Кометный анализ
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( май 2014 г. ) |
Анализ гель-электрофореза одиночных клеток ( SCGE , также известный как анализ кометы ) представляет собой несложный и чувствительный метод обнаружения повреждений ДНК на уровне отдельной эукариотической клетки . Впервые он был разработан Östling & Johansson в 1984 году и позже модифицирован Сингхом и др. в 1988 году. [ 1 ] С тех пор его популярность в качестве стандартного метода оценки повреждения/восстановления ДНК, биомониторинга и тестирования генотоксичности возросла. Он включает инкапсуляцию клеток в суспензию агарозы с низкой температурой плавления, лизис клеток в нейтральных или щелочных (рН>13) условиях и электрофорез суспендированных лизированных клеток. Термин «комета» относится к характеру миграции ДНК через гель для электрофореза, который часто напоминает комету. [ 2 ] [ 3 ]
Кометный анализ (гель-электрофорез одноклеточных клеток) представляет собой простой метод измерения разрывов цепей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в эукариотических клетках. Клетки, помещенные в агарозу на предметном стекле микроскопа, лизируются детергентом и высоким содержанием соли с образованием нуклеоидов, содержащих сверхспиральные петли ДНК, связанные с ядерным матриксом. Электрофорез при высоком pH приводит к образованию структур, напоминающих кометы, наблюдаемых с помощью флуоресцентной микроскопии; интенсивность хвоста кометы относительно головы отражает количество разрывов ДНК. Вероятная причина этого заключается в том, что петли, содержащие разрыв, теряют свою сверхспиральность и могут свободно расширяться к аноду. За этим следует визуальный анализ с окрашиванием ДНК и расчетом флуоресценции для определения степени повреждения ДНК. Это можно выполнить вручную или автоматически с помощью программного обеспечения для обработки изображений. [ 4 ] [ 5 ]
Процедура
[ редактировать ] |
Инкапсуляция
[ редактировать ]Образец клеток, полученный либо из in vitro культуры клеток , либо от испытуемого in vivo, диспергируют в отдельные клетки и суспендируют в расплавленной агарозе с низкой температурой плавления при 37 °C. Эту моносуспензию отливают на предметное стекло микроскопа . стекло Покровное удерживают под углом, а моносуспензию наносят на точку соприкосновения покровного стекла и предметного стекла. Когда покровное стекло опускают на предметное стекло, расплавленная агароза растекается, образуя тонкий слой. Агарозу превращают в гель при 4°С и покровное стекло удаляют.
Агароза образует матрицу из углеводных волокон, которая инкапсулирует клетки, закрепляя их на месте. Агароза считается осмотически нейтральной, поэтому растворы могут проникать в гель и воздействовать на клетки без изменения положения клеток.
В исследовании in vitro клетки будут подвергаться воздействию тестируемого агента – обычно ультрафиолетового света , ионизирующего излучения или генотоксичного химического вещества – чтобы вызвать повреждение ДНК в инкапсулированных клетках. Для калибровки , обычно используется перекись водорода чтобы обеспечить стандартизированный уровень повреждения ДНК.
Лизис
[ редактировать ]клеток Затем предметные стекла погружают в раствор, который вызывает лизис . Раствор для лизиса, часто используемый в кометном анализе, состоит из высококонцентрированной водной соли (часто обычную поваренную соль можно использовать ) и детергента (например, тритона X-100 или саркозината ). pH . лизирующего раствора можно регулировать (обычно между нейтральным и щелочным pH) в зависимости от типа повреждения, которое исследует исследователь
Водная соль разрушает белки и структуру их связей внутри клетки, а также нарушает содержание РНК в клетке. Моющее средство растворяет клеточные мембраны . Под действием лизирующего раствора клетки разрушаются. Все белки, РНК, мембраны, цитоплазматические и нуклеоплазматические компоненты разрушаются и диффундируют в агарозный матрикс. Остается только ДНК клетки, которая распадается, заполняя полость в агарозе, которую раньше заполняла вся клетка. Эта структура называется нуклеоидом (общий термин для структуры, в которой сконцентрирована ДНК).
Электрофорез
[ редактировать ]После лизиса клеток (обычно 1–2 часа при 4 °C) предметные стекла промывают дистиллированной водой для удаления всех солей и погружают во второй раствор – раствор для электрофореза . Опять же, pH этого раствора можно регулировать в зависимости от типа исследуемого повреждения.
Слайды оставляют на ~20 минут в растворе для электрофореза перед электрического поля применением . В щелочных условиях двойная спираль ДНК денатурируется и нуклеоид становится одноцепочечным.
Прикладывается электрическое поле (обычно 1 В / см ) на ~20 минут. Затем предметные стекла нейтрализуют до pH 7, окрашивают ДНК-специфическим флуоресцентным красителем и анализируют с помощью микроскопа с присоединенной ПЗС-матрицей ( устройство с зарядовой связью – по сути, цифровая камера ), которая подключена к компьютеру с программным обеспечением для анализа изображений .
Фон
[ редактировать ]Концепция, лежащая в основе анализа SCGE, заключается в том, что неповрежденная ДНК сохраняет высокоорганизованную связь с белками матрикса в ядре. При повреждении эта организация нарушается. Отдельные нити ДНК теряют компактную структуру и расслабляются, расширяясь из полости в агарозу. При приложении электрического поля ДНК, имеющая общий отрицательный заряд, притягивается к положительно заряженному аноду. Неповрежденные нити ДНК слишком велики и не покидают полости, тогда как чем мельче фрагменты, тем дальше они могут свободно перемещаться за данный промежуток времени. Следовательно, количество ДНК, покидающее полость, является мерой степени повреждения ДНК в клетке.
Анализ изображения измеряет общую интенсивность флуоресценции всего нуклеоида и флуоресценции мигрированной ДНК и сравнивает два сигнала. Чем сильнее сигнал от мигрировавшей ДНК, тем больше повреждений. Общая структура напоминает комету (отсюда и «анализ кометы») с круглой головой, соответствующей неповрежденной ДНК, которая остается в полости, и хвостом поврежденной ДНК. Чем ярче и длиннее хвост, тем выше уровень урона.
Кометный анализ является универсальным методом обнаружения повреждений и с корректировками протокола может использоваться для количественной оценки наличия широкого спектра повреждений (повреждений), изменяющих ДНК. Обычно обнаруживаемые повреждения представляют собой одноцепочечные разрывы и двухцепочечные разрывы. Иногда указывается [ 6 ] [ 7 ] что для обнаружения одноцепочечных разрывов необходимы щелочные условия и полная денатурация ДНК. Однако это не так: в нейтральных условиях также обнаруживаются как однонитевые, так и двухцепочечные разрывы. [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] Однако в щелочных условиях в качестве повреждения ДНК обнаруживаются дополнительные структуры ДНК: сайты AP (основные сайты, в которых отсутствует пиримидиновый или пуриновый нуклеотид ) и сайты, где эксцизионная репарация . происходит [ 12 ] [ 13 ]
Анализ кометы — чрезвычайно чувствительный анализ повреждения ДНК. С этой чувствительностью следует обращаться осторожно, поскольку она также уязвима к физическим изменениям, которые могут повлиять на воспроизводимость результатов. По сути, следует избегать всего, что может вызвать повреждение или денатурацию ДНК, за исключением исследуемого фактора(ов). [ 14 ] Наиболее распространенной формой анализа является щелочная версия, хотя окончательного протокола щелочного анализа пока не существует. Благодаря простой и недорогой установке его можно использовать в условиях, когда более сложные анализы недоступны.
Приложения
[ редактировать ]К ним относятся испытания на генотоксичность, биомониторинг человека и молекулярная эпидемиология, экогенотоксикология, а также фундаментальные исследования повреждений и репарации ДНК. [ 15 ] Например, Суэйн и Рао, используя анализ комет [ 16 ] сообщили о заметном увеличении нескольких типов повреждений ДНК в нейронах и астроцитах головного мозга крыс во время старения , включая одноцепочечные разрывы, двухцепочечные разрывы и модифицированные основания (8-OHdG и урацил).
Фрагментация ДНК спермы
[ редактировать ]Кометный анализ может определить степень фрагментации ДНК в сперматозоидах. Степень фрагментации ДНК была связана с результатами экстракорпорального оплодотворения . [ 17 ] [ 18 ]
Комету модифицировали для использования со сперматозоидами в качестве инструмента диагностики мужского бесплодия. [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]
Чтобы разрушить эти прочно связанные белки протамина и использовать комету в качестве спермы, необходимы дополнительные шаги в протоколе деконденсации. [ 20 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Сингх, Нарендра П.; Маккой, Майкл Т.; Тайс, Раймонд Р.; Шнайдер, Эдвард Л. (1 марта 1988 г.). «Простой метод количественного определения низких уровней повреждения ДНК в отдельных клетках» . Экспериментальные исследования клеток . 175 (1): 184–191. дои : 10.1016/0014-4827(88)90265-0 . ISSN 0014-4827 . ПМИД 3345800 .
- ^ Тайс, Р.Р. (2000). «Одноклеточный гель/анализ комет: Рекомендации по проведению генетических токсикологических исследований in vitro и in vivo». Экологический и молекулярный мутагенез . 35 (3): 206–21. doi : 10.1002/(SICI)1098-2280(2000)35:3<206::AID-EM8>3.0.CO;2-J . ПМИД 10737956 .
- ^ Нандакумар, С; Парасураман, С; Шанмугам, ММ; Рао, КР; Чанд, П; Бхат, Б.В. (2011). «Оценка повреждения ДНК с помощью гель-электрофореза одиночных клеток (Comet Assay)» . Джей Фармакол Фармакотер . 2 (2): 107–11. дои : 10.4103/0976-500X.81903 . ПМК 3127337 . ПМИД 21772771 .
- ^ Коллинз, Арканзас (март 2004 г.). «Кометный анализ повреждений и восстановления ДНК: принципы, применение и ограничения» . Мол. Биотехнология . 26 (3): 249–61. дои : 10.1385/МБ:26:3:249 . ПМИД 15004294 . S2CID 34355649 .
- ^ Нандакумар, С; Парасураман, С; Шанмугам, ММ; Рао, КР; Чанд, П; Бхат, Б.В. (апрель 2011 г.). «Оценка повреждения ДНК с использованием одноклеточного гель-электрофореза (Comet Assay)» . Джей Фармакол Фармакотер . 2 (2): 107–11. дои : 10.4103/0976-500X.81903 . ПМК 3127337 . ПМИД 21772771 . Архивировано из оригинала 26 октября 2018 г. Проверено 5 декабря 2013 г.
- ^ Пу, Синьчжу; Ван, Земин; Клауниг, Джеймс Э. (6 августа 2015 г.). «Анализ щелочной кометы для оценки повреждения ДНК в отдельных клетках». Современные протоколы в токсикологии . 65 : 3.12.1–11. дои : 10.1002/0471140856.tx0312s65 . ISBN 978-0471140856 . ISSN 1934-9262 . ПМИД 26250399 . S2CID 6105193 .
- ^ Мёллер, Питер (апрель 2006 г.). «Анализ щелочной кометы: к проверке биомониторинга повреждающих ДНК воздействий» . Базовая и клиническая фармакология и токсикология . 98 (4): 336–345. дои : 10.1111/j.1742-7843.2006.pto_167.x . ISSN 1742-7835 . ПМИД 16623855 .
- ^ Беляев Игорь Юрьевич; Эрикссон, Стефан; Нигрен, Йонас; Торудд, Джеспер; Хармс-Рингдал, Матс (5 августа 1999 г.). «Влияние бромистого этидия на организацию петель ДНК в лимфоцитах человека, измеренное с помощью зависимости аномальной вязкости от времени и гель-электрофореза отдельных клеток». Acta биохимии и биофизики (BBA) – общие предметы 1428 (2–3): 348–356. дои : 10.1016/S0304-4165(99) 00076-8 ISSN 0304-4165 . ПМИД 10434054 .
- ^ Олив, Польша; Банат, Япония; Дюран, Р.Э. (апрель 1990 г.). «Гетерогенность радиационно-индуцированного повреждения и восстановления ДНК в опухолевых и нормальных клетках, измеренная с помощью анализа «комета». Радиационные исследования . 122 (1): 86–94. Бибкод : 1990РадР..122...86О . дои : 10.2307/3577587 . ISSN 0033-7587 . JSTOR 3577587 . ПМИД 2320728 .
- ^ Пауэлл, С.; Макмиллан, Ти Джей (1 октября 1990 г.). «Повреждение и восстановление ДНК после лечения ионизирующим излучением» . Лучевая терапия и онкология . 19 (2): 95–108. дои : 10.1016/0167-8140(90)90123-E . ISSN 0167-8140 . ПМИД 2255771 .
- ^ Воеводска, Мария; Бурачевска, Ивона; Крушевский, Марцин (27 июня 2002 г.). «Модифицированный анализ нейтральной кометы: устранение лизиса при высокой температуре и проверка анализа с использованием антител против одноцепочечной ДНК». Мутационные исследования . 518 (1): 9–20. дои : 10.1016/s1383-5718(02)00070-0 . ISSN 0027-5107 . ПМИД 12063063 .
- ^ Коллинз, Эндрю Р. (29 апреля 1997 г.). «Анализ кометы: что он на самом деле может нам сказать?». Мутационные исследования/Фундаментальные и молекулярные механизмы мутагенеза . 375 (2): 183–193. дои : 10.1016/S0027-5107(97)00013-4 . ISSN 0027-5107 . ПМИД 9202728 .
- ^ Гедик, CM; Юэн, Юго-Запад; Коллинз, Арканзас (сентябрь 1992 г.). «Одноклеточный гель-электрофорез, применяемый для анализа повреждений УФ-С и их восстановления в клетках человека». Международный журнал радиационной биологии . 62 (3): 313–320. дои : 10.1080/09553009214552161 . ISSN 0955-3002 . ПМИД 1356133 .
- ^ Теоретические и практические ограничения анализа обсуждаются, например, в Klaude et al. (1996) и Коллинз и др. (1997).
- ^ https://www2.le.ac.uk/departments/csmm/.../SCG%20Electrophoresis.pdf [ постоянная мертвая ссылка ]
- ^ Суэйн, Ю; Субба Рао, К. (август 2011 г.). «Изучение повреждения ДНК с помощью кометного анализа и активности эксцизионной репарации в нейронах и астроцитах головного мозга крысы во время старения». Разработчик старения мехов. 132 (8–9): 374–81. doi:10.1016/j.mad.2011.04.012. PMID 21600238. S2CID 22466782
- ^ Саймон Л., Брунборг Г., Стивенсон М., Латтон Д., Макманус Дж., Льюис С.Э. (май 2010 г.). «Клиническое значение повреждения ДНК сперматозоидов в результатах вспомогательной репродукции» . Хум Репрод . 25 (7): 1594–1608. дои : 10.1093/humrep/deq103 . ПМИД 20447937 .
- ^ Награджаппа; Гангулы, Анутош; Госвами, Уша (2006). «Повреждение ДНК в клетках мужских половых желез зеленых мидий (Perna viridis) при воздействии табачных изделий». Экотоксикология . 15 (4): 365–369. дои : 10.1007/s10646-006-0077-1 . ПМИД 16673160 . S2CID 13956778 .
- ^ Хьюз CM, Льюис СЭМ, МакКелви-Мартин В., Томпсон В. Воспроизводимость измерений ДНК спермы человека с использованием анализа гель-электрофореза одной клетки. Mutation Research 1997 374:261-268.
- ^ Jump up to: а б Доннелли, ET; МакКлюр, Н.; Льюис, SEM (1999). «Влияние добавок аскорбата и @-токоферола in vitro на целостность ДНК и повреждение ДНК, вызванное перекисью водорода, в сперматозоидах человека» . Мутагенез . 14 (5): 505–511. дои : 10.1093/mutage/14.5.505 . ПМИД 10473655 .
- ^ Рибас-Майну Хорди, Агустин Гарсиа-Пейро, Альба Фернандес-Энсинас, Мария Хосе Аменгуаль и Бенет Хорди Двунитевые разрывы ДНК сперматозоидов, измеренные с помощью анализа Comet, связаны с необъяснимым привычным выкидышем у пар без женского фактора
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Дхаван и Андерсон (2009): Анализ комет в токсикологии. дои : 10.1039/9781847559746
- Авишай, Нантаван; Рабиновиц, Клодетт; Моисеева, Елизавета; Ринкевич, Барух (2002). «Генотоксичность реки Кишон, Израиль: применение клеточного анализа in vitro ». Мутационные исследования . 518 (1): 21–37. дои : 10.1016/S1383-5718(02)00069-4 . ПМИД 12063064 .
- Коллинз, Арканзас; Добсон, В.Л.; Дусинска, М.; Кеннеди, Дж.; Стетина, Р. (1997). «Анализ кометы: что он на самом деле может нам сказать?». Мутационные исследования . 375 (2): 183–193. дои : 10.1016/S0027-5107(97)00013-4 . ПМИД 9202728 .
- Клод, М.; Эрикссон, С.; Нигрен, Дж.; Анстрем, Г. (1996). «Анализ кометы: механизмы и технические соображения». Мутационные исследования . 363 (2): 89–96. дои : 10.1016/0921-8777(95)00063-1 . ПМИД 8676929 .
- МакКелви-Мартин, Валери Дж.; Хо, Эдвин Т.; Маккеун, Стефани Р.; Джонстон, С. Робин; Маккарти, Пэтси Дж.; Раджаб, Нор Фасила; Даунс, К. Стивен (1993). «Новые применения анализа одноклеточного гель-электрофореза (Comet). I. Лечение инвазивной переходноклеточной карциномы мочевого пузыря человека. II. Флуоресцентная гибридизация in situ Comets для идентификации поврежденных и восстановленных последовательностей ДНК в отдельных клетках» . Мутагенез . 13 (1): 1–8. дои : 10.1093/mutage/13.1.1 . ПМИД 9491387 .
- Олив, Польша; Влодек, Д.; Банат, JP (1991). «Двухнитевые разрывы ДНК, измеренные в отдельных клетках, подвергнутых гель-электрофорезам» (PDF) . Исследования рака . 51 (17): 4671–4676. ПМИД 1873812 .
- Рохас, Э.; Лопес, MC; Вальверде, М. (1999). «Одноклеточный гель-электрофорез: методология и применение». Журнал хроматографии Б. 722 (1–2): 225–254. дои : 10.1016/S0378-4347(98)00313-2 . ПМИД 10068143 .
- Сингх, НП; Маккой, Монтана; Тайс, РР; Шнайдер, Э.Л. (1988). «Простой метод количественного определения низких уровней повреждения ДНК в отдельных клетках» . Экспериментальные исследования клеток . 175 (1): 184–191. дои : 10.1016/0014-4827(88)90265-0 . ПМИД 3345800 .
- Тайс, РР; Агурелл, Э.; Андерсон, Д.; Берлинсон, Б.; Хартманн, А.; Кобаяши, Х.; Миямаэ, Ю.; Рохас, Э.; Рю, Ж.-К.; Сасаки, Ю.Ф. (2000). «Одноклеточный гель/анализ комет: рекомендации по проведению генетических токсикологических исследований in vitro и in vivo». Экологический и молекулярный мутагенез . 35 (3): 206–221. doi : 10.1002/(SICI)1098-2280(2000)35:3<206::AID-EM8>3.0.CO;2-J . ПМИД 10737956 .
