НЕЙЛ-МС

NAIL-MS (сокращение от « нуклеиновых кислот с мечением изотопов связанная масс-спектрометрия ») — метод, основанный на масс-спектрометрии, используемый для исследования нуклеиновых кислот и их модификаций . Это позволяет проводить различные эксперименты для изучения основного механизма биологии РНК in vivo . Например, динамическое поведение нуклеиновых кислот в живых клетках, особенно модификаций РНК . можно более детально проследить ^{[ 1 ]}

Теория

NAIL-MS используется для изучения механизмов модификации РНК. Поэтому клетки в культуре сначала получают питательные вещества, меченные стабильными изотопами, и клетки включают их в свои биомолекулы. После очистки нуклеиновых кислот, чаще всего РНК , анализ проводится методом масс-спектрометрии. спектрометрия — это аналитический метод, позволяющий измерить соотношение массы и заряда ионов Масс - . Пары химически идентичных нуклеозидов разного состава стабильных изотопов можно дифференцировать в масс-спектрометре благодаря разнице их масс. Таким образом, немеченые нуклеозиды можно отличить от их меченых стабильным изотопом изотопологов . Для большинства подходов NAIL-MS крайне важно, чтобы меченые нуклеозиды были более чем на 2 Да тяжелее немеченых. Это связано с тем, что 1,1% встречающихся в природе атомов углерода являются ¹³Изотопы С. В случае нуклеозидов это приводит к увеличению массы на 1 Да у ~10% нуклеозидов. Этот сигнал может нарушить окончательную оценку измерения.

NAIL-MS можно использовать для исследования динамики модификации РНК путем изменения меченых питательных веществ соответствующей питательной среды во время эксперимента. Кроме того, популяции клеток можно сравнивать напрямую друг с другом без влияния систематической ошибки очистки. Кроме того, его можно использовать для производства биосинтетических изотопологов большинства нуклеозидов, которые необходимы для количественного определения с помощью масс-спектрометрии и даже для открытия пока неизвестных модификаций РНК. ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}^{[ 4 ]}

Общая процедура

Обычно клетки культивируют в немеченых или стабильных (нерадиоактивных) средах, меченных изотопами. Например, среда может содержать глюкозу, меченную шестью атомами углерода-13 ( ¹³В) вместо обычного углерода-12 ( ¹²С). Клетки, растущие в этой среде, в зависимости от модельного организма будут включать тяжелую глюкозу во все свои молекулы РНК. После этого все нуклеотиды становятся на 5 Да тяжелее, чем их немеченые изотопологи, из-за полного мечения рибозы углеродом. После культивирования и соответствующего мечения клеток их обычно собирают с использованием изотиоцианата фенола/хлороформа/гуанидиния. Возможны и иногда необходимы другие методы экстракции (например, для дрожжей). Затем РНК выделяют фенол-хлороформной экстракцией и осаждением изо -пропанолом . Дальнейшая очистка конкретных видов РНК (например, рРНК, тРНК) обычно проводится с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), но доступны и другие подходы. В большинстве случаев конечный продукт необходимо ферментативно расщепить до нуклеозидов перед анализом с помощью ЖХ-МС . Поэтому пищеварительные ферменты, такие как бензоназа , NP1 и CIP . используются ^{[ 5 ]}^{[ 6 ]} Обычно тройной квадруполь для измерений используется в режиме MRM.

Маркировка клеток

Как достигается мечение молекул РНК, зависит от модельного организма. Для E.coli ( бактерий ) можно использовать минимальную среду M9 и дополнять ее меченными стабильными изотопами вариантами необходимых солей. Это позволяет маркировать ¹³С-углерод, ¹⁵N-азот, ³⁴S-сера и ²Н-водород. ^{[ 7 ]} В отношении S.cerevisiae ( дрожжей ) в настоящее время есть две возможности: во-первых, использование коммерчески доступной полной питательной среды, которая позволяет маркировать ¹³C-углерод и/или ¹⁵N-азот и, во-вторых, использование минимальной среды YNB, которая должна быть дополнена несколькими аминокислотами и глюкозой , которые могут быть добавлены в качестве вариантов, меченных стабильными изотопами, для достижения ¹³С-углерод, ¹⁵N-азот и ²Мечение РНК H-водородом. ^{[ 8 ]}

Хотя маркировка модельных организмов, таких как E.coli и S.cerevisiae, довольно проста, маркировка стабильными изотопами в клеточной культуре является гораздо более сложной задачей, поскольку состав питательной среды намного сложнее. Ни добавление меченной стабильным изотопом глюкозы, ни добавление меченных стабильным изотопом вариантов простых предшественников биосинтеза нуклеозидов, таких как глутамин и/или аспартат, не является достаточным для определенного увеличения массы, превышающего 2 Да. Вместо этого большинство клеток, хранящихся в клеточной культуре, можно кормить метионином, меченным стабильным изотопом, для мечения метильных групп, а также меченными стабильными изотопами вариантами аденина и уридина для мечения основного тела нуклеозида. ^{[ 9 ]} Особую осторожность необходимо соблюдать при добавлении в среду FBS (фетальной бычьей сыворотки), поскольку она также содержит небольшие метаболиты, используемые для биосинтеза нуклеозидов. Поэтому использование диализированного FBS целесообразно, если желательно определенное мечение всех нуклеозидов.

Приложения

С помощью NAIL-MS возможны различные планы экспериментов.

Производство СИЛИС

NAIL-MS можно использовать для производства внутренних стандартов, меченных стабильными изотопами (ISTD). Таким образом, клетки выращивают в среде, что приводит к полному мечению всех нуклеозидов. Очищенную смесь нуклеозидов затем можно использовать в качестве внутреннего стандарта, который необходим для точного абсолютного количественного определения нуклеозидов с помощью масс-спектрометрии. Эту смесь меченых нуклеозидов также называют SILIS (внутренний стандарт, меченный стабильным изотопом). ^{[ 10 ]} Преимущество этого подхода состоит в том, что все модификации, присутствующие в организме, могут быть биосинтезированы в виде меченых соединений. Производство SILIS было осуществлено еще до появления термина NAIL-MS.

Сравнительные эксперименты

Сравнительный эксперимент NAIL-MS очень похож на эксперимент SILAC , но вместо белков используется РНК. Сначала культивируют две популяции соответствующих клеток. Одну из клеточных популяций кормят питательной средой, содержащей немеченые питательные вещества, тогда как вторую популяцию кормят питательной средой, содержащей питательные вещества, меченные стабильными изотопами. Затем клетки включают соответствующие изотопологи в свои молекулы РНК. Одна из клеточных популяций служит контрольной группой, тогда как другая подвергается соответствующим исследованиям (например, штамм KO, стресс). После сбора двух клеточных популяций их смешивают и совместно обрабатывают, чтобы исключить систематическую ошибку очистки. Благодаря различным массам включенных в нуклеозиды питательных веществ дифференциация двух клеточных популяций возможна с помощью масс-спектрометрии.

Импульсные эксперименты

При начале эксперимента по преследованию импульсов среда переключается со среды (1) на среду (2). Две среды должны различаться только содержанием изотопов. Таким образом, можно отличить молекулы РНК, уже существующие до начала эксперимента (= молекулы РНК, выращенные в среде (1)) и молекулы РНК, которые заново транскрибируются после начала эксперимента (= молекулы РНК, выращенные в среде (2)). Это позволяет детально изучить динамику модификации in vivo . Добавление меченого метионина в среду (1) или среду (2) позволяет отслеживать процессы метилирования. Другие меченные изотопами метаболиты потенциально позволяют провести дальнейший анализ модификаций.

В целом NAIL-MS позволяет исследовать динамику модификации РНК с помощью масс-спектрометрии. С помощью этого метода наблюдалось ферментативное деметилирование нескольких повреждений РНК внутри живых бактерий. ^{[ 4 ]}^{[ 7 ]}

Открытие новых модификаций РНК

Для открытия нехарактерных модификаций клетки выращивают в немеченых или ¹³C-маркированный или ¹⁵N-меченый или ²H-маркированный или ³⁴Среда, меченная S. Неизвестные сигналы, возникающие во время масс-спектрометрии, затем проверяются во всех дифференциально меченных культурах. Если времена удерживания неизвестных соединений с соответствующим образом расходящимися значениями m/z перекрываются, формулу суммы соединения можно постулировать путем расчета массовых различий перекрывающегося сигнала в дифференциально меченных культурах. С помощью этого метода можно было обнаружить несколько новых модификаций РНК. Этот экспериментальный проект также стал первоначальной идеей, положившей начало концепции NAIL-MS.

Олигонуклеотид NAIL-MS

NAIL-MS также можно применять для анализа олигонуклеотидов с помощью масс-спектрометрии. Это полезно, когда необходимо сохранить информацию о последовательности. ^{[ 11 ]}

Ссылки

^ Райхле, Валентин Ф.; Кайзер, Штеффен; Хейсс, Матиас; Хагельскамп, Феликс; Борланд, Кайла; Келлнер, Стефани (1 марта 2019 г.). «Преодоление пределов статического анализа модификаций РНК с помощью динамического NAIL-MS» . Методы . 156 : 91–101. дои : 10.1016/j.ymeth.2018.10.025 . ISSN 1095-9130 . ПМИД 30395967 .
^ Келлнер, Стефани; Нойманн, Дженнифер; Розенкранц, Дэвид; Лебедева Светлана; Кеттинг, Рене Ф.; Цишлер, Ганс; Шнайдер, Дирк; Хелм, Марк (4 апреля 2014 г.). «Профилирование модификаций РНК путем мультиплексного мечения стабильных изотопов». Химические коммуникации . 50 (26): 3516–3518. дои : 10.1039/c3cc49114e . ISSN 1364-548X . ПМИД 24567952 .
^ Даль Магро, Кристина; Келлер, Патрик; Коттер, Анника; Вернер, Стефан; Дуарте, Виктор; Маршан, Вирджиния; Игнарский, Майкл; Фрейвальд, Аня; Мюллер, Роман Ульрих; Дитрих, Кристоф; Моторин Юрий (25 июня 2018 г.). «Значительно возросшее химическое разнообразие модификаций РНК, содержащих тиоацетальную структуру». Международное издание «Прикладная химия» на английском языке . 57 (26): 7893–7897. дои : 10.1002/anie.201713188 . ISSN 1521-3773 . ПМИД 29624844 .
^ Jump up to: ^а ^б Райхле, Валентин Ф.; Петров, Димитр П.; Вебер, Верена; Юнг, Кирстен; Келлнер, Стефани (6 декабря 2019 г.). «NAIL-MS выявил восстановление 2-метилтиоцитидина с помощью AlkB в E. coli» . Природные коммуникации . 10 (1): 5600. Бибкод : 2019NatCo..10.5600R . дои : 10.1038/s41467-019-13565-9 . ISSN 2041-1723 . ПМК 6898146 . ПМИД 31811240 .
^ Куинливан, Эоин П.; Грегори, Джесси Ф. (15 февраля 2008 г.). «Расщепление ДНК до дезоксирибонуклеозида: упрощенная одноэтапная процедура» . Аналитическая биохимия . 373 (2): 383–385. дои : 10.1016/j.ab.2007.09.031 . ISSN 0003-2697 . ПМК 2239294 . ПМИД 18028864 .
^ Крейн, П.Ф. (1990). «Приготовление и ферментативный гидролиз ДНК и РНК для масс-спектрометрии». Масс-спектрометрия . Методы энзимологии. Том. 193. стр. 782–790. дои : 10.1016/0076-6879(90)93450-у . ISBN 978-0-12-182094-7 . ISSN 0076-6879 . ПМИД 1706062 .
^ Jump up to: ^а ^б Райхле, Валентин Ф.; Вебер, Верена; Келлнер, Стефани (18 декабря 2018 г.). «NAIL-MS в E. coli определяет источник и судьбу метилирования тРНК» . ХимБиоХим . 19 (24): 2575–2583. дои : 10.1002/cbic.201800525 . ISSN 1439-7633 . ПМК 6582434 . ПМИД 30328661 .
^ Хейсс, Матиас; Райхле, Валентин Ф.; Келлнер, Стефани (2 сентября 2017 г.). «Наблюдение за судьбой тРНК и ее модификаций с помощью масс-спектрометрии с мечением изотопов нуклеиновых кислот: NAIL-MS» . Биология РНК . 14 (9): 1260–1268. дои : 10.1080/15476286.2017.1325063 . ISSN 1555-8584 . ПМК 5699550 . ПМИД 28488916 .
^ Хейсс, Матиас; Хагельскамп, Феликс; Маршан, Вирджиния; Моторин Юрий; Келлнер, Стефани (15 января 2021 г.). «Клеточная культура NAIL-MS позволяет понять динамику модификации тРНК и рРНК человека in vivo» . Природные коммуникации . 12 (1): 389. Бибкод : 2021NatCo..12..389H . дои : 10.1038/s41467-020-20576-4 . ISSN 2041-1723 . ПМЦ 7810713 . ПМИД 33452242 .
^ Келлнер, Стефани; Охель, Антония; Тюринг, Катрин; Спенкух, Феликс; Нойманн, Дженнифер; Шарма, Санни; Энтиан, Карл-Дитер; Шнайдер, Дирк; Хельм, Марк (16 августа 2014 г.). «Абсолютная и относительная количественная оценка модификаций РНК с помощью биосинтетических изотопомеров» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (18): е142. дои : 10.1093/nar/gku733 . ISSN 1362-4962 . ПМК 4191383 . ПМИД 25129236 .
^ Хагельскамп, Феликс; Борланд, Кайла; Рамос, Джиллиан; Хендрик, Алан Г.; Фу, Драконий; Келлнер, Стефани (21 февраля 2020 г.). «Широко применимая масс-спектрометрия олигонуклеотидов для анализа РНК-писателей и ластиков in vitro» . Исследования нуклеиновых кислот . 48 (7): е41. дои : 10.1093/nar/gkaa091 . ISSN 1362-4962 . ПМК 7144906 . ПМИД 32083657 .

Внешние ссылки

[1] Райхле, Валентин Ф.; Кайзер, Штеффен; Хейсс, Матиас; Хагельскамп, Феликс; Борланд, Кайла; Келлнер, Стефани (1 марта 2019 г.). «Преодоление пределов статического анализа модификаций РНК с помощью динамического NAIL-MS» . Методы . 156 : 91–101. дои : 10.1016/j.ymeth.2018.10.025 . ISSN 1095-9130 . ПМИД 30395967 .

[2] Келлнер, Стефани; Нойманн, Дженнифер; Розенкранц, Дэвид; Лебедева Светлана; Кеттинг, Рене Ф.; Цишлер, Ганс; Шнайдер, Дирк; Хелм, Марк (4 апреля 2014 г.). «Профилирование модификаций РНК путем мультиплексного мечения стабильных изотопов». Химические коммуникации . 50 (26): 3516–3518. дои : 10.1039/c3cc49114e . ISSN 1364-548X . ПМИД 24567952 .

[3] Даль Магро, Кристина; Келлер, Патрик; Коттер, Анника; Вернер, Стефан; Дуарте, Виктор; Маршан, Вирджиния; Игнарский, Майкл; Фрейвальд, Аня; Мюллер, Роман Ульрих; Дитрих, Кристоф; Моторин Юрий (25 июня 2018 г.). «Значительно возросшее химическое разнообразие модификаций РНК, содержащих тиоацетальную структуру». Международное издание «Прикладная химия» на английском языке . 57 (26): 7893–7897. дои : 10.1002/anie.201713188 . ISSN 1521-3773 . ПМИД 29624844 .

[:0-4] Jump up to: ^а ^б Райхле, Валентин Ф.; Петров, Димитр П.; Вебер, Верена; Юнг, Кирстен; Келлнер, Стефани (6 декабря 2019 г.). «NAIL-MS выявил восстановление 2-метилтиоцитидина с помощью AlkB в E. coli» . Природные коммуникации . 10 (1): 5600. Бибкод : 2019NatCo..10.5600R . дои : 10.1038/s41467-019-13565-9 . ISSN 2041-1723 . ПМК 6898146 . ПМИД 31811240 .

[5] Куинливан, Эоин П.; Грегори, Джесси Ф. (15 февраля 2008 г.). «Расщепление ДНК до дезоксирибонуклеозида: упрощенная одноэтапная процедура» . Аналитическая биохимия . 373 (2): 383–385. дои : 10.1016/j.ab.2007.09.031 . ISSN 0003-2697 . ПМК 2239294 . ПМИД 18028864 .

[6] Крейн, П.Ф. (1990). «Приготовление и ферментативный гидролиз ДНК и РНК для масс-спектрометрии». Масс-спектрометрия . Методы энзимологии. Том. 193. стр. 782–790. дои : 10.1016/0076-6879(90)93450-у . ISBN 978-0-12-182094-7 . ISSN 0076-6879 . ПМИД 1706062 .

[:1-7] Jump up to: ^а ^б Райхле, Валентин Ф.; Вебер, Верена; Келлнер, Стефани (18 декабря 2018 г.). «NAIL-MS в E. coli определяет источник и судьбу метилирования тРНК» . ХимБиоХим . 19 (24): 2575–2583. дои : 10.1002/cbic.201800525 . ISSN 1439-7633 . ПМК 6582434 . ПМИД 30328661 .

[8] Хейсс, Матиас; Райхле, Валентин Ф.; Келлнер, Стефани (2 сентября 2017 г.). «Наблюдение за судьбой тРНК и ее модификаций с помощью масс-спектрометрии с мечением изотопов нуклеиновых кислот: NAIL-MS» . Биология РНК . 14 (9): 1260–1268. дои : 10.1080/15476286.2017.1325063 . ISSN 1555-8584 . ПМК 5699550 . ПМИД 28488916 .

[9] Хейсс, Матиас; Хагельскамп, Феликс; Маршан, Вирджиния; Моторин Юрий; Келлнер, Стефани (15 января 2021 г.). «Клеточная культура NAIL-MS позволяет понять динамику модификации тРНК и рРНК человека in vivo» . Природные коммуникации . 12 (1): 389. Бибкод : 2021NatCo..12..389H . дои : 10.1038/s41467-020-20576-4 . ISSN 2041-1723 . ПМЦ 7810713 . ПМИД 33452242 .

[10] Келлнер, Стефани; Охель, Антония; Тюринг, Катрин; Спенкух, Феликс; Нойманн, Дженнифер; Шарма, Санни; Энтиан, Карл-Дитер; Шнайдер, Дирк; Хельм, Марк (16 августа 2014 г.). «Абсолютная и относительная количественная оценка модификаций РНК с помощью биосинтетических изотопомеров» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (18): е142. дои : 10.1093/nar/gku733 . ISSN 1362-4962 . ПМК 4191383 . ПМИД 25129236 .

[11] Хагельскамп, Феликс; Борланд, Кайла; Рамос, Джиллиан; Хендрик, Алан Г.; Фу, Драконий; Келлнер, Стефани (21 февраля 2020 г.). «Широко применимая масс-спектрометрия олигонуклеотидов для анализа РНК-писателей и ластиков in vitro» . Исследования нуклеиновых кислот . 48 (7): е41. дои : 10.1093/nar/gkaa091 . ISSN 1362-4962 . ПМК 7144906 . ПМИД 32083657 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]