Амплификация рекомбиназной полимеразы
Рекомбиназная полимеразная амплификация в одной пробирке . (RPA) представляет собой изотермическую альтернативу полимеразной цепной реакции (ПЦР) [ 1 ] Добавляя фермент обратной транскриптазы к реакции RPA, он может обнаруживать РНК , а также ДНК , без необходимости отдельного этапа получения кДНК . [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] Поскольку RPA является изотермическим методом , можно использовать гораздо более простое оборудование, чем для ПЦР, для которого требуется термоциклер . Лучше всего работать при температуре 37–42 °C и по-прежнему работать, хотя и медленнее, при комнатной температуре, что означает, что реакции RPA теоретически можно проводить быстро, просто держа пробирку. Это делает RPA отличным кандидатом для разработки недорогих, быстрых молекулярных тестов, доступных на месте оказания медицинской помощи. Была проведена международная оценка качества молекулярного обнаружения вируса лихорадки долины Рифт, а также лучшие тесты RT-PCR, обнаруживающие менее концентрированные образцы, пропущенные некоторыми тестами PCR и тестом RT-LAMP . [ 5 ] RPA был разработан и запущен TwistDx Ltd. (ранее известной как ASM Scientific Ltd), биотехнологической компанией, базирующейся в Кембридже, Великобритания.
Техника
[ редактировать ]В процессе RPA используются три основных фермента — рекомбиназа , одноцепочечный ДНК-связывающий белок , замещающая цепь (SSB) и полимераза .
Рекомбиназы способны спаривать олигонуклеотидные праймеры с гомологичной последовательностью в дуплексной ДНК. [ 1 ]
SSB связывается со смещенными цепями ДНК и предотвращает праймеров смещение .
Наконец, полимераза, замещающая цепь, начинает синтез ДНК , когда праймер связывается с целевой ДНК.
При использовании двух противоположных праймеров, как и в ПЦР, если целевая последовательность действительно присутствует, амплификации ДНК инициируется экспоненциальная реакция . Для инициирования амплификации не требуется никаких других манипуляций с образцом, таких как термическое или химическое плавление. При оптимальных температурах (37–42 °C) реакция протекает быстро и приводит к специфической амплификации ДНК от нескольких целевых копий до обнаруживаемых уровней, обычно в течение 10 минут, для быстрого обнаружения вирусной геномной ДНК или РНК. [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] геномная ДНК патогенных бактерий, [ 9 ] [ 10 ] а также аптамерную ДНК короткой длины. [ 11 ]
Три основных фермента RPA могут быть дополнены дополнительными ферментами для обеспечения дополнительной функциональности. Добавление экзонуклеазы III позволяет использовать экзозонд для обнаружения флуоресценции в реальном времени, аналогичной ПЦР в реальном времени. [ 1 ] Добавление эндонуклеазы IV означает, что зонд nfo можно использовать для полоски с боковым потоком . обнаружения успешной амплификации с помощью [ 1 ] [ 6 ] [ 12 ] Если добавить обратную транскриптазу, которая работает при 37–42 ° C, то РНК можно будет обратно транскрибировать, а полученную кДНК амплифицировать за один этап. В настоящее время доступна только экзо-версия RPA TwistAmp с включенной обратной транскриптазой, хотя пользователи могут просто дополнять другие реакции TwistAmp обратной транскриптазой для получения того же эффекта. Как и в случае с ПЦР, все формы реакций RPA можно мультиплексировать путем добавления дополнительных пар праймер/зонд, что позволяет обнаруживать несколько аналитов или осуществлять внутренний контроль в одной и той же пробирке.
Связь с другими методами усиления
[ редактировать ]RPA — один из нескольких методов изотермической амплификации нуклеиновых кислот, которые будут разработаны в качестве метода молекулярной диагностики, часто с целью упрощения необходимого лабораторного оборудования по сравнению с ПЦР . Неполный список других методов изотермической амплификации включает LAMP , NASBA , геликазозависимую амплификацию (HDA) и реакцию амплификации никующего фермента (NEAR). Методы различаются особенностями конструкции праймеров и механизмом реакции, а в некоторых случаях (например, RPA) используются коктейли из двух или более ферментов. Как и RPA, многие из этих методов обеспечивают быстрое время амплификации с возможностью упрощения инструментов и сообщают об устойчивости к веществам в неочищенных образцах, которые, как известно, ингибируют ПЦР. Что касается времени амплификации, современные термоциклеры с быстрым изменением температуры могут сократить время амплификации ПЦР до менее чем 30 минут, особенно для коротких ампликонов, использующих двухтемпературное циклирование вместо традиционных трехтемпературных протоколов. [ 13 ] Кроме того, требования к подготовке проб (включая лизис и экстракцию ДНК или РНК, если необходимо) следует рассматривать как часть общего времени и сложности, присущих этому методу. Эти требования различаются в зависимости от метода, а также от конкретной цели и типа образца.
По сравнению с ПЦР, рекомендации по разработке праймеров и зондов для RPA менее устоялись и могут потребовать определенной степени проб и ошибок, хотя недавние результаты показывают, что стандартные праймеры для ПЦР также могут работать. [ 14 ] Общий принцип дискретного ампликона, ограниченного прямым и обратным праймером с (необязательным) внутренним флуорогенным зондом, аналогичен ПЦР. Праймеры для ПЦР можно использовать непосредственно в RPA, но их короткая длина означает, что скорость рекомбинации низкая, и RPA не будет особенно чувствительным или быстрым. Обычно для эффективного формирования рекомбиназных филаментов и работы RPA необходимы 30–38 базовых праймеров. В этом отличие от некоторых других методов, таких как LAMP, в которых используется большее количество праймеров с учетом дополнительных конструктивных ограничений. Хотя в исходном отчете RPA за 2006 год описан функциональный набор компонентов реакции, текущая (запатентованная) формула набора TwistAmp «существенно отличается». [ 15 ] и доступен только у поставщика TwistDx. Это по сравнению с реакционными смесями для ПЦР , которые доступны от многих поставщиков, или с LAMP или NASBA, для которых состав реакционной смеси свободно публикуется, что позволяет исследователям создавать свои собственные «наборы» из недорогих ингредиентов.
В опубликованной научной литературе, как правило, отсутствует подробное сравнение эффективности методов изотермической амплификации, таких как RPA, HDA и LAMP, относительно друг друга, часто скорее сравнивается один изотермический метод с «золотым стандартом» ПЦР-анализа. Это затрудняет оценку достоинств этих методов независимо от заявлений производителей, изобретателей или сторонников. Кроме того, рабочие характеристики любого метода амплификации трудно отделить от конструкции праймеров: «хороший» набор праймеров для одной мишени для RPA может обеспечить более быструю амплификацию или более чувствительное обнаружение, чем «плохой» набор праймеров LAMP для той же мишени, но Обратное может быть верно для разных наборов праймеров для разных мишеней. Исключением является недавнее исследование, сравнивающее RT-qPCR, RT-LAMP и RPA для выявления вируса Шмалленберга и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. [ 16 ] что фактически подчеркивает, что каждый метод амплификации имеет сильные и слабые стороны, которые могут варьироваться в зависимости от цели, и что свойства доступных методов амплификации необходимо оценивать в сочетании с требованиями для каждого приложения. Как и в случае с ПЦР и любым другим методом амплификации, очевидно, что существует предвзятость публикации: плохо работающие наборы праймеров редко считаются достойными публикации.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д Пипенбург, Олаф; Уильямс, Колин Х.; Стемпл, Дерек Л.; Армс, Найл А. (2006). «Обнаружение ДНК с использованием рекомбинационных белков» . ПЛОС Биология . 4 (7): е204. дои : 10.1371/journal.pbio.0040204 . ПМЦ 1475771 . ПМИД 16756388 .
- ^ Jump up to: а б Эйлер, Милена; Ван, Юнцзе; Нантвич, Оливер; Пипенбург, Олаф; Хуферт, Фрэнк Т.; Вайдманн, Манфред (2012). «Анализ амплификации рекомбиназной полимеразы для быстрого обнаружения вируса лихорадки Рифт-Валли». Журнал клинической вирусологии . 54 (4): 308–12. дои : 10.1016/j.jcv.2012.05.006 . ПМИД 22683006 .
- ^ Jump up to: а б Амер, HM; Абд Эль Вахед, А.; Шалаби, Массачусетс; Алмаджди, ФН; Хуферт, FT; Вайдманн, М. (2013). «Новый подход к диагностике бычьего коронавируса с использованием анализа амплификации рекомбиназной полимеразы с обратной транскрипцией» . Журнал вирусологических методов . 193 (2): 337–40. дои : 10.1016/j.jviromet.2013.06.027 . ПМЦ 7113639 . ПМИД 23811231 .
- ^ Jump up to: а б Абд Эль Вахед, Ахмед; Эль-Диб, Айман; Эль-Толот, Мохамед; Абд Эль-Кадер, Ханаа; Ахмед, Абир; Хасан, Сайед; Хоффманн, Бернд; Хаас, Бернд; Шалаби, Мохамед А.; Хуферт, Фрэнк Т.; Вайдманн, Манфред (2013). Мэн, Сян-Цзинь (ред.). «Портативный анализ амплификации рекомбиназной полимеразы с обратной транскрипцией для быстрого обнаружения вируса ящура» . ПЛОС ОДИН . 8 (8): e71642. Бибкод : 2013PLoSO...871642A . дои : 10.1371/journal.pone.0071642 . ПМЦ 3748043 . ПМИД 23977101 .
- ^ Эскадафаль, Камилла; Павеска, Януш Т.; Гроббелаар, Антуанетта; Ле Ру, Шантель; Булуа, Мишель; Патель, Пранав; Тейхманн, Анетт; Доносо-Мантке, Оливер; Нидриг, Матиас (2013). Де Сильва, Аравинда М (ред.). «Международная внешняя оценка качества молекулярного обнаружения вируса лихорадки Рифт-Валли» . PLOS Забытые тропические болезни . 7 (5): е2244. дои : 10.1371/journal.pntd.0002244 . ПМЦ 3662703 . ПМИД 23717706 .
- ^ Jump up to: а б Бойл, Д.С.; Леман, Д.А.; Лиллис, Л.; Петерсон, Д.; Сингхал, М.; Армс, Н.; Паркер, М.; Пипенбург, О.; Овербо, Дж. (2013). «Быстрое обнаружение провирусной ДНК ВИЧ-1 для ранней диагностики младенцев с использованием амплификации рекомбиназной полимеразы» . мБио . 4 (2): e00135–13. дои : 10.1128/mBio.00135-13 . ПМЦ 3622927 . ПМИД 23549916 .
- ^ Эйлер, М.; Ван, Ю.; Отто, П.; Томазо, Х.; Эскудеро, Р.; Анда, П.; Хуферт, FT; Вайдманн, М. (2012). «Анализ амплификации рекомбиназной полимеразы для быстрого обнаружения Francesella tularensis» . Журнал клинической микробиологии . 50 (7): 2234–8. дои : 10.1128/JCM.06504-11 . ПМК 3405570 . ПМИД 22518861 .
- ^ Эйлер, М.; Ван, Ю.; Хайденрайх, Д.; Патель, П.; Штромайер, О.; Хакенберг, С.; Нидриг, М.; Хуферт, FT; Вайдманн, М. (2013). «Разработка панели анализов амплификации рекомбиназной полимеразы для обнаружения агентов биологической угрозы» . Журнал клинической микробиологии . 51 (4): 1110–7. дои : 10.1128/JCM.02704-12 . ПМЦ 3666764 . ПМИД 23345286 .
- ^ Себастьян К., Валентина Р., Франк Ф.Б., Маркус фон Н.Р. (2014). «Мультиплексная изотермическая твердофазная амплификация рекомбиназной полимеразы для специфического и быстрого обнаружения на основе ДНК трех бактериальных патогенов» . Микрохимика Акта . 181 (13–14): 1715–1723. дои : 10.1007/s00604-014-1198-5 . ПМК 4167443 . ПМИД 25253912 .
- ^ Сантьяго-Фелипе С., Тортажада-Хенаро Л.А., Мораиш С., Пучадес Р., Макиейра А. (2015). «Стратегии изотермической амплификации ДНК для дуплексного обнаружения микроорганизмов». Пищевая хим . 174 : 509–515. doi : 10.1016/j.foodchem.2014.11.080 . hdl : 10251/66087 . ПМИД 25529713 .
- ^ Лоо Дж.Ф., Лау П.М., Хо Х.П., Конг С.К. (2013). «Анализ биоштрих-кода на основе аптамера с изотермической амплификацией рекомбиназной полимеразы для обнаружения цитохрома-с и скрининга противораковых препаратов». Таланта . 115 : 159–165. дои : 10.1016/j.talanta.2013.04.051 . ПМИД 24054573 .
- ^ Рорман, Бриттани А.; Ричардс-Кортум, Ребекка Р. (2012). «Устройство из бумаги и пластика для проведения рекомбиназной полимеразной амплификации ДНК ВИЧ» . Лаборатория на чипе . 12 (17): 3082–8. дои : 10.1039/c2lc40423k . ПМК 3569001 . ПМИД 22733333 .
- ^ «Быстрая ПЦР» . Dna.utah.edu . Проверено 21 июня 2014 г.
- ^ «Праймеры для ПЦР работают с использованием стандартных реагентов RPA» . ТвистДкс . Проверено 19 октября 2015 г. [ постоянная мертвая ссылка ]
- ^ «Публикации» . ТвистДкс . Проверено 21 июня 2014 г.
- ^ Эбишер, Андреа (2014). «Быстрое обнаружение генома вируса Шмалленберга и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота с использованием методов изотермической амплификации и высокоскоростной ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени» . Журнал клинической микробиологии . 52 (6): 1883–92. дои : 10.1128/JCM.00167-14 . ПМК 4042763 . ПМИД 24648561 .