Наноин
Наноинъекция - это процесс использования микроскопического копья и электрических сил для доставки ДНК в клетку. Утверждается, что он более эффективен, чем микроинъекция , потому что используемое копье в десять раз меньше микропипетки , а метод не использует жидкость. Механизм наноинъектора эксплуатируется во время погружения в буферный раствор pH . Затем к копью, который накапливает негативно заряженную ДНК на поверхности, применяется положительный электрический заряд. Затем механизм наноинжерации проникает в зиготические мембраны, и к копьи применяется отрицательный заряд, высвобождая накопленную ДНК в клетке. Копье необходимо для поддержания постоянного повышения как на въезде, так и на выходе из ячейки. [ 1 ]
Наноинлексирование приводит к долгосрочной жизнеспособности клеток 92% после процесса электрофоретического диаметра 100 нм впрыска с нанопипеткой , типичным диаметром пипетки наноин. [ 2 ]
Трансфекция отдельных клеток используется для практически переноса любого типа ячейки млекопитающих в другой, используя шприц, который создает запись для высвобождения ДНК. Нано -иглу используется в качестве механического вектора для плазмидной ДНК. Метод может быть улучшен с помощью атомной силовой микроскопии или АСМ. Чтобы избежать постоянного повреждения клетки или провоцировать утечку клеток внутриклеточной жидкости, AFM является предпочтительным инструментом, поскольку он позволяет точно расположить ДНК, что позволяет проникнуть на наконечник в цитозоль , что имеет решающее значение для жизнеспособной передачи ДНК в ячейку. [ 3 ]
Причины использования наноинлексии включают введение генетического материала в геном зиготы. Этот метод является важным шагом в понимании и разработке функций генов.
Наноинжекция также используется для генетически модифицировать животных, чтобы помочь в исследованиях рака , болезни Альцгеймера и диабета. [ 2 ]
Изготовление
[ редактировать ]Копь производится с использованием технологии изготовления полимумп . Он создает золотой слой, и два структурных слоя имеют толщину 2,0 и 1,5 мкм соответственно. Это простой процесс, который делает его хорошей платформой для прототипа устройств Polysilicon MEMS с низкой коммерческой стоимостью изготовления. Копь имеет твердое коническое тело, толщиной 2 мкм, шириной кончика 150 нм. Конус устанавливается на уровне 7,9 °, достигая максимальной ширины 11 мкм. Два сильно сложенных электрических соединения обеспечивают электрический путь между копье и двумя эквивалентными подушками с связями, причем золотой провод, соединяющий одну из прокладки связи с штифтом интегрированной цепной чипы. Затем носитель помещается в специально созданный электрический розетка. [ 4 ]
В ситуации оплодотворяющих яиц копье включено в кинематический механизм, состоящий из точки, параллельной шестибообразной механизма, и соответствующей подвески, посвященной параллельному уходу.
Методы
[ редактировать ]Электрофоретическая инъекция
[ редактировать ]Электрофоретическая инъекция остается наиболее распространенной формой наноинлексии. Как и в случае с другими методами, используется копье в десять раз меньше, чем у микроинъекции. Подготовка копья к инъекции, применяется положительный заряд, привлекая отрицательно заряженную ДНК к его кончику. После того, как копье достигла желаемой глубины внутри ячейки, заряд изменяется, отражает ДНК в клетку. [ 1 ] Типичные напряжения впрыска составляют ± 20 В, но могут составлять всего 50-100 мВ.
Диффузия
[ редактировать ]Ручная сила применяется к центральному приспособлению инъекционного устройства, перемещая коры через клеточные мембраны в цитоплазму или ядро прилипших клеток. Величина силы измеряется с использованием силовой пластины на небольшом количестве инъекций, чтобы получить оценку ручной силы. Силовая пластина расположена для измерения силы, фактически применяемой к чипу инъекции (то есть не включая жесткость опорной пружины). После удержания силы в течение пяти секунд, сила выделяется, и устройство инъекции удаляется из ячейки. Протокол диффузии представил данные для сравнения с другими вариациями в процессе инъекции. [ 5 ]
Приложения
[ редактировать ]Добавляя определенные частицы в ячейки, заболевания могут быть обработаны или даже вылечить. Генная терапия , возможно, является наиболее распространенной областью доставки посторонних материалов в клетки и имеет большое значение для лечения генетических заболеваний человека.
Например, в недавнем эксперименте двое обезьян с рождением получали лечение генной терапии. В результате генной терапии у обоих животных было восстановлено цветное зрение без каких -либо кажущихся побочных эффектов. Традиционно генная терапия была разделена на две категории: биологические (вирусные) векторы и химические или физические (невирусные) подходы. Хотя вирусные векторы в настоящее время являются наиболее эффективным подходом к доставке ДНК в клетки, они имеют определенные ограничения, включая иммуногенность , токсичность и ограниченную способность переносить ДНК. [ 5 ]
Одним из факторов, критикованных для успешной генной терапии, является разработка эффективных систем доставки. Несмотря на то, что достижения в области технологии передачи генов, включая вирусные и невирусные векторы, были достигнуты, идеальная векторная система еще не была построена. [ 6 ]
Альтернативы
[ редактировать ]Микроинъекция является предшественником наноинлексии. По-прежнему используется в биологических исследованиях, микроинъекция полезна при исследовании неживых клеток или в тех случаях, когда жизнеспособность клеток не имеет значения. Используя стеклянную пипетку 0,5-1,0 микрометра в диаметре, ячейка имеет свою мембрану, поврежденную при прокол. В отличие от наноинъекции, микроинъекция использует заполненную ДНК жидкость, приводимую в клетку под давлением. В зависимости от таких факторов, как навык оператора, скорости выживаемости ячеек, проходящих эту процедуру, может достигать 56% или всего 9%. [ 2 ]
Существуют другие методы, которые нацелены на группы ячеек, такие как электропорация . Эти методы не способны нацелить определенные ячейки и поэтому не подлежат использованию, если эффективность и жизнеспособность клеток являются проблемой.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а беременный Aten, Quentin T.; Дженсен, Брайан Д.; Бернетт, Сандра Х.; Хауэлл, Ларри Л. (2014). «Самоопределяющий метаморфический наноинжектор для инъекции в зиготы мыши». Обзор научных инструментов . 85 (5): 055005. BIBCODE : 2014RSCI ... 85E5005A . doi : 10.1063/1.4872077 . PMID 24880406 .
- ^ Jump up to: а беременный в Симонис, Матиас; Хюбнер, Вольфганг; Уилкинг, Алиса; Хузер, Томас; Хенниг, Саймон (2017-01-25). «Выживаемость эукариотических клеток после электрофоретического наноинлексии» . Научные отчеты . 7 : 41277. Bibcode : 2017natsr ... 741277S . doi : 10.1038/srep41277 . ISSN 2045-2322 . PMC 5264641 . PMID 28120926 .
- ^ Cuerrier, Charles M.; Лебель, Режан; Дедушка, Мишель (2007-04-13). «Трансфекция одноклеточных с использованием плазмидных зондов AFM». Биохимическая и биофизическая исследовательская коммуникация . 355 (3): 632–636. doi : 10.1016/j.bbrc.2007.01.190 . ISSN 0006-291X . PMID 17316557 .
- ^ Aten, Qt; Дженсен, BD; Бернетт, Ш; Howell, LL (декабрь 2011 г.). «Электростатическое накопление и высвобождение ДНК с использованием микромачированного копья». Журнал микроэлектромеханических систем . 20 (6): 1449–1461. doi : 10.1109/jmems.2011.2167658 . ISSN 1057-7157 . S2CID 59961 .
- ^ Jump up to: а беременный Линдстрем, Захари К.; Брюер, Стивен Дж.; Фергюсон, Мелани А.; Бернетт, Сандра Х.; Дженсен, Брайан Д. (2014-10-03). «Инъекция йодида пропидия в клетки HeLa с использованием копья кремниевой наноинлексии». Журнал нанотехнологий в области инженерии и медицины . 5 (2): 021008–021008–7. doi : 10.1115/1.4028603 . ISSN 1949-2944 . S2CID 135872805 .
- ^ Mehierhumbert, S.; Гай, Р. (2005-04-05). «Физические методы переноса генов: улучшение кинетики доставки генов в клетки». Расширенные обзоры доставки наркотиков . 57 (5): 733–753. doi : 10.1016/j.addr.2004.12.007 . ISSN 0169-409X . PMID 15757758 .