Апоптозная фрагментация ДНК
 | Эту статью может потребовать очистки Википедии , чтобы она соответствовала стандартам качества . ( февраль 2012 г. ) |
Апоптозная фрагментация ДНК является ключевой особенностью апоптоза , типа запрограммированной гибели клеток . Апоптоз характеризуется активацией эндогенных эндонуклеаз , в частности ДНКазы, активируемой каспазой-3 (CAD). [ 1 ] с последующим расщеплением ядерной ДНК на межнуклеосомные фрагменты длиной примерно 180 пар оснований (п.н.) и кратных им (360, 540 и т. д.). Апоптозная фрагментация ДНК используется в качестве маркера апоптоза и для идентификации апоптотических клеток либо с помощью анализа лестничной ДНК , [ 2 ] TUNEL -анализ , [ 3 ] [ 4 ] или путем обнаружения клеток с фракционным содержанием ДНК («клетки субG1 » ) на гистограммах частоты содержания ДНК, например, как в анализе Николетти . [ 5 ] [ 6 ]
Механизм
[ редактировать ]Ферментом, ответственным за апоптотическую фрагментацию ДНК, является С- D аспазой активируемая - наза (CAD) . CAD обычно ингибируется другим белком, ингибитором C аспазы - , активируемой назой D- (ICAD) . Во время апоптоза эффекторная каспаза апоптоза, каспаза-3 , расщепляет ICAD и, таким образом, вызывает активацию CAD. [ 7 ]
CAD расщепляет ДНК в межнуклеосомных линкерных сайтах между нуклеосомами , белоксодержащими структурами, которые встречаются в хроматине с интервалами ~ 180 п.н. Это связано с тем, что ДНК обычно плотно обернута вокруг гистонов , основных белков нуклеосом. Линкерные сайты — единственные части цепи ДНК, которые открыты и, следовательно, доступны для CAD.
Деградация ядерной ДНК на нуклеосомные единицы является одним из признаков апоптотической гибели клеток. Это происходит в ответ на различные апоптотические стимулы в самых разных типах клеток. Молекулярная характеристика этого процесса выявила специфическую ДНКазу (CAD, каспазо-активируемая ДНКаза), которая расщепляет хромосомную ДНК каспазозависимым образом. CAD синтезируется с помощью ICAD (ингибитора CAD), который действует как специфический шаперон для CAD и обнаруживается в комплексе с ICAD в пролиферирующих клетках. Когда клетки подвергаются апоптозу, каспаза 3 расщепляет ICAD, диссоциируя комплекс CAD:ICAD, позволяя CAD расщеплять хромосомную ДНК. Таким образом, клетки, в которых отсутствует ICAD или которые экспрессируют мутантный ICAD, устойчивый к каспазам, не демонстрируют фрагментации ДНК во время апоптоза, хотя они проявляют некоторые другие особенности апоптоза и умирают.
Несмотря на то, что было проведено много работ по анализу апоптотических событий, доступно мало информации, позволяющей связать время появления морфологических особенностей на поверхности клетки и в ядре с биохимической деградацией ДНК в тех же клетках. Апоптоз может быть инициирован множеством различных механизмов в разных типах клеток, и кинетика этих событий широко варьируется: от нескольких минут до нескольких дней в зависимости от клеточной системы. Наличие или отсутствие конкретных апоптотических событий, включая фрагментацию ДНК, зависит от «временного окна», в котором исследуется кинетический процесс апоптоза. Часто это может усложнить идентификацию апоптотических клеток, если популяции клеток анализируются только в один момент времени, например, после индукции апоптоза.
Историческая справка
[ редактировать ]Открытие межнуклеосомной фрагментации геномной ДНК до регулярных повторяющихся олигонуклеосомных фрагментов, генерируемых Ca/Mg-зависимой эндонуклеазой, считается одним из наиболее изученных биохимических маркеров апоптоза ( запрограммированной гибели клеток).
В 1970 году Уильямсон описал, что цитоплазматическая ДНК, выделенная из клеток печени мыши после культивирования, характеризовалась фрагментами ДНК с молекулярной массой, кратной 135 кДа . Это открытие согласовывалось с гипотезой о том, что эти фрагменты ДНК являются специфическим продуктом деградации ядерной ДНК. [ 8 ] В 1972 году Керр , Уилли и Карри ввел термин «апоптоз» и отличил этот тип гибели клеток от некроза на основании морфологических особенностей. [ 9 ] В 1973 году Хьюиш и Бургойн при изучении структуры субхроматина обнаружил, что хроматин доступен для Са ++ /Мг ++ эндонуклеазой, что приводит к образованию продукта переваривания с регулярным рядом молекулярных масс, подобных ранее описанному Уильямсоном (1970). [ 10 ] В 1974 году Уильямс , Маленький , и Шипли , используя клетки, подвергшиеся самым разным типам травм, обнаружил, что во время гибели клеток деградированная ДНК «в каждом случае имела модальное значение от 10(x6) до 10(x7) Дальтон, и для деградации ДНК необходим клеточный метаболизм. ". Однако в этом наблюдении не было указания на то, «было ли разрезание молекулы ДНК случайным или, скорее, на определенном участке, имеющем структурное или функциональное значение». [ 11 ] В 1976 году Шкала , Матясова и. Чейкова описала межнуклеосомную фрагментацию ДНК облученного лимфоидного хроматина in vivo . [ 12 ]
С 1972 по 1978/1980 годы прошло шесть лет до открытия и оценки межнуклеосомной фрагментации ДНК во время апоптотической гибели клеток как признака апоптоза. С 1972 года ( Керр , Уилли и Карри [ 9 ] ), принято считать, что гибель лимфоцитов, вызванная глюкокортикоидами, является формой апоптоза. В 1978 году Захарян и Погосян представил работу, в которой показано, что деградация ДНК, вызванная глюкокортикоидами, в лимфоидной ткани, тимусе и селезенке крыс происходит по специфическому паттерну с образованием фрагментов ДНК, электрофоретически подобных тем, которые наблюдаются после обработки хроматина микрококковой нуклеазой, что указывает на паттерн межнуклеосомного расщепления Деградация ДНК происходила во время апоптоза. [ 13 ] [ 14 ] Таким образом, была обнаружена первая связь между запрограммированной клеточной гибелью/апоптозом и межнуклеосомной фрагментацией ДНК хроматина, которая вскоре стала специфической особенностью апоптоза.
В 1980 году Уилли сообщил о дополнительных доказательствах того, что характер межнуклеосомного расщепления ДНК является специфической особенностью обработанных глюкокортикоидами тимоцитов, подвергающихся апоптозу. [ 2 ] Паттерн межнуклеосомного расщепления ДНК наблюдался как специфическая особенность апоптоза в 1978/1980 годах и с тех пор стал признанным признаком запрограммированной гибели клеток. В 1992 году Горчица и др. [3] и Гавриэли и др. [4] независимо описали анализ фрагментации ДНК , основанный на использовании терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы ( TUNEL ), который стал одним из стандартных методов обнаружения и идентификации апоптотических клеток.
Анализы обнаружения
[ редактировать ]Проточная цитометрия чаще всего используется для обнаружения апоптотической фрагментации ДНК. [ 15 ] Анализ содержания ДНК с помощью проточной цитометрии может идентифицировать апоптотические клетки с фрагментированной ДНК как клетки с фракционным содержанием ДНК, часто называемые клетками суб- G1 . Проточно-цитометрический анализ с использованием флуорохромакридинового оранжевого показывает, что фрагментация ДНК внутри отдельных клеток является прерывистой, что, вероятно, отражает различные уровни ограничения доступности ДНК для ДНКазы на супрануклеосомном и нуклеосомном уровнях структуры хроматина. [ 16 ] Присутствие апоптотических «клеток суб-G1 » также можно обнаружить в клетках, предварительно фиксированных в этаноле , но не после фиксации сшивающими фиксаторами, такими как формальдегид . Поздние апоптотические клетки S и G2 не могут быть обнаружены с помощью этого подхода, поскольку их фракционное содержание ДНК может перекрываться с содержанием ДНК неапоптотических клеток G1 . [ 17 ] Обработка клеток детергентом перед или одновременно с ДНК-флуорохромом также выявляет фрагментацию ДНК вследствие присутствия клеток суб-G1 или клеточных фрагментов, как определено Николетти с соавт. [5]
Апоптотическую фрагментацию ДНК также можно обнаружить с помощью анализа TUNEL . Анализ TUNEL на основе флуорохрома, применимый для проточной цитометрии , коррелирует обнаружение разрывов цепей ДНК с содержанием клеточной ДНК и, следовательно, с клеточного цикла положением фазы . Анализ TUNEL с меткой авидин-пероксидазы применим для светоабсорбционной микроскопии. Многие комплекты, связанные с TUNEL, имеются в продаже. Апоптотическую фрагментацию ДНК также анализируют с помощью в агарозном геле, электрофореза чтобы продемонстрировать ~ 180 п.н. «лестничную» структуру с интервалами [1] С другой стороны, некроз обычно характеризуется случайной фрагментацией ДНК, которая образует «мазок» на агарозном геле.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Сакахира, Х; Энари, М; Нагата, С. (январь 1998 г.). «Расщепление ингибитора CAD при активации CAD и деградации ДНК во время апоптоза». Природа . 391 (6662): 96–9. Бибкод : 1998Natur.391...96S . дои : 10.1038/34214 . ПМИД 9422513 . S2CID 4329685 .
- ^ Jump up to: а б Уилли АХ (10 апреля 1980 г.). «Апоптоз тимоцитов, индуцированный глюкокортикоидами, связан с активацией эндогенной эндонуклеазы». Природа . 284 (5756): 555–556. Бибкод : 1980Natur.284..555W . дои : 10.1038/284555a0 . ISSN 0028-0836 . ПМИД 6245367 . S2CID 4318802 .
- ^ Горчица, Ж; Бруно, С; Дажинкевич, Р; Гонг, Дж; Дажинкевич, З. (ноябрь 1992 г.). «Разрывы цепей ДНК, возникающие во время апоптоза - их раннее обнаружение in situ с помощью анализов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и ник-трансляции и предотвращение с помощью ингибиторов сериновой протеазы». Инт Джей Онкол . 1 (6): 639–48. дои : 10.3892/ijo.1.6.639 . ПМИД 21584593 .
- ^ Гавриэли Ю.; Шерман, Ю.; Бен-Сассон, Ю.А. (1992). «Идентификация запрограммированной гибели клеток in situ посредством специфической маркировки фрагментации ядерной ДНК» . Журнал клеточной биологии . 119 (3): 493–501. дои : 10.1083/jcb.119.3.493 . ПМК 2289665 . ПМИД 1400587 .
- ^ Николетти I, Мильорати Дж, Пальяччи MC, Гриньяни Ф, Риккарди К (3 июня 1991 г.). «Быстрый и простой метод измерения апоптоза тимоцитов путем окрашивания йодидом пропидия и проточной цитометрии». Журнал иммунологических методов . 139 (2): 271–279. дои : 10.1016/0022-1759(91)90198-О . ПМИД 1710634 .
- ^ Риккарди С., Николетти I (9 ноября 2006 г.). «Анализ апоптоза с помощью окрашивания йодидом пропидия и проточной цитометрии». Протоколы природы . 1 (3): 1458–1461. дои : 10.1038/nprot.2006.238 . ПМИД 17406435 . S2CID 4469406 .
- ^ Нагата, С.; Энари, М.; Сакахира, Х.; Ёкояма, Х.; Окава, К.; Ивамацу, А. (1998). «ДНКаза, активируемая каспазой, которая разрушает ДНК во время апоптоза, и ее ингибитор ICAD». Природа 391 (6662): 43–50. Бибкод : 1998Nature.391...43E . дои : 10.1038/34112 . ПМИД 9422506 . S2CID 4407426 .
- ^ Уильямсон, Роберт (14 июля 1970 г.). «Свойства быстро меченых фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенных из цитоплазмы первичных культур эмбриональных клеток печени мыши». Журнал молекулярной биологии . 51 (1): 157–168. дои : 10.1016/0022-2836(70)90277-9 . ISSN 0022-2836 . ПМИД 5481278 .
- ^ Jump up to: а б Керр, Джон Ф.Р.; Уилли, Эндрю ; Карри, Аластер (август 1972 г.). «Апоптоз: основной биологический феномен с широкими последствиями для кинетики тканей» . Британский журнал рака . 26 (4): 239–257. дои : 10.1038/bjc.1972.33 . ISSN 0007-0920 . ПМК 2008650 . ПМИД 4561027 .
- ^ Хьюиш, Дин Р.; Бургойн, Ли А. (15 мая 1973 г.). «Подструктура хроматина. Переваривание ДНК хроматина в регулярно расположенных участках ядерной дезоксирибонуклеазой». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 52 (2): 504–510. дои : 10.1016/0006-291X(73)90740-7 . ISSN 0006-291X . ПМИД 4711166 .
- ^ Уильямс, Джерри Р.; Литтл, Джон Б.; Шипли, Уильям У. (20 декабря 1974 г.). «Связь гибели клеток млекопитающих со специфической эндонуклеолитической деградацией ДНК». Природа . 252 (5485): 754–755. Бибкод : 1974Natur.252..754W . дои : 10.1038/252754a0 . ISSN 0028-0836 . ПМИД 4474604 . S2CID 4181803 .
- ^ Ческова, М.; Матясова, Дж; Чейкова, М (31 декабря 1976 г.). «ДНК в хроматине облученных лимфоидных тканей распадается in vivo на регулярные фрагменты». Письма ФЭБС . 72 (2): 271–274. дои : 10.1016/0014-5793(76)80984-2 . ISSN 0014-5793 . ПМИД 16386038 . S2CID 579849 .
- ^ Захарян, РА; Погосян, Р.Г. (1978). «Глюкокортикоидная индукция деградации ДНК хроматина лимфоцитов на регулярно повторяющиеся фрагменты in vivo ». Доклады Академии наук Армянской ССР . 67 (2): 110–114. ISSN 0366-8606 . КОД: DANAAW, CAN 90:115643 AN 1979:115643 CAPLUS (авторское право ACS, 2003 г.)
- ^ Chemical Abstracts v.90, 1979; 90:115643n стр.112.
- ^ Гаванджи С., Бахтари А., Фамурева А.С., Отман Э.М. (январь 2023 г.). «Цитотоксическая активность растительных лекарственных средств, оцененная in vitro: обзор» . Химия и биоразнообразие . 20 (2): 3–27. дои : 10.1002/cbdv.202201098 . ПМИД 36595710 . S2CID 255473013 .
- ^ Кайстура, М; Халика, HD; Прийма, Дж; Дажинкевич, З (2007). «Прерывистая фрагментация ядерной ДНК во время апоптоза, выявляемая дискретными пиками «суб-G1» на гистограммах содержания ДНК» . Цитометрия А. 71 (3): 125–31. doi : 10.1002/cyto.a.20357 . ПМИД 17252584 .
- ^ Влодкович, Д; Телфорд, В; Скоммер, Дж; Дажинкевич, З (2011). «Апоптоз и не только: цитометрия в исследованиях запрограммированной гибели клеток». Последние достижения в области цитометрии, Часть B – Достижения в области применения . Методы клеточной биологии. Том. 103. Эльзевир. стр. 55–98. дои : 10.1016/B978-0-12-385493-3.00004-8 . ISBN 9780123854933 . ПМЦ 3263828 . ПМИД 21722800 .
{{cite book}}:|journal=игнорируется ( помогите )
- Голд Р., Шмид М., Роте Г., Цишлер Х., Брайтшопф Х., Векерле Х., Лассманн Х. (июль 1993 г.). «Обнаружение фрагментации ДНК при апоптозе: применение ник-трансляции in situ к системам клеточных культур и срезам тканей» . Журнал гистохимии и цитохимии . 41 (7): 1023–1030. дои : 10.1177/41.7.8515045 . ISSN 0022-1554 . ПМИД 8515045 .
- Коллинз Дж. А., Шанди К. А., Янг К. К., Веселый Дж., Уиллингем MC (июль 1997 г.). «Большая фрагментация ДНК — это поздний этап апоптоза» . Журнал гистохимии и цитохимии . 45 (7): 923–934. дои : 10.1177/002215549704500702 . ISSN 0022-1554 . ПМИД 9212818 .
- Нагата, Сигекадзу (10 апреля 2000 г.). «Апоптотическая фрагментация ДНК». Экспериментальные исследования клеток . 256 (1): 12–18. дои : 10.1006/excr.2000.4834 . ISSN 0014-4827 . ПМИД 10739646 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Коркоран, Г.; Фикс, Л.; Джонс, ДП; Мослен, Монтана; Никотера, П.; Оберхаммер, ФА; Буттян, Р. (1994). «Апоптоз: молекулярный контрольный момент токсичности» . Токсикология и прикладная фармакология . 128 (2): 169–181. дои : 10.1006/taap.1994.1195 . ПМИД 7940532 .
- Уокер, PR; Панди, С.; Сикорска, М. (1995). «Деградация хроматина в апоптотических клетках». Смерть клеток и дифференциация . 2 (2): 97–104. ПМИД 17180071 .
- Уокер, PR; Сикорска, М. (1994). «Активность эндонуклеазы, структура хроматина и деградация ДНК при апоптозе». Биохимия и клеточная биология . 72 (11–12): 615–623. дои : 10.1139/o94-081 . ПМИД 7654335 .
- Панди, С.; Уокер, PR; Сикорска, М. (1994). «Отдельные пулы эндонуклеазной активности ответственны за межнуклеосомную и высокомолекулярную фрагментацию ДНК во время апоптоза». Биохимия и клеточная биология . 72 (11–12): 625–629. дои : 10.1139/o94-082 . ПМИД 7654336 .
- Муньос, Э.; Маркос, А.; Унзага, Монтана (1981). «Влияние дефицита белка на активность лизосомальных ферментов селезенки и тимуса крыс-отъемышей». Журнал питания . 111 (12): 2133–2141. дои : 10.1093/jn/111.12.2133 . ПМИД 7310538 .
- Варела П., Маркос А., Рей де Виньяс Х.Л. (1985). «Влияние лечения кортизолом у беременных крыс на клеточный рост потомства». ИРКС Медицинские науки . 13 : 412–413.
