Обратная полимеразная цепная реакция комплемента
Полимеразная цепная реакция с обратной комплементом (RC-PCR) представляет собой модификацию полимеразной цепной реакции (PCR). Он в основном используется для создания библиотек ампликонов для ДНК секвенирования методом секвенирования следующего поколения (NGS). Этот метод обеспечивает как амплификацию, так и возможность независимого добавления последовательностей или функциональных доменов по выбору к любому концу созданных ампликонов в одной реакции в закрытой пробирке. RC-PCR была изобретена в 2013 году Дэниелом Уордом и Кристофером Мэттоксом в Salisbury NHS Foundation Trust , Великобритания.
Принципы
[ редактировать ]
При RC-PCR в реакционной смеси отсутствуют целевые праймеры. Вместо этого в ходе реакции образуются целевые специфические праймеры. Типичная реакция, использующая этот подход, требует четырех олигонуклеотидов . Олигонуклеотиды взаимодействуют друг с другом попарно; один олигонуклеотидный зонд и один универсальный праймер (содержащий выбранные функциональные домены), которые гибридизуются друг с другом на своих 3'-концах. После гибридизации универсальный праймер можно расширить, используя олигонуклеотидный зонд в качестве матрицы, чтобы получить полностью сформированные праймеры, специфичные для мишени, которые затем доступны для амплификации матрицы в последующих раундах термоциклирования в соответствии со стандартной реакцией ПЦР.
Олигонуклеотидный зонд также можно блокировать на 3'-конце, предотвращая эквивалентное удлинение зонда, но это не является существенным. Зонд не расходуется; он может выступать в качестве шаблона для универсального праймера, который будет «преобразован» в целевой праймер на протяжении последующих циклов ПЦР. Это создание целевого специфического праймера происходит параллельно со стандартной ПЦР-амплификацией в стандартных условиях ПЦР.
Преимущества
[ редактировать ]
RC-PCR обеспечивает значительные преимущества перед другими методами приготовления библиотеки ампликонов. Самое главное, что это реакция в одной закрытой пробирке, что исключает перекрестное загрязнение, связанное с другими подходами двухэтапной ПЦР, а также использует меньше реагентов и требует меньше труда для выполнения.
Этот метод также обеспечивает значительное преимущество, заключающееся в гибкости добавления любой желаемой последовательности или выбранного функционального домена к любому концу любого ампликона. В настоящее время это наиболее выгодно в современных лабораториях секвенирования следующего поколения (NGS), где одна пара зондов, специфичных для мишени, может использоваться с целой библиотекой универсальных праймеров. Это преимущество используется с приложениями NGS для независимого применения индексов, специфичных для образца, к каждому концу конструкции ампликона. Лаборатории, использующей этот подход, потребуется только один набор индексных праймеров, который можно использовать со всеми целевыми специфичными зондами, совместимыми с этим индексным набором. Это значительно уменьшает количество и длину олигонуклеотидов, необходимых лаборатории, по сравнению с использованием предварительно синтезированных полноразмерных индексированных праймеров, специфичных для мишени.
Генерация целевого специфического праймера в ходе реакции также приводит к более сбалансированным компонентам реакции. Концентрации целевого специфического праймера в большей степени соответствуют концентрации целевой молекулы, тем самым снижая вероятность как нецелевого прайминга, так и димеризации праймера.
Вариации
[ редактировать ]- Мультиплексная RC-ПЦР – когда . в реакционной смеси присутствуют два или более универсальных набора праймеров для одновременной амплификации двух или более мишеней
- RT-RC-PCR. Эта модификация используется, когда в реакции используется РНК , а не ДНК . В этой модификации реакционная смесь также содержит ферменты обратной транскриптазы и обратной транскрипции праймеры , а также универсальные праймеры и зонды обратного комплемента метода. Этот подход позволяет осуществлять обратную транскрипцию предоставленной матрицы РНК , образование хвостатых праймеров, специфичных для мишени, и амплификацию желаемых мишеней в одной реакции в закрытой пробирке.
- Одноконечная RC-ПЦР. Этот вариант метода используется, когда в реакции используется только одна комплементарная пара универсальных праймеров-зондов для создания одного целевого специфического праймера. Другой праймер, специфичный для конкретной цели , предоставляется в виде традиционного праймера согласно стандартной ПЦР .
История
[ редактировать ]После изобретения RC-PCR в 2013 году этот метод был клинически проверен и использован для диагностики ряда наследственных заболеваний, таких как гемохроматоз и тромбофилия , а также соматически приобретенных заболеваний, включая миелопролиферативные новообразования и острый миелоидный лейкоз, в Региональной генетической лаборатории Уэссекса (WRGL). ), Солсбери, Великобритания. Совсем недавно была предпринята работа по использованию этой технологии в борьбе с пандемией SARS-CoV-2. [1]
Заявка на патент была подана в Великобритании в 2015 году и выдана в 2020 году. Патентные заявки были поданы в других юрисдикциях по всему миру и в настоящее время находятся на рассмотрении.
В мае 2019 года лицензия на интеллектуальную собственность была передана компании Nimagen BV. [2] разрабатывать, производить и продавать комплекты, использующие эту технологию. В настоящее время коммерчески доступны наборы, использующие эту технологию, включая наборы для идентификации человека. [3] [4] и совсем недавно для полногеномного секвенирования вируса SARS-CoV-2 для идентификации вариантов, отслеживания и ответа на лечение. [5] [6] В августе 2022 года Nimagen официально выпустила ряд продуктов, использующих технологию RC-PCR для судебно-медицинской экспертизы человека, под торговой маркой IDseek®.
Подход RC-PCR становится все более широко используемым для здоровья человека, и для клинической диагностики человека доступно несколько наборов CE IVD, включая анализ BRCA , TP53 , PALB2 и CFTR . Этот метод также зарекомендовал себя как полезный и мощный инструмент для идентификации возбудителя инфекционного возбудителя у пациентов с подозрением на бактериальную инфекцию. Было показано, что в этих условиях он обеспечивает значительное увеличение количества клинических образцов, в которых потенциально клинически значимый патоген идентифицирован по сравнению с широко используемым методом 16S Сэнгера. [7] Также было показано, что он обеспечивает аналогичные преимущества перед традиционными методами деконволюции микробных сообществ в образцах окружающей среды. [8]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Мэттокс, Кристофер; Уорд, Дэниел; Маккей, Дебора (5 марта 2021 г.). «RT-RC-PCR: новый и масштабируемый метод секвенирования нового поколения для одновременного обнаружения SARS-COV-2 и типирования вызывающих беспокойство вариантов». medRxiv 10.1101/2021.03.02.21252704v1 .
- ^ «NimaGen лицензирует технологию ПЦР у Фонда Национальной службы здравоохранения Солсбери» . Геномная паутина . 14 января 2019 г. Проверено 22 апреля 2021 г.
- ^ Кизер, Рэйчел Э.; Бусь, Магдалена М.; Кинг, Джонатан Л.; ван дер Влит, Уолтер; Тилен, Йоп; Будоул, Брюс (январь 2020 г.). «ПЦР с обратным комплементом: новая одноэтапная система ПЦР для типирования сильно деградированной ДНК для идентификации человека» . Международная судебно-медицинская экспертиза. Генетика . 44 : 102201. doi : 10.1016/j.fsigen.2019.102201 . ISSN 1878-0326 . ПМИД 31786458 . S2CID 208535138 .
- ^ Автобус, Магдалена М; де Йонг, Эрик AC; Кинг, Джонатан Л.; дер Влит, Уолтер ван; Тилен, Йоп; Будоул, Брюс (05 августа 2021 г.). «Обратная комплементарная ПЦР, инновационный и эффективный метод мультиплексирования значимых для судебно-медицинской экспертизы систем маркеров однонуклеотидного полиморфизма» . БиоТехники . 71 (3): бтн–2021–0031. дои : 10.2144/btn-2021-0031 . ISSN 0736-6205 . ПМИД 34350776 .
- ^ Уолтерс, Фемке; Кулен, Джорди П.М.; Тостманн, Альма; Гронинген, фургон Lenneke FJ; Бликер-Роверс, Шанталь П.; Тан, Эдвард CTH; Гест-Бланкерт, Наннет ван дер; Хаутваст, Жаннин Л.А.; Хопман, Йост; Вертхайм, Хейман, Флорида; Рахамат-Лангендоен, Джанетт К. (29 октября 2020 г.). «Новая методика полногеномного секвенирования SARS-CoV-2 с использованием ПЦР с обратным комплементом обеспечивает быстрый и точный анализ вспышки» . bioRxiv : 2020.10.29.360578. дои : 10.1101/2020.10.29.360578 . S2CID 226228646 .
- ^ Донован-Бэнфилд, Айя; Пенрис-Рэндал, Ребекка; Голдсвейн, Ханна; Жешутек, Александра М.; Пилигрим, Джек; Буллок, Кэти; Сондерс, Джеффри; Норти, Джош; Донг, Сяофэн; Райан, Ян; Рейнольдс, Хелен; Тетлоу, Мишель; Уокер, Лорен Э.; Фитцджеральд, Ричард; Хейл, Колин (26 ноября 2022 г.). «Характеристика геномных вариаций SARS-CoV-2 в ответ на лечение молнупиравиром в клиническом исследовании AGILE фазы IIa» . Природные коммуникации . 13 (1): 7284. Бибкод : 2022NatCo..13.7284D . дои : 10.1038/s41467-022-34839-9 . ISSN 2041-1723 . ПМК 9701236 . ПМИД 36435798 .
- ^ Мурлаг, Симона JCFM; Кулен, Джорди П.М.; ван ден Бош, Барт; Джин, Элизабет Хуэй-Мэй; Буил, Йохем Б.; Вертхайм, Хейман, Флорида; Мельчерс, Виллем Дж.Г. (25 мая 2023 г.). Люти, Пол М. (ред.). «Нацеливание на ген 16S рРНК с помощью ПЦР с обратным комплементом, секвенирование нового поколения: специфическое и чувствительное обнаружение и идентификация микробов непосредственно в клинических образцах» . Микробиологический спектр . 11 (3). Дэвид Гастон. дои : 10.1128/spectrum.04483-22 . hdl : 2066/294286 . ISSN 2165-0497 .
- ^ Леонтиду, Клеопатра; Абад-Ресио, Ион Л.; Рубель, Верена; Филкер, Сабина; Доймер, Мартин; Тилен, Александр; Ланцен, Андерс; Сток, Торстен (16 ноября 2023 г.). «Одновременный анализ семи гипервариабельных областей гена <scp>16S рРНК</scp> повышает эффективность обнаружения разнообразия морских бактерий» . Экологическая микробиология . 25 (12): 3484–3501. дои : 10.1111/1462-2920.16530 . ISSN 1462-2912 . ПМИД 37974518 .