МАРКМ
Мозаичный анализ с помощью репрессируемого клеточного маркера , или MARCM , представляет собой генетический метод создания индивидуально меченных гомозиготных клеток у гетерозиготных Drosophila melanogaster . [ 1 ] Это был решающий инструмент в изучении развития нервной системы дрозофилы . Этот метод основан на рекомбинации во время митоза , опосредованной рекомбинацией FLP-FRT . Поскольку одной копии гена, обеспечиваемой балансирующей хромосомой , часто бывает достаточно для спасения мутантного фенотипа , клоны MARCM можно использовать для изучения мутантного фенотипа у животных дикого типа .
Кресты
[ редактировать ]
Для маркировки небольших популяций клеток от общего предшественника MARCM использует систему GAL4-UAS . Маркерный ген, такой как GFP, находится под контролем промотора UAS . GAL4 повсеместно экспрессируется у этих мух, что стимулирует экспрессию маркеров. Кроме того, GAL80 управляется сильным промотором, таким как TubeP. Gal80 является ингибитором GAL4 и подавляет экспрессию GFP в нормальных условиях. Этот элемент TubeP-GAL80 размещается дистальнее места FRT. Второй сайт FRT размещается транс по отношению к сайту GAL80, обычно с интересующим геном или мутацией, дистальнее него. Наконец, рекомбиназа FLP управляется индуцируемым промотором, таким как тепловой шок.
Когда индуцируется транскрипция FLP, она рекомбинирует хромосомы в двух сайтах FRT в клетках, подвергающихся митозу. Эти клетки разделятся на две гомозиготные дочерние клетки: одна несет оба элемента GAL80, а другая не несет ни одного. Дочерняя клетка, лишенная GAL80, будет помечена благодаря экспрессии маркера через систему GAL4-UAS. Все последующие дочерние клетки этого предшественника также будут экспрессировать маркер.
В лабораториях часто есть готовые к MARCM линии, которые имеют индуцируемый FLP, GAL80, дистальный по отношению к сайту FRT, GAL4 и UAS-маркер. Их можно легко скрестить с мухами, имеющими интересующую мутацию, расположенную дистальнее участка FRT. [ 2 ]
Использование
[ редактировать ]Воспользовавшись преимуществами MARCM, можно легко отследить все клетки, созданные из одного предшественника. Это полезный инструмент для отслеживания развития и конкретных клеточных линий в различных условиях окружающей среды. Приложения MARCM включают изучение нейронных цепей , [ 3 ] клональный анализ, [ 4 ] генетический скрининг , [ 5 ] сперматогенез , [ 6 ] развитие конуса роста , [ 7 ] нейрогенез , [ 8 ] и метастазы опухоли . [ 9 ]
Многие достижения в понимании развития дрозофилы были достигнуты с помощью MARCM. Развитие, происхождение и характеристики вторичных аксонных путей. [ 10 ] анатомические карты холинергических нейронов зрительных систем, [ 11 ] линии, дающие начало каркасу грудных геминейромеров и структуре развития архитектуры ЦНС, [ 12 ] роль Дельты в программировании развития вентрального нервного канатика, [ 13 ] октопаминэргические клетки, способствующие пробуждению, в медиальном протоцеребруме , [ 14 ] гены, участвующие в нейрональном морфогенезе грибовидных тел , [ 15 ] и регуляция направления комиссуральных аксонов [ 16 ] все они были идентифицированы с помощью методов MARCM.
Вариации
[ редактировать ]Существует множество вариантов MARCM. MARCM с двумя точками позволяет маркировать сестринские клоны двумя отдельными маркерами, что обеспечивает более высокое разрешение отслеживания происхождения. [ 17 ] При обратном MARCM интересующая мутация помещается в ту же хромосому, что и GAL80, так что гомозиготные клоны дикого типа будут помечены. [ 18 ] Flip-Out MARCM выделяет отдельные клетки внутри мутантных клонов (ссылка «Drosophila Dscam необходима для дивергентной сегрегации сестринских ветвей и подавляет эктопическую бифуркацию аксонов», Neuron, 2002). Система Q позволяет использовать независимый MARCM от GAL4 с помощью системы QF/QS. [ 19 ] Летальный MARCM позволяет генерировать большие маркированные гомозиготные популяции за счет включения летальной мутации вблизи сайта GAL80. [ 20 ] Контроль двойной экспрессии MARCM использует транскрипционную систему LexA-VP16 в соответствии с GAL4-UAS. [ 21 ] MARCM также часто используется в качестве генетического скрининга. [ 15 ]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ли, Т; Луо, Л. (2001). «Мозаичный анализ с использованием репрессируемого клеточного маркера (MARCM) для развития нейронов дрозофилы». Тенденции в нейронауках . 24 (5): 251–4. дои : 10.1016/S0166-2236(00)01791-4 . ПМИД 11311363 . S2CID 6205281 .
- ^ Ву, Дж.С.; Ло Л (11 января 2007 г.). «Протокол мозаичного анализа с использованием маркера репрессируемых клеток (MARCM) у дрозофилы». Протоколы природы . 1 (6): 2583–9. дои : 10.1038/nprot.2006.320 . ПМИД 17406512 . S2CID 205463607 .
- ^ Марин, ЕС; Джефферис Г.С.; Комияма Т; Чжу Х; Ло Л (19 апреля 2002 г.). «Представление клубочковой обонятельной карты в мозгу дрозофилы» . Клетка . 109 (2): 243–55. дои : 10.1016/S0092-8674(02)00700-6 . ПМИД 12007410 .
- ^ Лай, СЛ; Авасаки Т; Ито К; Ли Т. (01 сентября 2008 г.). «Клональный анализ нейронов усиков дрозофилы: разнообразная архитектура нейронов в линии боковых нейробластов» . Разработка . 135 (17): 2883–2893. дои : 10.1242/dev.024380 . ПМИД 18653555 .
- ^ Баер, ММ; Бильштейн А; Лептин М. (01.07.2007). «Клональный генетический скрининг мутантов, вызывающих дефекты морфогенеза личинки трахеи у дрозофилы» . Генетика . 176 (4): 2279–91. doi : 10.1534/genetics.107.074088 . ПМК 1950631 . ПМИД 17603107 .
- ^ Кигер, А.А.; Уайт-Купер Х; Фуллер МТ. (12 октября 2000 г.). «Соматические поддерживающие клетки ограничивают самообновление стволовых клеток зародышевой линии и способствуют дифференцировке». Природа . 407 (6805): 750–4. Бибкод : 2000Natur.407..750K . дои : 10.1038/35037606 . ПМИД 11048722 . S2CID 4349276 .
- ^ Нг, Дж; Нардин Т; Хармс М; Цзы Дж; Гольдштейн А; Сунь Ю; Дицль Г; Диксон Би Джей; Ло Л. (28 марта 2002 г.). «Rac GTPases контролируют рост, направление и ветвление аксонов». Природа . 416 (6879): 422–47. Бибкод : 2002Natur.416..442N . дои : 10.1038/416442а . ПМИД 11919635 . S2CID 4418881 .
- ^ Бен Рокия-Милль, С.; Тинетт С; Энглер Г; Арто Л; Тарес С; Робишон А. (11 июня 2008 г.). «Продолжающийся нейрогенез у взрослой дрозофилы как механизм рекрутирования вариантов, зависимых от сигналов окружающей среды» . ПЛОС ОДИН . 3 (6): e2395. Бибкод : 2008PLoSO...3.2395B . дои : 10.1371/journal.pone.0002395 . ПМК 2405948 . ПМИД 18545694 .
- ^ Пальярини, РА; Сюй, Т. (9 октября 2003 г.). «Генетический экран дрозофилы на предмет метастатического поведения» . Наука . 302 (5648): 1227–31. Бибкод : 2003Sci...302.1227P . дои : 10.1126/science.1088474 . ПМИД 14551319 . S2CID 41410051 .
- ^ Ловик, Дж. К.; Нго КТ; Омото Джей Джей; Вонг, округ Колумбия; Нгуен Дж.Д.; Хартенштейн В. (15 декабря 2013 г.). «Постэмбриональные линии мозга дрозофилы: I. Развитие волоконных путей, связанных с линией» . Биология развития . 384 (2): 228–57. дои : 10.1016/j.ydbio.2013.07.008 . ПМЦ 3886848 . ПМИД 23880429 .
- ^ Вариа Рагху, С; Райфф ДФ; Борст А. (01 января 2011 г.). «Нейроны с холинергическим фенотипом в зрительной системе дрозофилы». Журнал сравнительной неврологии . 519 (1): 162–76. дои : 10.1002/cne.22512 . ПМИД 21120933 . S2CID 8518278 .
- ^ Трумэн, Дж.В.; Шуппе Х; Шеперд Д; Уильямс Д.В. (15 октября 2004 г.). «Архитектура развития специфичных для взрослых линий в вентральной ЦНС дрозофилы» . Разработка . 131 (20): 5167–84. дои : 10.1242/dev.01371 . ПМИД 15459108 .
- ^ Корнбрукс, К; Бланд С; Уильямс Д.В.; Трумэн Дж.В.; Рэнд, доктор медицинских наук. (22 декабря 2006 г.). «Дельта-экспрессия в постмитотических нейронах идентифицирует отдельные подмножества специфичных для взрослых линий у дрозофилы» . Развивающая нейробиология . 67 (1): 23–38. дои : 10.1002/днеу.20308 . ПМИД 17443769 . S2CID 2444513 .
- ^ Крокер, А; Шахидулла М; Левитан И.Б.; Сегал А. (11 марта 2010 г.). «Идентификация нейронной цепи, лежащей в основе воздействия октопамина на поведение сна: бодрствования» . Нейрон . 65 (5): 670–81. дои : 10.1016/j.neuron.2010.01.032 . ПМК 2862355 . ПМИД 20223202 .
- ^ Jump up to: а б Рейтер, Дж. Э.; Нардин ТМ; Пентон А; Биллюарт П; Скотт ЭК; Усуи Т; Уэмура Т; Ло Л. (15 марта 2003 г.). «Мозаичный генетический скрининг генов, необходимых для морфогенеза нейронов грибовидного тела дрозофилы» . Разработка . 130 (6): 1203–13. дои : 10.1242/dev.00319 . ПМИД 12571111 .
- ^ Макговерн, В.Л.; Сигер, Массачусетс. (20 октября 2003 г.). «Анализ мозаики выявляет клеточно-автономную потребность нейронов в безкомиссарности в ЦНС дрозофилы». Гены развития и эволюция . 213 (10): 500–4. дои : 10.1007/s00427-003-0349-1 . ПМИД 12928898 . S2CID 6282587 .
- ^ Ю, ХХ; Чен Ч.; Ши Л; Хуан Ю; Ли Т. (14 июня 2009 г.). «MARCM с двумя точками для выявления происхождения и идентичности нейронов» . Природная неврология . 12 (7): 947–53. дои : 10.1038/nn.2345 . ПМК 2701974 . ПМИД 19525942 .
- ^ Ли, Т; Зимний С; Мартике СС; Ли А; Ло Л. (2000). «Основная роль Drosophila RhoA в регуляции пролиферации нейробластов и дендритном, но не аксональном морфогенезе» . Нейрон . 25 (2): 307–16. дои : 10.1016/S0896-6273(00)80896-X . ПМИД 10719887 .
- ^ Поттер, CJ; Тасич Б; Расслер Е.В.; Лян Л; Ло Л. (30 апреля 2010 г.). «Система Q: репрессируемая бинарная система для экспрессии трансгенов, отслеживания происхождения и мозаичного анализа» . Клетка . 141 (3): 536–48. дои : 10.1016/j.cell.2010.02.025 . ПМЦ 2883883 . ПМИД 20434990 .
- ^ Чжу, Х; Ло Л. (8 апреля 2004 г.). «Разнообразные функции N-кадгерина в дендритном и аксональном терминальном разветвлении нейронов обонятельных проекций» . Нейрон . 42 (1): 63–75. дои : 10.1016/S0896-6273(04)00142-4 . ПМИД 15066265 .
- ^ Лай, СЛ; Ли Т. (9 мая 2006 г.). «Генетическая мозаика с двойной бинарной транскрипционной системой у дрозофилы». Природная неврология . 9 (5): 703–9. дои : 10.1038/nn1681 . ПМИД 16582903 . S2CID 10780729 .
