✖


Jump to content

Редактирование эпигенома

Визуальный обзор того, как белки TALE используются для редактирования эпигенома

Редактирование эпигенома или эпигеномная инженерия — это тип генной инженерии, при котором эпигеном модифицируется в определенных сайтах с использованием сконструированных молекул, нацеленных на эти сайты (в отличие от модификаций всего генома). В то время как редактирование генов включает в себя изменение самой фактической последовательности ДНК, эпигенетическое редактирование включает в себя модификацию и представление последовательностей ДНК белкам и другим факторам связывания ДНК, которые влияют на функцию ДНК. «Редактируя» эпигеномные особенности таким образом, исследователи могут определить точную биологическую роль эпигенетической модификации в рассматриваемом участке.

Сконструированные белки, используемые для редактирования эпигенома, состоят из ДНК-связывающего домена, нацеленного на определенные последовательности, и эффекторного домена, который модифицирует эпигеномные особенности. В настоящее время для редактирования эпигенома преимущественно используются три основные группы ДНК-связывающих белков: цинковых пальцев белки , эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALE), и слияния Cas9 с дефицитом нуклеазы ( CRISPR ).

Общая концепция

[ редактировать ]

всего генома Сравнение эпигенетических карт с экспрессией генов позволило исследователям присвоить конкретным модификациям либо активирующую, либо подавляющую роль. Важность последовательности ДНК в регуляции эпигенома была продемонстрирована с помощью мотивов ДНК для прогнозирования эпигеномной модификации. [1] Дальнейшее понимание механизмов, лежащих в основе эпигенетики, было получено в результате in vitro биохимического и структурного анализа . Используя модельные организмы , исследователи смогли описать роль многих факторов хроматина посредством нокаутных исследований. Однако выведение всего модификатора хроматина оказывает огромное влияние на весь геном, что может не отражать его функцию в конкретном контексте. Одним из примеров этого является метилирование ДНК , происходящее в повторяющихся областях , промоторах , энхансерах и телах генов . Хотя метилирование ДНК на промоторах генов обычно коррелирует с репрессией генов, метилирование тел генов коррелирует с активацией генов, а метилирование ДНК также может играть роль в сплайсинге генов. [2] Возможность напрямую нацеливать и редактировать отдельные сайты метилирования имеет решающее значение для определения точной функции метилирования ДНК в конкретном сайте. Редактирование эпигенома — мощный инструмент, позволяющий проводить такой тип анализа. Для сайта-специфического редактирования метилирования ДНК, а также для редактирования гистонов системы редактирования генома были адаптированы в системы редактирования эпигенов. Короче говоря, самонаводящиеся белки генома с созданными или естественными функциями нуклеазы для редактирования генов могут быть мутированы и адаптированы в чисто системы доставки. Эпигенетически модифицирующий фермент или домен может быть слит с самонаводящимся белком, и локальные эпигенетические модификации могут быть изменены при рекрутировании белка. За исключением метилирования ДНК , самого хоминг-домена может быть достаточно, чтобы вмешаться в нормальные эпигенетические процессы и привести к целенаправленному эпигенетическому редактированию. [3]

Нацеленные белки

[ редактировать ]

СКАЗКА

[ редактировать ]

Белок- эффектор , подобный активатору транскрипции (TALE), распознает определенные последовательности ДНК в зависимости от состава его ДНК-связывающего домена . [4] Это позволяет исследователю конструировать различные белки TALE для распознавания целевой последовательности ДНК путем редактирования первичной структуры белка TALE. Специфичность связывания этого белка затем обычно подтверждается с помощью иммунопреципитации хроматина (ChIP) и секвенирования по Сэнгеру полученного фрагмента ДНК. [5] [6] [7] Это подтверждение по-прежнему требуется для всех исследований по распознаванию последовательностей TALE. [8] При использовании для редактирования эпигенома эти ДНК-связывающие белки прикрепляются к эффекторному белку. Эффекторные белки, которые использовались для этой цели, включают транслокационную метилцитозиндиоксигеназу 1 Ten-eleven (TET1) , [6] Лизин (K)-специфическая деметилаза 1А (LSD1) [7] и белок 1, связывающий кальций и интегрин (CIB1) . [5]

Белки цинковых пальцев

[ редактировать ]

использование белков, слитых с цинковыми пальцами Также изучалось , для распознавания сайтов редактирования эпигенома. Мэдер и др. сконструировали белок ZF-TET1 для использования в деметилировании ДНК. [6] Эти белки «цинковых пальцев» работают аналогично белкам TALE в том смысле, что они способны связываться с участками ДНК, специфичными для последовательности, на основе их белковой структуры, которая может быть модифицирована. Чен и др. успешно использовали ДНК-связывающий домен с цинковым пальцем в сочетании с белком TET1 , чтобы вызвать деметилирование нескольких ранее молчащих генов. [9] Кунгуловский и Йельч успешно использовали ZFP-направляемое отложение гена метилирования ДНК, чтобы вызвать молчание генов, но метилирование ДНК и молчание были потеряны, когда триггерный сигнал прекращался. Авторы предполагают, что для стабильных эпигенетических изменений необходимо либо множественное отложение метилирования ДНК родственных эпигенетических меток, либо длительные триггерные стимулы. [10] Эпигенетическое редактирование ZFP показало потенциал для лечения различных нейродегенеративных заболеваний. [11]

CRISPR-Cas

[ редактировать ]

Система кластерных регуляторных межпространственных коротких палиндромных повторов (CRISPR) -Cas функционирует как сайт-специфическая нуклеаза ДНК. [12] В хорошо изученной системе CRISPR типа II нуклеаза Cas9 связывается с химерой, состоящей из tracrRNA и crRNA. Эту химеру часто называют направляющей РНК (гРНК). Когда белок Cas9 связывается со специфичной для области ДНК гРНК, Cas9 расщепляет ДНК в целевых локусах ДНК. Однако при введении точечных мутаций D10A и H840A образуется каталитически мертвый Cas9 (dCas9), который может связывать ДНК, но не расщепляется. [13] Система dCas9 использовалась для целевого эпигенетического перепрограммирования с целью введения сайт-специфического метилирования ДНК. Путем слияния каталитического домена DNMT3a с белком dCas9 dCas9-DNMT3a способен достигать целевого метилирования ДНК целевой области, как указано в настоящей направляющей РНК. [14] Аналогично, dCas9 был слит с каталитическим ядром человеческой ацетилтрансферазы p300 . dCas9-p300 успешно катализирует целенаправленное ацетилирование лизина 27 гистона H3. [15] [16] Альтернативно, одного белка dCas9 достаточно, чтобы физически вмешиваться в нормальные процессы, которые поддерживают метилирование ДНК в том месте, на которое он нацелен, в делящихся клетках; это приводит к целенаправленному деметилированию ДНК. Основное преимущество этого подхода заключается в том, что он не содержит ферментов, модифицирующих эпигенетику, которые могут влиять на эпигенетические метки на больших расстояниях и действовать независимо по всему геному, несмотря на то, что они привязаны к целевому белку dCas9, что часто приводит к широко распространенным нецелевым эффектам. [3]

Вариант редактирования эпигенома CRISPR (называемый FIRE-Cas9) позволяет отменить внесенные изменения, если что-то пошло не так. [17] [18]

CRISPRoff — это мертвый слитый белок Cas9, который можно использовать для наследственного подавления экспрессии генов «большинства генов» и позволяет осуществлять обратимые модификации. [19] [20]

Часто используемые эффекторные белки

[ редактировать ]

TET1 индуцирует деметилирование цитозина в сайтах CpG . Этот белок использовался для активации генов, которые подавляются метилированием CpG, и для определения роли отдельных сайтов метилирования CpG. [6] Широко распространено мнение, что целенаправленное деметилирование обычно лучше достигается с помощью одного dCas9 (путем целенаправленного вмешательства в нормальный механизм метилирования ДНК), поскольку введение dCas9-TET в клетки приводит к широко распространенной нецелевой активности сверхэкспрессируемого фермента TET. [3] LSD1 индуцирует деметилирование H3K4me1 /2, что также вызывает косвенное влияние деацетилирования на H3K27. Этот эффектор можно использовать на гистонах в энхансерных областях, что может изменить экспрессию соседних генов. [7] CIB1 — светочувствительный криптохром , этот криптохром слит с белком TALE. Второй белок содержит партнера по взаимодействию ( CRY2 ), слитого с модификатором хроматина /ДНК (например, SID4X ). CRY2 может взаимодействовать с CIB1 , когда криптохром активируется освещением синим светом. [21] Взаимодействие позволяет модификатору хроматина действовать в нужном месте. Это означает, что модификация может быть осуществлена ​​индуцируемым и обратимым образом, что снижает долгосрочные вторичные эффекты, которые могут быть вызваны конститутивной эпигенетической модификацией. [5]

Приложения

[ редактировать ]

Изучение функции и активности энхансера

[ редактировать ]

Редактирование областей генного энхансера в геноме посредством целевой эпигенетической модификации было продемонстрировано Mendenhall et al. (2013). [7] В этом исследовании использовался слитый эффекторный белок TALE-LSD1 для воздействия на энхансеры генов, для индукции молчания энхансера с целью определения активности энхансера и контроля генов. Нацеливание на конкретные энхансеры с последующей локус-специфической RT-qPCR позволяет определить гены, на которые влияет молчащий энхансер. Альтернативно, индуцирование молчания энхансеров в регионах выше генов позволяет изменить экспрессию генов. Затем можно использовать RT-qPCR для изучения влияния этого на экспрессию генов. Это позволяет детально изучить функцию и активность энхансера. [7]

Определение функции специфических сайтов метилирования

[ редактировать ]

Важно понимать роль, которую специфические сайты метилирования играют в регуляции экспрессии генов. Чтобы изучить это, одна исследовательская группа использовала слитый белок TALE-TET1 для деметилирования одного сайта метилирования CpG. [6] Хотя этот подход требует множества контролей для обеспечения специфического связывания с целевыми локусами, правильно проведенное исследование с использованием этого подхода может определить биологическую функцию конкретного сайта метилирования CpG. [6]

Непосредственное определение роли эпигенетических модификаций

[ редактировать ]

Эпигенетическое редактирование с использованием индуцируемого механизма предлагает широкий спектр потенциальных возможностей для изучения эпигенетических эффектов в различных состояниях. Одна исследовательская группа использовала оптогенетическую двухгибридную систему, которая интегрировала ДНК-связывающий домен TALE, специфичный для последовательности, со светочувствительным белком криптохрома 2 ( CIB1 ). [5] После экспрессии в клетках система смогла индуцируемо редактировать модификации гистонов и определять их функцию в определенном контексте. [5]

Функциональная инженерия

[ редактировать ]

Направленная регуляция генов, связанных с заболеваниями, может позволить разработать новые методы лечения многих заболеваний, особенно в тех случаях, когда адекватная генная терапия еще не разработана или не подходит. [22] Хотя последствия на трансгенерационном и популяционном уровне еще не до конца понятны, они могут стать основным инструментом прикладной функциональной геномики и персонализированной медицины . [23] Как и редактирование РНК , оно не связано с генетическими изменениями и сопутствующими им рисками. [22] Один из примеров потенциального функционального использования редактирования эпигенома был описан в 2021 году: подавление Na v 1.7 экспрессии гена с помощью CRISPR-dCas9 , что продемонстрировало терапевтический потенциал на трех мышиных моделях хронической боли. [24] [25]

В 2022 году исследования оценили его полезность в снижении уровня тау-белка , регулировании белка, участвующего в болезни Хантингтона , борьбе с наследственной формой ожирения и синдромом Драве . [26]

Ограничения

[ редактировать ]

Специфичность последовательности критически важна при редактировании эпигенома и должна быть тщательно проверена (это можно сделать с помощью иммунопреципитации хроматина с последующим секвенированием по Сэнгеру для проверки целевой последовательности). [8] Неизвестно, может ли слияние TALE оказывать влияние на каталитическую активность модификатора эпигенома. Это может быть особенно важно для эффекторных белков, которым требуется множество субъединиц и комплексов, таких как репрессивный комплекс Polycomb . [8] Белки, используемые для редактирования эпигенома, также могут блокировать лиганды и субстраты в целевом сайте. [8] Сам белок TALE может даже конкурировать с факторами транскрипции , если они нацелены на одну и ту же последовательность. [8] Кроме того, системы репарации ДНК могут обратить вспять изменения в хроматине и предотвратить желаемые изменения. [8] Наконец, ферменты, слитые с dCas9, обычно способны действовать независимо от белка dCas9, с которым они слиты. Когда эти слияния сверхэкспрессируются в клетках, эти ферменты имеют тенденцию модифицировать большие участки генома, что представляет собой драматическую нецелевую активность. [3] [27] Поэтому необходимо оптимизировать слитые конструкции и механизмы нацеливания для надежного и повторяемого редактирования эпигенома.

См. также

[ редактировать ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Уитакер Дж.В., Чен З., Ван В. (март 2015 г.). «Предсказание эпигенома человека по мотивам ДНК» . Природные методы . 12 (3): 265–72, 7 стр. после 272. doi : 10.1038/nmeth.3065 . ПМЦ   4344378 . ПМИД   25240437 .
  2. ^ Джонс, Пенсильвания (май 2012 г.). «Функции метилирования ДНК: острова, стартовые сайты, тела генов и многое другое». Обзоры природы. Генетика . 13 (7): 484–92. дои : 10.1038/nrg3230 . ПМИД   22641018 . S2CID   3346812 .
  3. ^ Jump up to: а б с д Сапожников, Дэниел М.; Шиф, Моше (29 сентября 2021 г.). «Раскрытие функциональной роли деметилирования ДНК на конкретных промоторах путем целенаправленной стерической блокады ДНК-метилтрансферазы с помощью CRISPR/dCas9» . Природные коммуникации . 12 (1): 5711. doi : 10.1038/s41467-021-25991-9 . ПМЦ   8481236 . ПМИД   34588447 .
  4. ^ Гай Т., Герсбах Калифорния, Барбас КФ (июль 2013 г.). «Методы геномной инженерии на основе ZFN, TALEN и CRISPR/Cas» . Тенденции в биотехнологии . 31 (7): 397–405. дои : 10.1016/j.tibtech.2013.04.004 . ПМЦ   3694601 . ПМИД   23664777 .
  5. ^ Jump up to: а б с д и Конерманн С., Бригам М.Д., Тревино А., Сюй П.Д., Хайденрайх М., Конг Л. и др. (август 2013 г.). «Оптический контроль эндогенной транскрипции и эпигенетических состояний млекопитающих» . Природа . 500 (7463): 472–476. Бибкод : 2013Natur.500..472K . дои : 10.1038/nature12466 . ПМЦ   3856241 . ПМИД   23877069 .
  6. ^ Jump up to: а б с д и ж Маедер М.Л., Ангстман Дж.Ф., Ричардсон М.Е., Линдер С.Дж., Касио В.М., Цай С.К. и др. (декабрь 2013 г.). «Направленное деметилирование ДНК и активация эндогенных генов с использованием программируемых слитых белков TALE-TET1» . Природная биотехнология . 31 (12): 1137–42. дои : 10.1038/nbt.2726 . ПМЦ   3858462 . ПМИД   24108092 .
  7. ^ Jump up to: а б с д и Менденхолл Э.М., Уильямсон К.Е., Рейон Д., Зоу Дж.Ю., Рам О., Йонг Дж.К., Бернштейн Б.Е. (декабрь 2013 г.). «Локус-специфическое редактирование модификаций гистонов эндогенных энхансеров» . Природная биотехнология . 31 (12): 1133–6. дои : 10.1038/nbt.2701 . ПМЦ   3858395 . ПМИД   24013198 .
  8. ^ Jump up to: а б с д и ж Фойгт П., Рейнберг Д. (декабрь 2013 г.). «Редактирование эпигенома». Природная биотехнология . 31 (12): 1097–9. дои : 10.1038/nbt.2756 . ПМИД   24316647 . S2CID   28191072 .
  9. ^ Чен Х., Каземир Х.Г., де Гроот М.Л., Руитерс М.Х., Сюй Г.Л., Ротс М.Г. (февраль 2014 г.). «Индуцированное деметилирование ДНК путем нацеливания транслокации 2 Ten-Eleven на промотор ICAM-1 человека» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (3): 1563–74. дои : 10.1093/нар/gkt1019 . ПМЦ   3919596 . ПМИД   24194590 .
  10. ^ Кунгуловски Г., Нунна С., Томас М., Зангер У.М., Рейнхардт Р., Йельч А. (18 марта 2015 г.). «Направленное редактирование эпигенома эндогенного локуса с помощью модификаторов хроматина не поддерживается стабильно» . Эпигенетика и хроматин . 8 (1): 12. дои : 10.1186/s13072-015-0002-z . ПМК   4404288 . ПМИД   25901185 .
  11. ^ Бустос Ф.Дж., Ампуэро Э., Юри Н., Агилар Р., Фалахи Ф., Толедо Дж. и др. (декабрь 2017 г.). «Эпигенетическое редактирование гена Dlg4/PSD95 улучшает когнитивные функции у пожилых мышей, страдающих болезнью Альцгеймера» . Мозг . 140 (12): 3252–3268. дои : 10.1093/brain/awx272 . ПМК   5841035 . ПМИД   29155979 .
  12. ^ Биолаборатории, Новая Англия. «CRISPR/Cas9 и целенаправленное редактирование генома: новая эра в молекулярной биологии | NEB» . www.neb.com . Проверено 7 июня 2016 г.
  13. ^ «Аддген: Руководство по CRISPR/Cas9» . www.addgene.org . Проверено 7 июня 2016 г.
  14. ^ Макдональд Дж.И., Челик Х., Ройс Л.Е., Фишбергер Г., Фаулер Т., Рис Р. и др. (июнь 2016 г.). «Перепрограммируемая система на основе CRISPR/Cas9 для индукции сайт-специфического метилирования ДНК» . Биология Открытая . 5 (6): 866–74. дои : 10.1242/bio.019067 . ПМК   4920199 . ПМИД   27170255 .
  15. ^ Хилтон И.Б., Д'Ипполито А.М., Вокли СМ, ​​Такоре П.И., Кроуфорд Дж.Э., Редди Т.Е., Герсбах Калифорния (май 2015 г.). «Редактирование эпигенома с помощью ацетилтрансферазы на основе CRISPR-Cas9 активирует гены с промоторов и энхансеров» . Природная биотехнология . 33 (5): 510–7. дои : 10.1038/nbt.3199 . ПМК   4430400 . ПМИД   25849900 .
  16. ^ Сервантес-Грасиа К., Грамалла-Шмитц А., Вайшедель Дж., Чахван Р. (2021). «APOBECs организуют геномное и эпигеномное редактирование в сфере здравоохранения и болезней» . Тенденции Жене . 37 (11): 1028–1043. дои : 10.1016/j.tig.2021.07.003 . ПМИД   34353635 . S2CID   236934922 .
  17. ^ Браун, Саймон М.Г.; Киркланд, Джейкоб Г.; Чори, Эмма Дж.; Хусманн, Дилан; Каларко, Джозеф П.; Крэбтри, Джеральд Р. (2017). «Быстрое и обратимое редактирование эпигенома эндогенными регуляторами хроматина» . Природные коммуникации . 8 (1): 560. Бибкод : 2017NatCo...8..560B . дои : 10.1038/s41467-017-00644-y . ПМК   5601922 . ПМИД   28916764 .
  18. ^ Лю XS, Ву Х, Крзиш М, Ву X, Граф Дж, Муффат Дж и др. (февраль 2018 г.). «Спасение хрупких нейронов с синдромом X путем редактирования метилирования ДНК гена FMR1» . Клетка . 172 (5): 979–992.e6. дои : 10.1016/j.cell.2018.01.012 . ПМК   6375087 . ПМИД   29456084 .
  19. ^ «Новый обратимый метод CRISPR может контролировать экспрессию генов, оставляя лежащую в основе последовательность ДНК неизменной» . физ.орг . Проверено 10 мая 2021 г.
  20. ^ Нуньес, Джеймс К.; Чен, Джин; Помье, Грег К.; Коган, Дж. Закери; Реплогл, Джозеф М.; Адрианс, Кармен; Рамадосс, Гокул Н.; Ши, Цюаньмин; Хунг, король Л.; Самельсон, Ави Дж.; Погсон, Анджела Н.; Ким, Джеймс Ю.С.; Чанг, Аманда; Леонетти, Мануэль Д.; Чанг, Ховард Ю.; Кампманн, Мартин; Бернштейн, Брэдли Э.; Ховестадт, Волкер; Гилберт, Люк А.; Вайсман, Джонатан С. (29 апреля 2021 г.). «Программируемая транскрипционная память всего генома посредством редактирования эпигенома на основе CRISPR» . Клетка . 184 (9): 2503–2519.e17. дои : 10.1016/j.cell.2021.03.025 . ISSN   0092-8674 . ПМЦ   8376083 . ПМИД   33838111 .
  21. ^ Лю Х, Юй Х, Ли К, Клейнот Дж, Ян Х, Лисьеро Д, Лин С (декабрь 2008 г.). «Фотовозбуждаемый CRY2 взаимодействует с CIB1, регулируя транскрипцию и инициацию цветения у Arabidopsis» . Наука . 322 (5907): 1535–9. Бибкод : 2008Sci...322.1535L . дои : 10.1126/science.1163927 . ПМИД   18988809 . S2CID   3003167 .
  22. ^ Jump up to: а б Кунгуловский, Горан; Йельч, Альберт (1 февраля 2016 г.). «Редактирование эпигенома: современное состояние, концепции и перспективы» . Тенденции в генетике . 32 (2): 101–113. дои : 10.1016/j.tig.2015.12.001 . ISSN   0168-9525 . ПМИД   26732754 . Проверено 30 апреля 2021 г.
  23. ^ Лауфер, Бенджамин И.; Сингх, Шива М. (17 сентября 2015 г.). «Стратегии точной модуляции экспрессии генов путем редактирования эпигенома: обзор» . Эпигенетика и хроматин . 8 (1): 34. дои : 10.1186/s13072-015-0023-7 . ISSN   1756-8935 . ПМК   4574080 . ПМИД   26388942 .
  24. ^ «Уникальная генная терапия CRISPR предлагает лечение хронической боли без опиоидов» . Новый Атлас . 11 марта 2021 г. Проверено 18 апреля 2021 г.
  25. ^ Морено, Ана М.; Алеман, Фернандо; Катроли, Глауцилен Ф.; Хант, Мэтью; Ху, Майкл; Дайлами, Амир; Пла, Эндрю; Воллер, Сара А.; Палмер, Натан; Парех, Удит; Макдональд, Даниэлла; Робертс, Аманда Дж.; Доброй воли, Ванесса; Драйден, Ян; Хевнер, Роберт Ф.; Задержка, Лориана; Сантос, Жильсон Гонсалвеш душ; Якш, Тони Л.; Мали, Прашант (10 марта 2021 г.). «Длительная анальгезия за счет целенаправленной репрессии NaV1.7 in situ у мышей» . Наука трансляционной медицины . 13 (584): eaay9056. doi : 10.1126/scitranslmed.aay9056 . ISSN   1946-6234 . ПМЦ   8830379 . ПМИД   33692134 . S2CID   232170826 .
  26. ^ Кайзер, Джоселин (1 июня 2022 г.). «Лучше, чем CRISPR? Другой способ решения генных проблем может быть более безопасным и универсальным» . www.science.org . Проверено 21 августа 2022 г.
  27. ^ Галонска, С; Чарльтон, Дж; Маттеи, Алабама; Донахи, Дж; Клемент, К; Гу, Х; Мохаммед, AW; Стаменова Е.К.; Качкьярелли, Д; Клагес, С; Тиммерманн, Б; Канц, Т; Шёлер, HR; Гнирке, А; Циллер, MJ; Мейснер, А. (9 февраля 2018 г.). «Полногеномное отслеживание следов dCas9-метилтрансферазы» . Природные коммуникации . 9 (1): 597. doi : 10.1038/s41467-017-02708-5 . ПМК   5807365 . ПМИД   29426832 .

Дальнейшее чтение

[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Epigenome_editing&oldid=1238678884"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 2241fdd09345084b6baaea351627a930__1722818940
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/22/30/2241fdd09345084b6baaea351627a930.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Epigenome editing - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)