недостатков этого метода является то, что он не может принять во внимание эффект отклика прибора, и по этой причине при анализе следует игнорировать раннюю часть измеренных кривых затухания. Это означает, что часть сигнала отбрасывается и точность оценки малых времен жизни снижается.

Одной из интересных особенностей теоремы о свертке является то, что интеграл от свертки является произведением факторов, составляющих интеграл. Существует несколько методов, работающих в преобразованном пространстве и использующих это свойство для восстановления чистой кривой затухания по измеренной кривой. Преобразования Лапласа и Фурье, а также расширение Гаусса Лагерра использовались для оценки времени жизни в преобразованном пространстве. Эти подходы работают быстрее, чем методы, основанные на деконволюции, но они страдают от проблем усечения и выборки. Более того, применение таких методов, как разложение Лагерра по Гауссу, математически сложно. В методах Фурье время жизни одной кривой экспоненциального затухания определяется выражением:

$\tau ={\frac {1}{n\omega }}{\frac {{A}_{n}}{{B}_{n}}}$

Где:

${\begin{matrix}{{A}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\sin(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF(t)\sin(n\omega t)}}}={\frac {\omega \tau }{1+{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&{{B}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\cos(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF\cos(n\omega t)}}}={\frac {1}{1+n{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&\omega ={\frac {2\pi }{T}}\\\end{matrix}}$

n — номер гармоники, а T — общий временной диапазон обнаружения.

Приложения

FLIM в основном использовался в биологии как метод обнаружения фотосенсибилизаторов в клетках и опухолях, а также FRET в тех случаях, когда логометрическая визуализация затруднена. Этот метод был разработан в конце 1980-х и начале 1990-х годов (метод Gating: Bugiel et al. 1989. König 1989, ^{[ 13 ]} Фазовая модуляция: Лакович и др. 1992, ^{[ 14 ]}^{[ 15 ]}), прежде чем он получил более широкое применение в конце 1990-х годов. В клеточной культуре его использовали для изучения рецептора EGF. передачи сигналов ^{[ 16 ]} и торговля людьми. ^{[ 17 ]} FLIM во временной области (tdFLIM) также использовался, чтобы показать взаимодействие обоих типов белков ядерных промежуточных филаментов, ламинов A и B1, в различных гомополимерах ядерной оболочки, которые в дальнейшем взаимодействуют друг с другом в структурах более высокого порядка. ^{[ 18 ]} Визуализация FLIM особенно полезна для нейронов, где рассеяние света тканями головного мозга проблематично для логометрической визуализации. ^{[ 19 ]} использовалась визуализация FLIM с использованием импульсного освещения В нейронах для изучения Ras . ^{[ 20 ]} CaMKII , Рак и Ран ^{[ 21 ]} семейные белки. FLIM использовался в клинической многофотонной томографии для обнаружения внутрикожных раковых клеток, а также фармацевтических и косметических соединений.

Совсем недавно FLIM также использовался для обнаружения флаванолов в растительных клетках. ^{[ 22 ]}

Автофлуоресцентные коферменты НАД(Ф)Н и ФАД

Многофотонный FLIM все чаще используется для обнаружения автофлуоресценции коферментов в качестве маркеров изменений метаболизма млекопитающих. ^{[ 23 ]}^{[ 24 ]}

FRET-изображение

Поскольку время жизни флуоресценции флуорофора зависит как от излучательных (т.е. флуоресценции), так и от нерадиационных (т.е. тушения, FRET) процессов, передача энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору уменьшит время жизни донора. Таким образом, измерения FRET с использованием FLIM могут обеспечить метод различения состояний/окружения флуорофора. ^{[ 25 ]} В отличие от измерений FRET на основе интенсивности, измерения FRET на основе FLIM также нечувствительны к концентрации флуорофоров и, таким образом, могут отфильтровывать артефакты, возникающие из-за изменений концентрации и интенсивности излучения в образце.

См. также

Фазорный подход к времени жизни флуоресценции и спектральной визуализации

Ссылки

^ Накабаяси, Такакадзу; Ван, Хуэй-Пин; Киндзё, Масатака; Охта, Нобухиро (4 июня 2008 г.). «Применение изображения времени жизни флуоресценции усиленного зеленого флуоресцентного белка для измерения внутриклеточного pH» . Фотохимические и фотобиологические науки . 7 (6): 668–670. дои : 10.1039/B800391B . ISSN 1474-9092 . ПМИД 18528549 . S2CID 42881416 .
^ Левитт, Джеймс А.; Куимова Марина К.; Яхиоглу, Гекхан; Чунг, Пей-Хуа; Сулинг, Клаус; Филлипс, Дэвид (9 июля 2009 г.). «Мембранные молекулярные роторы измеряют вязкость в живых клетках с помощью флуоресцентной визуализации в течение всего времени жизни» . Журнал физической химии C. 113 (27): 11634–11642. дои : 10.1021/jp9013493 . hdl : 10044/1/15590 . ISSN 1932-7447 . S2CID 96097931 .
^ Руэдас-Рама, Мария Дж.; Орте, Ангел; Холл, Элизабет АХ; Альварес-Пес, Хосе М.; Талавера, Ева М. (20 февраля 2012 г.). «Наносенсор ионов хлорида для флуориметрии с временным разрешением и визуализации времени жизни флуоресценции» . Аналитик . 137 (6): 1500–1508. Бибкод : 2012Ана...137.1500Р . дои : 10.1039/C2AN15851E . ISSN 1364-5528 . ПМИД 22324050 . ^{[ постоянная мертвая ссылка ]}
^ Агронская Александра Владимировна; Тертулен, Л.; Герритсен, Ханс К. (ноябрь 2004 г.). «Быстрая флуоресцентная визуализация кальция в живых клетках» . Журнал биомедицинской оптики . 9 (6): 1230–1237. Бибкод : 2004JBO.....9.1230A . дои : 10.1117/1.1806472 . ISSN 1083-3668 . ПМИД 15568944 .
^ Джозеф Р. Лакович. Принципы флуоресцентной спектроскопии, 3-е издание. Спрингер (2006). ISBN 978-0387-31278-1 . ^{[ нужна страница ]}
^ «SPC-150NX, Описание продукта» . Беккер и Хикл . Беккер и Хикл ГмбХ. 26 апреля 2017 года . Проверено 26 апреля 2017 г.
^ «ПМЛ-16, Описание изделия» . Беккер и Хикл . Беккер и Хикл ГмбХ. 26 апреля 2017. Архивировано из оригинала 3 марта 2018 года . Проверено 26 апреля 2017 г.
^ Ли, Дай-Уэй; Арльт, Йохен; Ричардсон, Джастин; Уокер, Ричард; Бутс, Алекс; Стоппа, Дэвид; Чарбон, Эдоардо; Хендерсон, Роберт (2010). «Система визуализации срока службы флуоресценции в реальном времени с матрицей однофотонных лавинных диодов КМОП размером 32 × 32 0,13 мкм с малым темновым счетом» . Оптика Экспресс . 18 (10): 10257–69. Бибкод : 2010OExpr..1810257L . дои : 10.1364/OE.18.010257 . ПМИД 20588879 .
^ Чанг, CW; Суд, Д; Мычек, Массачусетс (2007). «Флуоресцентная микроскопия прижизненной визуализации» . Цифровая микроскопия, 3-е издание . Методы клеточной биологии. Том. 81. С. 495–524 . дои : 10.1016/S0091-679X(06)81024-1 . ISBN 9780123740250 . ПМИД 17519182 .
^ Элсон, Д.С.; Манро, я; Рекехо-Исидро, Дж; МакГинти, Дж; Дансби, К; Галлетли, Н; Штамп, ГВ; Нил, МАА; Левер, MJ; Келлетт, Пенсильвания; Даймок-Брэдшоу, А; Харес, Дж; Французский, PMW (2004). «Визуализация флуоресценции во временной области в режиме реального времени, включая однократное получение изображений с помощью сегментированного оптического усилителя изображения» . Новый журнал физики . 6 (1): 180. Бибкод : 2004NJPh....6..180E . дои : 10.1088/1367-2630/6/1/180 . hdl : 10044/1/578 .
^ Сунь, Инхуа; Хатами, Ниса; Да, Мэтью; Марку, Дженнифер; Элсон, Дэниел С.; Горин, Фредрик; Шрот, Рудольф Дж.; Фиппс, Лаура (2010). «Флуоресцентная прижизненная визуализирующая микроскопия для хирургии опухолей головного мозга под визуальным контролем» (PDF) . Журнал биомедицинской оптики . 15 (5): 056022–056022–5. Бибкод : 2010JBO....15e6022S . дои : 10.1117/1.3486612 . ПМЦ 2966493 . ПМИД 21054116 .
^ Гаделла, Теодор WJ (29 июля 2011 г.). Техники FRET и FLIM . Эльзевир. ISBN 978-0-08-091512-8 .
^ Оида, Т.; Сако, Ю; Кусуми, А (1993). «Флуоресцентная прижизненная визуализационная микроскопия (флимскопия). Разработка методологии и применение к исследованию слияния эндосом в одиночных клетках» . Биофизический журнал . 64 (3): 676–85. Бибкод : 1993BpJ....64..676O . дои : 10.1016/S0006-3495(93)81427-9 . ПМЦ 1262380 . ПМИД 8471720 .
^ Лакович, Джозеф Р.; Шмацинский, Хенрик; Новачик, Казимеж; Берндт, Клаус В.; Джонсон, Майкл (1992). «Визуализация времени жизни флуоресценции» . Аналитическая биохимия . 202 (2): 316–30. дои : 10.1016/0003-2697(92)90112-К . ПМК 6986422 . ПМИД 1519759 .
^ Лакович, Джозеф Р.; Шмачинский, Х; Новачик, К; Джонсон, МЛ (1992). «Прижизненная флуоресцентная визуализация свободного и связанного с белком НАДН» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (4): 1271–5. Бибкод : 1992PNAS...89.1271L . дои : 10.1073/pnas.89.4.1271 . ПМК 48431 . ПМИД 1741380 .
^ Воутерс, Фред С.; Бастианс, Филипп IH (1999). «Визуализация времени жизни флуоресценции активности рецепторной тирозинкиназы в клетках» . Современная биология . 9 (19): 1127–30. дои : 10.1016/S0960-9822(99)80484-9 . ПМИД 10531012 . S2CID 7640970 .
^ Вервир, Питер Дж.; Воутерс, Ф.С.; Рейнольдс, Арканзас; Бастиенс, ИП (2000). «Количественная визуализация распространения сигнала латерального рецептора ErbB1 в плазматической мембране». Наука . 290 (5496): 1567–70. Бибкод : 2000Sci...290.1567V . дои : 10.1126/science.290.5496.1567 . ПМИД 11090353 .
^ Дельбарре, Эрван; Трамье, Марк; Коппи-Мойсан, Майте; Гайяр, Клэр; Курвален, Жан-Клод; Буэндиа, Бриджит (2006). «Укороченный преламин А при синдроме прогерии Хатчинсона-Гилфорда изменяет сегрегацию гомополимеров ламинов A-типа и B-типа» (PDF) . Молекулярная генетика человека . 15 (7): 1113–1122. дои : 10.1093/hmg/ddl026 . ПМИД 16481358 .
^ Ясуда, Рёхей (2006). «Визуализация пространственно-временной динамики передачи сигналов нейронов с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и микроскопии времени жизни флуоресценции». Современное мнение в нейробиологии . 16 (5): 551–61. дои : 10.1016/j.conb.2006.08.012 . ПМИД 16971112 . S2CID 54398436 .
^ Харви, Кристофер Д.; Ясуда, Р; Чжун, Х; Свобода, К (2008). «Распространение активности Ras, вызванное активацией одного дендритного шипа» . Наука . 321 (5885): 136–40. Бибкод : 2008Sci...321..136H . дои : 10.1126/science.1159675 . ПМЦ 2745709 . ПМИД 18556515 .
^ Калаб, Петр; Содерхольм, Джон (2010). «Разработка молекулярных сенсоров на основе Фёрстера (флуоресценции) резонансного переноса энергии (FRET) для Ran GTPase» . Методы . 51 (2): 220–32. дои : 10.1016/j.ymeth.2010.01.022 . ПМК 2884063 . ПМИД 20096786 .
^ Мюллер-Харви, Ирен; Фейхт, Вальтер; Польстер, Юрген; Трнкова, Люси; Бургос, Пьер; Паркер, Энтони В.; Ботчуэй, Стэнли В. (2012). «Двухфотонное возбуждение с пикосекундной визуализацией времени жизни флуоресценции для обнаружения ядерной ассоциации флаванолов» . Аналитика Химика Акта . 719 : 68–75. дои : 10.1016/j.aca.2011.12.068 . ПМИД 22340533 . S2CID 24094780 .
^ Датта, Рупса; Альфонсо-Гарсия, Альба; Синко, Рэйчел; Граттон, Энрико (20 мая 2015 г.). «Визуализация времени жизни флуоресценции эндогенного биомаркера окислительного стресса» . Научные отчеты . 5 (1): 9848. doi : 10.1038/srep09848 . ISSN 2045-2322 . ПМЦ 4438616 . ПМИД 25993434 .
^ Цао, Руофан; Вальрабе, Хорст; Силлер, Карстен; Периасами, Аммаси (05 февраля 2020 г.). «Оптимизация визуализации FLIM, подгонка и анализ автофлуоресцентных НАД(Ф)Н и ФАД в клетках и тканях» . Методы и приложения во флуоресценции . 8 (2): 024001. Бибкод : 2020MApFl...8b4001C . дои : 10.1088/2050-6120/ab6f25 . ISSN 2050-6120 . ПМИД 31972557 . S2CID 210883495 .
^ Беккер, Вольфганг; Бергманн, Аксель (2003). «Пожизненные методы визуализации для оптической микроскопии» (PDF) . п. 4.

Внешние ссылки

Пожизненная флуоресцентная визуализация в возбужденном состоянии
Инструменты анализа срока службы и спектрального анализа в ImageJ: http://spechron.com. Архивировано 11 марта 2013 г. на Wayback Machine.
Флуоресцентная микроскопия с прижизненной визуализацией
Принцип TCSPC FLIM (Becker&Hickl GmbH)

[1] Накабаяси, Такакадзу; Ван, Хуэй-Пин; Киндзё, Масатака; Охта, Нобухиро (4 июня 2008 г.). «Применение изображения времени жизни флуоресценции усиленного зеленого флуоресцентного белка для измерения внутриклеточного pH» . Фотохимические и фотобиологические науки . 7 (6): 668–670. дои : 10.1039/B800391B . ISSN 1474-9092 . ПМИД 18528549 . S2CID 42881416 .

[2] Левитт, Джеймс А.; Куимова Марина К.; Яхиоглу, Гекхан; Чунг, Пей-Хуа; Сулинг, Клаус; Филлипс, Дэвид (9 июля 2009 г.). «Мембранные молекулярные роторы измеряют вязкость в живых клетках с помощью флуоресцентной визуализации в течение всего времени жизни» . Журнал физической химии C. 113 (27): 11634–11642. дои : 10.1021/jp9013493 . hdl : 10044/1/15590 . ISSN 1932-7447 . S2CID 96097931 .

[3] Руэдас-Рама, Мария Дж.; Орте, Ангел; Холл, Элизабет АХ; Альварес-Пес, Хосе М.; Талавера, Ева М. (20 февраля 2012 г.). «Наносенсор ионов хлорида для флуориметрии с временным разрешением и визуализации времени жизни флуоресценции» . Аналитик . 137 (6): 1500–1508. Бибкод : 2012Ана...137.1500Р . дои : 10.1039/C2AN15851E . ISSN 1364-5528 . ПМИД 22324050 . ^{[ постоянная мертвая ссылка ]}

[4] Агронская Александра Владимировна; Тертулен, Л.; Герритсен, Ханс К. (ноябрь 2004 г.). «Быстрая флуоресцентная визуализация кальция в живых клетках» . Журнал биомедицинской оптики . 9 (6): 1230–1237. Бибкод : 2004JBO.....9.1230A . дои : 10.1117/1.1806472 . ISSN 1083-3668 . ПМИД 15568944 .

[5] Джозеф Р. Лакович. Принципы флуоресцентной спектроскопии, 3-е издание. Спрингер (2006). ISBN 978-0387-31278-1 . ^{[ нужна страница ]}

[6] «SPC-150NX, Описание продукта» . Беккер и Хикл . Беккер и Хикл ГмбХ. 26 апреля 2017 года . Проверено 26 апреля 2017 г.

[7] «ПМЛ-16, Описание изделия» . Беккер и Хикл . Беккер и Хикл ГмбХ. 26 апреля 2017. Архивировано из оригинала 3 марта 2018 года . Проверено 26 апреля 2017 г.

[8] Ли, Дай-Уэй; Арльт, Йохен; Ричардсон, Джастин; Уокер, Ричард; Бутс, Алекс; Стоппа, Дэвид; Чарбон, Эдоардо; Хендерсон, Роберт (2010). «Система визуализации срока службы флуоресценции в реальном времени с матрицей однофотонных лавинных диодов КМОП размером 32 × 32 0,13 мкм с малым темновым счетом» . Оптика Экспресс . 18 (10): 10257–69. Бибкод : 2010OExpr..1810257L . дои : 10.1364/OE.18.010257 . ПМИД 20588879 .

[9] Чанг, CW; Суд, Д; Мычек, Массачусетс (2007). «Флуоресцентная микроскопия прижизненной визуализации» . Цифровая микроскопия, 3-е издание . Методы клеточной биологии. Том. 81. С. 495–524 . дои : 10.1016/S0091-679X(06)81024-1 . ISBN 9780123740250 . ПМИД 17519182 .

[10] Элсон, Д.С.; Манро, я; Рекехо-Исидро, Дж; МакГинти, Дж; Дансби, К; Галлетли, Н; Штамп, ГВ; Нил, МАА; Левер, MJ; Келлетт, Пенсильвания; Даймок-Брэдшоу, А; Харес, Дж; Французский, PMW (2004). «Визуализация флуоресценции во временной области в режиме реального времени, включая однократное получение изображений с помощью сегментированного оптического усилителя изображения» . Новый журнал физики . 6 (1): 180. Бибкод : 2004NJPh....6..180E . дои : 10.1088/1367-2630/6/1/180 . hdl : 10044/1/578 .

[11] Сунь, Инхуа; Хатами, Ниса; Да, Мэтью; Марку, Дженнифер; Элсон, Дэниел С.; Горин, Фредрик; Шрот, Рудольф Дж.; Фиппс, Лаура (2010). «Флуоресцентная прижизненная визуализирующая микроскопия для хирургии опухолей головного мозга под визуальным контролем» (PDF) . Журнал биомедицинской оптики . 15 (5): 056022–056022–5. Бибкод : 2010JBO....15e6022S . дои : 10.1117/1.3486612 . ПМЦ 2966493 . ПМИД 21054116 .

[12] Гаделла, Теодор WJ (29 июля 2011 г.). Техники FRET и FLIM . Эльзевир. ISBN 978-0-08-091512-8 .

[13] Оида, Т.; Сако, Ю; Кусуми, А (1993). «Флуоресцентная прижизненная визуализационная микроскопия (флимскопия). Разработка методологии и применение к исследованию слияния эндосом в одиночных клетках» . Биофизический журнал . 64 (3): 676–85. Бибкод : 1993BpJ....64..676O . дои : 10.1016/S0006-3495(93)81427-9 . ПМЦ 1262380 . ПМИД 8471720 .

[14] Лакович, Джозеф Р.; Шмацинский, Хенрик; Новачик, Казимеж; Берндт, Клаус В.; Джонсон, Майкл (1992). «Визуализация времени жизни флуоресценции» . Аналитическая биохимия . 202 (2): 316–30. дои : 10.1016/0003-2697(92)90112-К . ПМК 6986422 . ПМИД 1519759 .

[15] Лакович, Джозеф Р.; Шмачинский, Х; Новачик, К; Джонсон, МЛ (1992). «Прижизненная флуоресцентная визуализация свободного и связанного с белком НАДН» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (4): 1271–5. Бибкод : 1992PNAS...89.1271L . дои : 10.1073/pnas.89.4.1271 . ПМК 48431 . ПМИД 1741380 .

[16] Воутерс, Фред С.; Бастианс, Филипп IH (1999). «Визуализация времени жизни флуоресценции активности рецепторной тирозинкиназы в клетках» . Современная биология . 9 (19): 1127–30. дои : 10.1016/S0960-9822(99)80484-9 . ПМИД 10531012 . S2CID 7640970 .

[17] Вервир, Питер Дж.; Воутерс, Ф.С.; Рейнольдс, Арканзас; Бастиенс, ИП (2000). «Количественная визуализация распространения сигнала латерального рецептора ErbB1 в плазматической мембране». Наука . 290 (5496): 1567–70. Бибкод : 2000Sci...290.1567V . дои : 10.1126/science.290.5496.1567 . ПМИД 11090353 .

[18] Дельбарре, Эрван; Трамье, Марк; Коппи-Мойсан, Майте; Гайяр, Клэр; Курвален, Жан-Клод; Буэндиа, Бриджит (2006). «Укороченный преламин А при синдроме прогерии Хатчинсона-Гилфорда изменяет сегрегацию гомополимеров ламинов A-типа и B-типа» (PDF) . Молекулярная генетика человека . 15 (7): 1113–1122. дои : 10.1093/hmg/ddl026 . ПМИД 16481358 .

[19] Ясуда, Рёхей (2006). «Визуализация пространственно-временной динамики передачи сигналов нейронов с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и микроскопии времени жизни флуоресценции». Современное мнение в нейробиологии . 16 (5): 551–61. дои : 10.1016/j.conb.2006.08.012 . ПМИД 16971112 . S2CID 54398436 .

[20] Харви, Кристофер Д.; Ясуда, Р; Чжун, Х; Свобода, К (2008). «Распространение активности Ras, вызванное активацией одного дендритного шипа» . Наука . 321 (5885): 136–40. Бибкод : 2008Sci...321..136H . дои : 10.1126/science.1159675 . ПМЦ 2745709 . ПМИД 18556515 .

[21] Калаб, Петр; Содерхольм, Джон (2010). «Разработка молекулярных сенсоров на основе Фёрстера (флуоресценции) резонансного переноса энергии (FRET) для Ran GTPase» . Методы . 51 (2): 220–32. дои : 10.1016/j.ymeth.2010.01.022 . ПМК 2884063 . ПМИД 20096786 .

[22] Мюллер-Харви, Ирен; Фейхт, Вальтер; Польстер, Юрген; Трнкова, Люси; Бургос, Пьер; Паркер, Энтони В.; Ботчуэй, Стэнли В. (2012). «Двухфотонное возбуждение с пикосекундной визуализацией времени жизни флуоресценции для обнаружения ядерной ассоциации флаванолов» . Аналитика Химика Акта . 719 : 68–75. дои : 10.1016/j.aca.2011.12.068 . ПМИД 22340533 . S2CID 24094780 .

[23] Датта, Рупса; Альфонсо-Гарсия, Альба; Синко, Рэйчел; Граттон, Энрико (20 мая 2015 г.). «Визуализация времени жизни флуоресценции эндогенного биомаркера окислительного стресса» . Научные отчеты . 5 (1): 9848. doi : 10.1038/srep09848 . ISSN 2045-2322 . ПМЦ 4438616 . ПМИД 25993434 .

[24] Цао, Руофан; Вальрабе, Хорст; Силлер, Карстен; Периасами, Аммаси (05 февраля 2020 г.). «Оптимизация визуализации FLIM, подгонка и анализ автофлуоресцентных НАД(Ф)Н и ФАД в клетках и тканях» . Методы и приложения во флуоресценции . 8 (2): 024001. Бибкод : 2020MApFl...8b4001C . дои : 10.1088/2050-6120/ab6f25 . ISSN 2050-6120 . ПМИД 31972557 . S2CID 210883495 .

[25] Беккер, Вольфганг; Бергманн, Аксель (2003). «Пожизненные методы визуализации для оптической микроскопии» (PDF) . п. 4.

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]

[ 21 ]

[ 22 ]

[ 23 ]

[ 24 ]

[ 25 ]