тест Эймса
Тест Эймса — это широко используемый метод, в котором бактерии используются для проверки того, может ли данное химическое вещество вызывать мутации в ДНК тестируемого организма. Более формально, это биологический анализ для оценки мутагенного потенциала химических соединений. [ 1 ] Положительный результат теста указывает на то, что химическое вещество является мутагенным и, следовательно, может действовать как канцероген , поскольку рак часто связан с мутацией . Этот тест служит быстрым и удобным анализом для оценки канцерогенного потенциала соединения, поскольку стандартные анализы канцерогена на мышах и крысах отнимают много времени (на выполнение которых уходит два-три года) и дороги. Однако известны ложноположительные и ложноотрицательные результаты. [ 2 ]
Процедура была описана в серии статей в начале 1970-х годов Брюсом Эймсом и его группой из Калифорнийского университета в Беркли . [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]
Общая процедура
[ редактировать ]В тесте Эймса используются несколько штаммов бактерии Salmonella typhimurium , которые несут мутации в генах, участвующих в синтезе гистидина . Эти штаммы являются ауксотрофными мутантами, т.е. им для роста необходим гистидин, но они не могут его продуцировать. Метод проверяет способность тестируемого вещества создавать мутации, приводящие к возврату в «прототрофное» состояние, благодаря чему клетки могут расти на среде, не содержащей гистидина.
Тестовые штаммы специально созданы для обнаружения мутаций со сдвигом рамки (например, штаммы ТА-1537 и ТА-1538) или точечных (например, штамм ТА-1531) мутаций в генах, необходимых для синтеза гистидина, что позволяет идентифицировать мутагены, действующие посредством различных механизмов. Некоторые соединения весьма специфичны и вызывают реверсию всего у одного или двух штаммов. [ 4 ] Тестовые штаммы также несут мутации в генах, ответственных за синтез липополисахаридов , что делает клеточную стенку бактерий более проницаемой. [ 5 ] и в системе эксцизионной пластики, чтобы сделать тест более чувствительным. [ 6 ]
У более крупных организмов, таких как млекопитающие, есть метаболические процессы, которые потенциально могут превратить химическое вещество, считающееся немутагенным, в мутагенное, или химическое вещество, считающееся мутагенным, в немутагенное. [ 7 ] Следовательно, чтобы более эффективно проверить мутагенность химического соединения по отношению к более крупным организмам, можно добавить ферменты печени крысы, чтобы попытаться воспроизвести влияние метаболических процессов на соединение, испытываемое в тесте Эймса. Экстракт печени крысы необязательно добавляется для имитации эффекта метаболизма , поскольку некоторые соединения, такие как бензо[ а ]пирен , сами по себе не являются мутагенными, но являются продуктами их метаболизма. [ 3 ]
Бактерии раскладывают на чашке с агаром с небольшим количеством гистидина. Это небольшое количество гистидина в питательной среде позволяет бактериям первое время расти и иметь возможность мутировать. Когда запасы гистидина истощаются, выживают только бактерии, которые мутировали и приобрели способность производить собственный гистидин. Планшет инкубируют в течение 48 часов. Мутагенность вещества пропорциональна количеству наблюдаемых колоний.
Тест Эймса и канцерогены
[ редактировать ]Мутагены, выявленные с помощью теста Эймса, также являются возможными канцерогенами, и ранние исследования Эймса показали, что 90% известных канцерогенов могут быть идентифицированы с помощью этого теста. [ 8 ] Однако более поздние исследования показали идентификацию 50–70% известных канцерогенов. [ нужна ссылка ] Тест был использован для идентификации ряда соединений, ранее использовавшихся в коммерческих продуктах как потенциальные канцерогены. [ 9 ] Примеры включают трис(2,3-дибромпропил)фосфат , который использовался в качестве антипирена в пластике и текстиле, например, в детской одежде для сна. [ 10 ] и фурилфурамид , который использовался в качестве антибактериальной добавки в пищу в Японии в 1960-х и 1970-х годах. Фактически, фурилфурамид ранее проходил испытания на животных, но более строгие испытания после его идентификации в тесте Эймса показали, что он канцерогенен. [ 11 ] Положительные тесты привели к тому, что эти химические вещества были изъяты из использования в потребительских товарах.
Одним из интересных результатов теста Эймса является то, что кривая доза-эффект при различных концентрациях химического вещества почти всегда линейна. [ 8 ] что указывает на отсутствие пороговой концентрации для мутагенеза. Таким образом, это предполагает, что, как и в случае с радиацией, не может быть безопасного порога . для химических мутагенов или канцерогенов [ 12 ] [ 13 ] Однако некоторые предполагают, что организмы могут переносить низкие уровни мутагенов из-за защитных механизмов, таких как восстановление ДНК , и, таким образом, может существовать порог для определенных химических мутагенов. [ 14 ] Сам Брюс Эймс выступал против линейной экстраполяции зависимости «доза-реакция» от высокой дозы, используемой в тестах на канцерогенез на животных, до более низких доз химических веществ, обычно встречающихся при воздействии на человека, поскольку результаты могут быть ложноположительными из-за митогенной реакции, вызванной искусственно высокой дозой. химических веществ, используемых в таких испытаниях. [ 15 ] [ 16 ] Он также предостерег от «истерии по поводу крошечных следов химических веществ, которые могут вызывать или не вызывать рак», которая «полностью исключает основные риски, о которых вам следует знать». [ 17 ]
Тест Эймса часто используется в качестве одного из начальных тестов на наличие потенциальных лекарств для исключения возможных канцерогенов. Это один из восьми тестов, требуемых в соответствии с Законом о пестицидах (США), и один из шести тестов, требуемых в соответствии с Законом о контроле над токсичными веществами. (США). [ 18 ]
Ограничения
[ редактировать ]Salmonella typhimurium является прокариотом, поэтому не является идеальной моделью для человека. печени крысы Фракцию S9 используют для имитации метаболических условий млекопитающих, чтобы можно было оценить мутагенный потенциал метаболитов, образуемых родительской молекулой в печеночной системе; однако существуют различия в метаболизме между людьми и крысами, которые могут влиять на мутагенность тестируемых химических веществ. [ 19 ] Таким образом, тест можно улучшить за счет использования фракции S9 печени человека; ранее его использование было ограничено его доступностью, но теперь он доступен коммерчески и, следовательно, может быть более целесообразным. [ 20 ] Адаптированная модель in vitro была создана для эукариотических клеток, например дрожжей.
Мутагены, выявленные в ходе теста Эймса, не обязательно должны быть канцерогенными, и для выявления любого потенциального канцерогена, выявленного в ходе теста, необходимы дальнейшие исследования. Лекарства, содержащие нитратную часть, иногда оказываются положительными для Эймса, хотя они действительно безопасны. Нитратные соединения могут генерировать оксид азота , важную сигнальную молекулу, которая может дать ложноположительный результат. Нитроглицерин является примером того, что дает положительный результат Эймса, но до сих пор используется в лечении. Однако нитраты в пищевых продуктах могут быть восстановлены под действием бактерий до нитритов, которые, как известно, образуют канцерогены в результате реакции с аминами и амидами. Для опровержения положительного результата теста Эймса необходимы длительные токсикологические и исходные исследования таких соединений.
Флуктуационный метод
[ редактировать ]
Тест Эймса изначально был разработан с использованием чашек с агаром (техника включения чашек), как описано выше. С этого времени была разработана альтернатива проведению теста Эймса, известная как «метод флуктуации». По своей концепции этот метод аналогичен методу на основе агара: бактерии добавляются в реакционную смесь с небольшим количеством гистидина , что позволяет бактериям расти и мутировать, возвращаясь к синтезу собственного гистидина. подсчитывают частоту мутаций При включении индикатора pH в микропланшетах как количество лунок, изменивших цвет (вызванных падением pH из-за метаболических процессов размножающихся бактерий). Как и в традиционном тесте Эймса, образец сравнивается с естественной фоновой частотой обратной мутации, чтобы установить генотоксичность вещества. Метод флуктуации полностью выполняется в жидкой культуре и оценивается путем подсчета количества лунок, которые меняют цвет с желтого на фиолетовый в 96-луночных или 384-луночных микропланшетах.
В методе 96-луночного планшета частоту мутации подсчитывают как количество лунок из 96, изменивших цвет. Чашки инкубируют до пяти дней, при этом каждый день подсчитывают мутированные (желтые) колонии и сравнивают их с фоновой частотой обратной мутации, используя установленные таблицы значимости для определения существенных различий между фоновой скоростью мутаций и таковой для тестируемых. образцы.
В более масштабном методе микрофлюктуации 384-луночного планшета частоту мутаций подсчитывают как количество лунок из 48, которые изменили цвет после 2 дней инкубации. Тестовый образец анализируется по 6 уровням дозы с одновременным использованием нулевой дозы (фона) и положительного контроля, которые помещаются в один 384-луночный планшет. Анализ проводится в трех экземплярах для обеспечения статистической надежности. В нем используются тестовые штаммы, рекомендованные Директивой ОЭСР 471 (ауксотрофы гистидина и ауксотрофы триптофана).
Флуктуационный метод сравним с традиционным методом разливки с точки зрения чувствительности и точности, однако он имеет ряд преимуществ: для него требуется меньше тестируемого образца, он имеет простую колориметрическую конечную точку, подсчитывающую количество положительных лунок из возможных. Использование 96 или 48 лунок требует гораздо меньше времени, чем подсчет отдельных колоний на чашке с агаром. Доступно несколько коммерческих комплектов. Большинство наборов имеют расходные компоненты в готовом к использованию состоянии, в том числе лиофилизированные бактерии, а тестирование можно проводить с помощью многоканальных пипеток. Флуктуационный метод также позволяет тестировать большие объемы водных проб (до 75% об./об.), повышая чувствительность и расширяя его применение к низкоуровневым мутагенам окружающей среды. [ 21 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Мортельманс К., Зейгер Э. (ноябрь 2000 г.). «Анализ мутагенности сальмонелл Эймса/микросом». Мутационные исследования . 455 (1–2): 29–60. дои : 10.1016/S0027-5107(00)00064-6 . ПМИД 11113466 .
- ^ Чарнли Дж. (2002). «Тест Эймса» . Энциклопедия общественного здравоохранения . eNotes.com. Архивировано из оригинала 4 февраля 2009 года . Проверено 2 мая 2014 г.
- ^ Перейти обратно: а б Эймс Б.Н., Дерстон В.Е., Ямасаки Э., Ли Ф.Д. (август 1973 г.). «Канцерогены — это мутагены: простая тест-система, сочетающая гомогенаты печени для активации и бактерии для обнаружения» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 70 (8): 2281–5. Бибкод : 1973PNAS...70.2281A . дои : 10.1073/pnas.70.8.2281 . ПМК 433718 . ПМИД 4151811 .
- ^ Перейти обратно: а б Эймс Б.Н., Герни Э.Г., Миллер Дж.А., Барч Х. (ноябрь 1972 г.). «Канцерогены как мутагены сдвига рамки считывания: метаболиты и производные 2-ацетиламинофлуорена и других канцерогенов ароматических аминов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 69 (11): 3128–32. Бибкод : 1972PNAS...69.3128A . дои : 10.1073/pnas.69.11.3128 . ПМЦ 389719 . ПМИД 4564203 .
- ^ Перейти обратно: а б Эймс Б.Н., Ли Ф.Д., Дерстон В.Е. (март 1973 г.). «Усовершенствованная бактериальная тест-система для обнаружения и классификации мутагенов и канцерогенов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 70 (3): 782–6. Бибкод : 1973PNAS...70..782A . дои : 10.1073/pnas.70.3.782 . ПМЦ 433358 . ПМИД 4577135 .
- ^ Перейти обратно: а б Макканн Дж., Спингарн Н.Е., Кобори Дж., Эймс Б.Н. (март 1975 г.). «Обнаружение канцерогенов как мутагенов: бактериальные тест-штаммы с плазмидами R-фактора» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 72 (3): 979–83. Бибкод : 1975ПНАС...72..979М . дои : 10.1073/pnas.72.3.979 . ПМЦ 432447 . ПМИД 165497 .
- ^ Хартвелл Л., Голдберг М., Худ Л., Рейнольдс А., Сильвер Л. (2011). Генетика: от генов к геномам (4-е изд.). Нью-Йорк: МакГроу-Хилл. ISBN 978-0-07-352526-6 . OCLC 317623365 .
- ^ Перейти обратно: а б Макканн Дж., Чой Э., Ямасаки Э., Эймс Б.Н. (декабрь 1975 г.). «Обнаружение канцерогенов как мутагенов в тесте на сальмонеллу / микросомы: анализ 300 химических веществ» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 72 (12): 5135–9. Бибкод : 1975PNAS...72.5135M . дои : 10.1073/pnas.72.12.5135 . ПМЦ 388891 . ПМИД 1061098 .
- ^ Эймс Б.Н. (май 1979 г.). «Выявление химических веществ в окружающей среде, вызывающих мутации и рак» (PDF) . Наука . 204 (4393): 587–93. Бибкод : 1979Sci...204..587A . дои : 10.1126/science.373122 . JSTOR 1748159 . ПМИД 373122 .
- ^ Prival MJ, McCoy EC, Gutter B, Rosendranz HS (январь 1977 г.). «Трис (2,3-дибромпропил) фосфат: мутагенность широко используемого антипирена». Наука . 195 (4273): 76–8. Бибкод : 1977Sci...195...76P . дои : 10.1126/science.318761 . ПМИД 318761 .
- ^ Хаяцу, Хирока (1991), Мутагены в продуктах питания: обнаружение и профилактика , CRC Press , стр. 286 страниц, ISBN 978-0-8493-5877-7
- ^ Тисдейл А (2011). Генотоксичные примеси: стратегии идентификации и контроля . Уайли-Блэквелл. ISBN 978-0-470-49919-1 .
- ^ Тубиана М (сентябрь 1992 г.). «Канцерогенный эффект воздействия малых доз канцерогенов» . Британский журнал промышленной медицины . 49 (9): 601–5. doi : 10.1136/oem.49.9.601 . ПМЦ 1039303 . ПМИД 1390264 .
- ^ Дженкинс Г.Дж., Доак С.Х., Джонсон Г.Е., Квик Э., Уотерс Э.М., Парри Дж.М. (ноябрь 2005 г.). «Существуют ли пороговые значения дозы для генотоксичных алкилирующих агентов?» . Мутагенез . 20 (6): 389–98. дои : 10.1093/mutage/gei054 . ПМИД 16135536 .
- ^ Форман Д. (август 1991 г.). «Эймс, тест Эймса и причины рака» . БМЖ . 303 (6800): 428–9. дои : 10.1136/bmj.303.6800.428 . ПМК 1670593 . ПМИД 1912830 .
- ^ Эймс Б.Н., Голд LS (октябрь 1990 г.). «Химический канцерогенез: слишком много канцерогенов для грызунов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 87 (19): 7772–6. Бибкод : 1990PNAS...87.7772A . дои : 10.1073/pnas.87.19.7772 . ПМК 54830 . ПМИД 2217209 .
- ^ Твомбли Р. (сентябрь 2001 г.). «Федеральный отчет о канцерогенах представляет новый список номинантов» . Журнал Национального института рака . 93 (18): 1372. doi : 10.1093/jnci/93.18.1372 . ПМИД 11562386 .
- ^ Фермер П.Б., Уокер Дж.М. (2006). Молекулярная основа рака . Издательство Кригер. ISBN 978-0-7099-1044-2 .
- ^ Хакура А., Сузуки С., Сато Т. (январь 1999 г.). «Преимущество использования печени S9 человека в тесте Эймса». Мутационные исследования . 438 (1): 29–36. дои : 10.1016/s1383-5718(98)00159-4 . ПМИД 9858674 .
- ^ Хакура А., Сузуки С., Сато Т. (2004). «Улучшение теста Эймса с использованием препарата S9 печени человека». Ян З., Колдуэлл Дж. (ред.). Оптимизация поиска лекарств: методы in vitro . Методы фармакологии и токсикологии. Хумана Пресс. ISBN 978-1-58829-332-9 .
- ^ Бриджес, бакалавр искусств (ноябрь 1980 г.). «Тест на колебания». Архив токсикологии . 46 (1–2): 41–4. дои : 10.1007/BF00361244 . ПМИД 7235997 . S2CID 23769437 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Филлипсон, Кэролайн Э.; Иоаннидес, Костас (1 марта 1989 г.). «Метаболическое действие полициклических ароматических углеводородов на мутагены в тесте Эймса у различных видов животных, включая человека». Мутационные исследования/Фундаментальные и молекулярные механизмы мутагенеза . 211 (1): 147–151. дои : 10.1016/0027-5107(89)90115-2 . ISSN 0027-5107 . ПМИД 2493576 .
- Маккиннелл Р.Г. (06 ноября 2015 г.). Понимание, профилактика и контроль рака у человека: историческая работа и жизнь Элизабет Каверт Миллер и Джеймса А. Миллера . БРИЛЛ. ISBN 9789004286801 .
- Клэкстон LD, Умбузейро GD, ДеМарини DM (ноябрь 2010 г.). «Анализ мутагенности сальмонелл: стетоскоп генетической токсикологии XXI века» . Перспективы гигиены окружающей среды . 118 (11): 1515–22. дои : 10.1289/ehp.1002336 . ПМЦ 2974687 . ПМИД 20682480 .
