фрагментация ДНК
Фрагментация ДНК — это разделение или разрыв цепей ДНК на части. Это может быть сделано намеренно персоналом лаборатории или клетками или может произойти спонтанно. Спонтанная или случайная фрагментация ДНК — это фрагментация, которая постепенно накапливается в клетке. Его можно измерить, например, с помощью анализа Comet или TUNEL .
Его основной единицей измерения является индекс фрагментации ДНК (DFI). [ 1 ] DFI 20% и более значительно снижает вероятность успеха после ИКСИ. [ 1 ]
Фрагментация ДНК была впервые зарегистрирована Уильямсоном в 1970 году, когда он наблюдал дискретные олигомерные фрагменты, возникающие во время гибели клеток в первичных культурах печени новорожденных. Он описал цитоплазматическую ДНК, выделенную из клеток печени мыши после культивирования, характеризующуюся фрагментами ДНК с молекулярной массой , кратной 135 кДа . Это открытие согласовывалось с гипотезой о том, что эти фрагменты ДНК являются специфическим продуктом деградации ядерной ДНК. [ 2 ]
Преднамеренный
[ редактировать ]Фрагментация ДНК часто необходима перед созданием библиотеки или субклонированием последовательностей ДНК. При фрагментации ДНК лабораторным персоналом использовались различные методы, включающие механическое разрушение ДНК. Такие методы включают обработку ультразвуком, сдвиг иглы, распыление, точечный сдвиг и пропускание через камеру давления. [ 3 ]
- Рестрикционный дайджест — это преднамеренное лабораторное разрушение нитей ДНК. Это метод лечения на основе ферментов, используемый в биотехнологии для разрезания ДНК на более мелкие нити с целью изучения различий в длине фрагментов у разных людей или для клонирования генов. [ 4 ] Этот метод фрагментирует ДНК либо путем одновременного расщепления обеих цепей, либо путем создания разрывов на каждой цепи дцДНК с образованием разрывов дцДНК. [ 5 ]
- Акустический сдвиг передачи высокочастотных акустических энергетических волн, доставленных в библиотеку ДНК. Преобразователь имеет чашеобразную форму, благодаря чему волны сходятся к интересующей цели. [ 5 ]
- При распылении ДНК проходит через небольшое отверстие в распылителе , что приводит к образованию мелкодисперсного тумана, который собирается. Размер фрагмента определяется давлением газа, используемого для проталкивания ДНК через распылитель, скоростью, с которой раствор ДНК проходит через отверстие, вязкостью раствора и температурой. [ 5 ] [ 6 ]
- Обработка ультразвуком , тип гидродинамического сдвига, подвергает ДНК акустической кавитации и гидродинамическому сдвигу путем воздействия коротких периодов обработки ультразвуком, что обычно приводит к образованию фрагментов размером 700 п.о. Для фрагментации ДНК обработка ультразвуком обычно применяется во время импульсных циклов с использованием ультразвукового аппарата зондового типа. [ 7 ]
- Точечный сдвиг, тип гидродинамического сдвига, использует шприцевой насос для создания гидродинамических сил сдвига, проталкивая библиотеку ДНК через небольшое резкое сокращение. Около 90% длин фрагментов попадают в двукратный диапазон. [ 5 ]
- Срез иглы создает силы сдвига за счет пропускания библиотек ДНК через иглу небольшого размера. [ 5 ] ДНК несколько раз пропускают через измерительную иглу, чтобы физически разорвать ДНК на мелкие кусочки.
- Французские клетки давления пропускают ДНК через узкий клапан под высоким давлением, создавая высокие силы сдвига. [ 5 ] Во френч-прессе усилие сдвига можно тщательно модулировать, регулируя давление поршня. Пресс обеспечивает один проход через точку максимальной силы сдвига, ограничивая повреждение деликатных биологических структур из-за повторного сдвига, как это происходит при других методах разрушения.
- При фрагментации (тагментации), опосредованной транспозомами, транспозомы готовятся из ДНК, которую затем разрезают, так что события транспозиции приводят к фрагментации ДНК с адаптерами (вместо вставки). Относительная концентрация транспосом и ДНК должна быть соответствующей.
Спонтанный
[ редактировать ]Апоптозная фрагментация ДНК — это естественная фрагментация, которую клетки выполняют при апоптозе (запрограммированной гибели клеток). Фрагментация ДНК является биохимическим признаком апоптоза . В умирающих клетках ДНК расщепляется эндонуклеазой, которая фрагментирует хроматин на нуклеосомные единицы, которые кратны олигомерам длиной около 180 п.н. и при анализе в агарозном геле выглядят как лестница ДНК. [ 8 ] Ферментом , ответственным за апоптотическую фрагментацию ДНК, является ДНКаза, активируемая каспазой . CAD обычно ингибируется другим белком, ингибитором каспазо-активируемой ДНКазы (ICAD) . Во время апоптоза эффекторная каспаза апоптоза, каспаза 3, расщепляет ICAD и, таким образом, вызывает активацию CAD. [ 9 ]
CAD расщепляет ДНК в межнуклеосомных линкерных сайтах между нуклеосомами, белоксодержащими структурами, которые встречаются в хроматине с интервалами ~ 180 п.н. Это связано с тем, что ДНК обычно плотно обернута вокруг гистонов, основных белков нуклеосом. Линкерные сайты — единственные части цепи ДНК, которые открыты и, следовательно, доступны для CAD.
Мужчины с дефектами подвижности сперматозоидов часто имеют высокий уровень фрагментации ДНК сперматозоидов. [ 10 ] Степень фрагментации ДНК в сперматозоидах может предсказать исход экстракорпорального оплодотворения [ 11 ] (ЭКО) и его расширение, интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида [ 1 ] (ИКСИ). Тест на дисперсию хроматина сперматозоидов (SCD) и анализ TUNEL эффективны для выявления повреждений ДНК сперматозоидов. [ 12 ] [ 13 ] При использовании микроскопии светлого поля тест SCD оказывается более чувствительным, чем анализ TUNEL. [ 13 ]
Использование
[ редактировать ]Фрагментация ДНК играет важную роль в судебной экспертизе, особенно в профилировании ДНК .
- Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) — это метод анализа фрагментов ДНК различной длины, образующихся в результате расщепления образца ДНК эндонуклеазой рестрикции . Эндонуклеаза рестрикции разрезает ДНК по определенному образцу последовательности, известному как сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции. Наличие или отсутствие определенных сайтов узнавания в образце ДНК приводит к образованию фрагментов ДНК различной длины, которые разделяются с помощью гель-электрофореза . Затем их гибридизуют с ДНК-зондами, которые связываются с комплементарной последовательностью ДНК в образце. [ 14 ]
- При анализе полимеразной цепной реакции (ПЦР) создаются миллионы точных копий ДНК из биологического образца. Он используется для амплификации определенной области цепи ДНК (мишени ДНК). Большинство методов ПЦР обычно амплифицируют фрагменты ДНК размером от 0,1 до 10 тысяч пар оснований (кб), хотя некоторые методы позволяют амплифицировать фрагменты размером до 40 кб. [ 14 ] ПЦР также использует тепло для разделения нитей ДНК.
- Фрагментированная при апоптозе ДНК размером от 1 до 20 нуклеосом может быть селективно выделена из клеток, зафиксированных денатурирующим фиксатором этанолом. [ 15 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Спейер Б.Е., Пиззи А.Р., Раньери М., Джоши Р., Деланти Дж.Д., Серхал П. (май 2010 г.). «Падение уровня имплантации после ИКСИ со спермой с высокой фрагментацией ДНК». Хум Репрод . 25 (7): 1609–1618. дои : 10.1093/humrep/deq116 . ПМИД 20495207 .
- ^ Уильямсон, Роберт (1970). «Свойства быстро меченых фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенных из цитоплазмы первичных культур эмбриональных клеток печени мыши». Журнал молекулярной биологии . 51 (1): 157–168. дои : 10.1016/0022-2836(70)90277-9 . ПМИД 5481278 .
- ^ Перепел, Майкл Эндрю (2010). «ДНК: Механический разрыв». Энциклопедия наук о жизни . дои : 10.1002/9780470015902.a0005333.pub2 . ISBN 978-0470016176 .
- ^ Филлипс, Тереза. «Объяснение ферментов рестрикции» . Биотехнологии/Биомедицина . О сайте.com. Архивировано из оригинала 5 июня 2016 года . Проверено 2 апреля 2013 г.
- ^ Jump up to: а б с д и ж «Фрагментация ДНК» . Биолаборатории Новой Англии. Архивировано из оригинала 20 декабря 2016 года . Проверено 2 апреля 2013 г.
- ^ Сэмбрук, Джозеф; Рассел, Дэвид В. (2006). «Фрагментация ДНК распылением» . Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2006 (23). Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор: pdb.prot4539. дои : 10.1101/pdb.prot4539 . ПМИД 22485920 . Проверено 3 апреля 2013 г.
- ^ «Ультразвуковой лизис: разрушение клеток и фрагментация извлечения» . Проверено 15 мая 2017 г.
- ^ Нагата С. (апрель 2000 г.). «Апоптотическая фрагментация ДНК». Эксп. Сотовый Res . 256 (1): 12–8. дои : 10.1006/excr.2000.4834 . ПМИД 10739646 .
- ^ Энари, Три; Сакахира, Хидеки; Ёкояма, Хидеки; Окава, Кацуя; Ивамацу, Акихиро; Нагата Сигекадзу (январь 1998 г.). «ДНКаза, активируемая каспазой, которая разрушает ДНК во время апоптоза, и ее ингибитор ICAD» . Природа 391 (6662): 43–50. Бибкод : 1998Nature.391...43E . дои : 10.1038/34112 . ПМИД 9422506 . S2CID 4407426 . Получено 8 апреля.
- ^ Беллок С., Бенхалифа М., Коэн-Бакри М., Даллеак А., Шахин Х., Амар Э., Зини А. (2014). «Какие изолированные аномалии спермы больше всего связаны с повреждением ДНК сперматозоидов у мужчин, обращающихся на обследование по поводу бесплодия» . Дж. Ассистент. Репродукция. Жене . 31 (5): 527–32. дои : 10.1007/s10815-014-0194-3 . ПМК 4016368 . ПМИД 24566945 .
- ^ Саймон Л., Брунборг Г., Стивенсон М., Латтон Д., Макманус Дж., Льюис С.Э. (май 2010 г.). «Клиническое значение повреждения ДНК сперматозоидов в результатах вспомогательной репродукции» . Хум Репрод . 25 (7): 1594–1608. дои : 10.1093/humrep/deq103 . ПМИД 20447937 .
- ^ Горчица В, Траганос Ф, Есионовска Х, Дажинкевич З (1993). «Наличие разрывов нитей ДНК и повышенная чувствительность ДНК in situ к денатурации в аномальных сперматозоидах человека. Аналогия с апоптозом соматических клеток». Exp Cell Res . 207 (1): 202–205. дои : 10.1006/excr.1993.1182 . ПМИД 8391465 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Jump up to: а б Чжан Л.Х., Цю Ю, Ван К.Х., Ван Ц, Тао Дж., Ван Л.Г. (июнь 2009 г.). «Измерение фрагментации ДНК сперматозоидов с помощью микроскопии светлого поля: сравнение теста на дисперсию хроматина сперматозоидов и анализа концевого мечения уридина» . Плодородный. Стерильный . 94 (3): 1027–1032. doi : 10.1016/j.fertnstert.2009.04.034 . ПМИД 19505686 .
- ^ Jump up to: а б «ДНК-криминалистика» . Программы генома Министерства энергетики США . Проверено 8 апреля 2013 г.
- ^ Гонг Дж.П., Траганос Ф., Дажинкевич З. (1994). «Селективная процедура экстракции ДНК из апоптотических клеток, применимая для гель-электрофореза и проточной цитометрии». Анальная биохимия . 218 (2): 314–319. дои : 10.1006/abio.1994.1184 . ПМИД 8074286 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
