Митопласт
Митопласт митохондрия – это , лишенная внешней мембраны, оставляющая внутреннюю мембрану и матрикс нетронутыми. [1]
Как чаще всего создаются митопласты
[ редактировать ]Чтобы начать этот процесс, митохондрии сначала необходимо отделить от культивируемых клеток . Обычно это двухэтапный процесс, в котором используется гомогенизация для высвобождения межклеточного содержимого и дифференциальное центрифугирование для отделения митохондрий от других органелл . После выделения митохондрий могут образовываться митопласты. Митопласты чаще всего формируются с использованием аппарата, называемого френч-прессом . Когда митохондрии проходят через узкий клапан френч-пресса, они испытывают чрезвычайно высокое давление (около 2000 фунтов на квадратный дюйм), которое разрывает внешнюю митохондриальную мембрану. Затем митопласты осаждаются и хранятся в специальном буфере для хранения до использования. Когда митопласты необходимы, их просто помещают в инкубационный буфер с хлоридом калия (KCl), который вызывает набухание митохондриального матрикса. В результате набухания внутренняя мембрана будет выступать из внешней, образуя одну из двух различных форм. [2] Митопласты, полученные методом френч-пресса, обычно образуют двулопастные везикулы, имеющие форму, похожую на цифру 8. [3] Эти митопласты в форме восьмерки являются предпочтительными, поскольку они считаются самыми здоровыми. Однако могут образовываться и митопласты О-образной формы, но этот тип не является предпочтительным для экспериментального использования, поскольку они часто повреждаются.
История создания митопластов
[ редактировать ]Научное понимание митохондрий значительно выросло с 1930-х годов благодаря развитию электронного микроскопа . К началу 1950-х годов ученым удалось установить, что митохондрии имеют две отдельные мембраны. Однако, поскольку исследования митохондрий были в первую очередь сосредоточены на цепи переноса электронов и окислительном фосфорилировании , только более десяти лет спустя были разработаны методы отделения двух митохондриальных мембран друг от друга.
В середине-конце 1960-х годов несколько независимых лабораторий заявили, что им удалось успешно разделить внешнюю и внутреннюю митохондриальную мембрану. В марте 1967 года группа исследователей из Лаборатории физиологии питания во Франции опубликовала статью, в которой обсуждались исследования ферментативной активности внешней митохондриальной мембраны. Поскольку их исследования требовали выделения внешней митохондриальной мембраны, был также описан метод, основанный на последовательном воздействии дигитонина и ультразвуковой обработки для разделения двух митохондриальных мембран. Для завершения процедуры выделения неочищенную фракцию внешней мембраны очищали дифференциальным центрифугированием. [4] Примерно год спустя, в июле 1968 года, исследовательская группа с кафедры физиологической химии Медицинской школы Джонса Хопкинса опубликовала статью, описывающую свой метод разделения митохондриальных мембран в печени крыс, также с использованием дигитонина и дифференциального центрифугирования. Помимо разделения внешней и внутренней мембраны, им удалось дополнительно разделить внутреннюю мембрану и матрицу путем обработки неионным детергентом под названием Lubrol. Затем этот процесс позволил рассчитать относительное содержание белка в каждом митохондриальном компоненте. [5] В обеих статьях обоснование использования низких концентраций дигитонина для отделения внешней митохондриальной мембраны заключалось в том, что внешняя мембрана богата холестерином , который заставит ее связываться с дигитонином. После дальнейшего изучения исследовательская группа из Университета Джонса Хопкинса смогла усовершенствовать свой метод подготовки митопластов для производства митохондрий без внешней мембраны и с относительно неповрежденной внутренней мембраной и матриксом.
Другая процедура подготовки митопластов, описанная двумя дополнительными исследовательскими группами, использовала избирательное сокращение внутренней мембраны после того, как митохондрии печени подвергались циклу набухания-сокращения. Во время этой процедуры набухшая внешняя мембрана разрывалась либо спонтанно, либо в идеале после мягкого воздействия ультразвуком. После разрыва внешней мембраны компоненты внутренней мембраны можно было отделить от внешней мембраны дифференциальным центрифугированием. [6] Эта процедура эффективна из-за явных различий между внешней и внутренней митохондриальной мембраной, особенно в отношении осмотического поведения и проницаемости. Согласно обширным исследованиям, внутренняя мембрана способна реагировать на изменения осмотического давления, разворачиваясь и переворачиваясь. Однако внешняя мембрана не показала обратимых реакций на изменения осмотического давления. Следовательно, растяжение и разрыв наружной мембраны — это пассивный процесс, вызванный разворачиванием внутренней мембраны вследствие изменения осмотического давления.
Хотя в то время эти методы разделения оказались достаточно эффективными, их механическая природа устарела, поскольку были разработаны новые технологии, такие как French Press, чтобы сделать создание митопластов более быстрым и простым для исследователей.
Митопластические исследования
[ редактировать ]Возможность исследователей разделить две митохондриальные мембраны с образованием митопласта открыла множество новых возможностей для изучения митохондрий. Как упоминалось ранее, исследователи теперь смогли рассчитать относительное содержание белка в каждом компоненте митохондрии. Кроме того, митопласты позволили определитьвнутримитохондриального распределения ферментов, что ранее было невозможно, поскольку внутренняя мембрана была окружена внешней мембраной. Таким образом, вскоре после того, как митопласты смогли быть легко созданы, стали доступны различные данные почти обо всех ферментах, которые предположительно присутствовали в митохондриях.
Митопласты также полезны для электрофизиологического анализа функции митохондрий, поскольку митохондрии могут сохранять нормальную функцию даже после удаления их внешней мембраны. В частности, электрофизиология патч-кламп стала новым методом изучения функциональности внутренней мембраны. [7] Этот метод облегчает чувствительное измерение тока через мембрану, что полезно для изучения цепи переноса электронов и утечки протонов (т.е. разъединения движения протонов вниз по их электрохимическому градиенту и синтеза АТФ посредством АТФ-синтазы ).
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Митопласт» . Глоссарий биохимии и молекулярной биологии . Генскрипт.
- ^ Гарг, Вивек; Киричок, Юрий (2019). «Патч-кламп-анализ митохондриального унипортера кальция». Сигнализация кальция . Методы молекулярной биологии. Том. 1925. стр. 75–86. дои : 10.1007/978-1-4939-9018-4_7 . ISBN 978-1-4939-9017-7 . ПМИД 30674018 . S2CID 59226084 .
- ^ Фиени, Франческа; Бэ Ли, Сун; Ян, да; Киричок, Юрий (2012). «Активность митохондриального унипортера кальция сильно различается в зависимости от ткани» . Природные коммуникации . 3 : 1317. Бибкод : 2012NatCo...3.1317F . дои : 10.1038/ncomms2325 . ПМЦ 3818247 . ПМИД 23271651 .
- ^ Леви, Марианна; Тури, Рене; Андре, Жан (1967). «Разделение митохондриальных мембран. Очистка и ферментативная характеристика внешней мембраны». Биохимика и биофизика Acta . 135 (4): 599–613. дои : 10.1016/0005-2736(67)90092-2 . ПМИД 6048246 .
- ^ Шнайтман, Карл; Гринуолт, Джон В. (1968). «Ферментативные свойства внутренней и внешней мембран митохондрий печени крысы» . Журнал клеточной биологии . 38 (1): 158–175. дои : 10.1083/JCB.38.1.158 . ПМК 2107463 . ПМИД 5691970 .
- ^ Эрнстер, Ларс; Шац, Готфрид (1981). «Митохондрии: исторический обзор» . Журнал клеточной биологии . 91 (3, часть 2): 241 с. дои : 10.1083/jcb.91.3.227s . ПМК 2112799 . ПМИД 7033239 .
- ^ Бертоле, Амбре М.; Киричок, Юрий (2020). «Патч-кламп-анализ утечки митохондриального H + в коричневом и бежевом жире» . Границы в физиологии . 11 : 326. doi : 10.3389/fphys.2020.00326 . ISSN 1664-042X . ПМЦ 7174661 . ПМИД 32351404 .