Система GAL4/UAS
Система GAL4-UAS — это биохимический метод, используемый для изучения экспрессии и функционирования генов в таких организмах, как плодовая мушка . Он основан на открытии Хитоши Какидани и Марка Пташне. [1] и Николас Вебстер и Пьер Шамбон [2] в 1988 году связывание Gal4 с последовательностями UAS активирует экспрессию генов. Этот метод был применен к мухам Андреа Брэнд и Норбертом Перримоном в 1993 году. [3] и считается мощным методом изучения экспрессии генов . [4] Система состоит из двух частей: ген Gal4 , кодирующий дрожжевой активатор транскрипции белок- Gal4 , и UAS ( Upstream Activation Sequence ), энхансер, с которым GAL4 специфически связывается для активации транскрипции гена .
Обзор
[ редактировать ]Система Gal4 позволяет разделить проблемы определения того, какие клетки экспрессируют ген или белок, и что экспериментатор хочет делать с этими знаниями. Генетики создали генетические варианты модельных организмов (обычно плодовых мух), называемые линиями GAL4 , каждая из которых экспрессирует GAL4 в некотором подмножестве тканей животного. Например, некоторые линии могут экспрессировать GAL4 только в мышечных клетках, или только в нервах, или только в усиках и так далее. В частности, для плодовых мух существуют десятки тысяч таких линий, наиболее полезные из которых экспрессируют GAL4 только в очень специфической подгруппе животных — возможно, например, только в тех нейронах , которые соединяют два определенных отдела мозга мухи. Присутствие GAL4 само по себе в этих клетках имеет незначительный эффект или вообще не оказывает никакого эффекта, поскольку основной эффект GAL4 заключается в связывании с областью UAS, а большинство клеток не имеют (или безобидны) областей UAS.
Поскольку Gal4 сам по себе не виден и мало влияет на клетки, другой необходимой частью этой системы являются «репортерные линии». Это штаммы мух со специальной областью UAS рядом с нужным геном. Эти генетические инструкции происходят в каждой клетке животного, но в большинстве клеток ничего не происходит, поскольку эта клетка не производит GAL4. Однако в клетках, продуцирующих GAL4, UAS активируется, включается соседний с ним ген, и он начинает производить полученный белок. Это может сообщить исследователю, какие клетки экспрессируют GAL4, отсюда и термин «репортерная линия», но также часто используются гены, предназначенные для управления поведением клеток.
Типичные репортерные гены включают:
- Флуоресцентные белки, такие как зеленые (GFP) или красные флуоресцентные белки (RFP), которые позволяют ученым видеть, какие клетки экспрессируют Gal4.
- Каналродопсин , который обеспечивает светочувствительное срабатывание нервных клеток.
- Галородопсин , который, наоборот, позволяет свету подавлять возбуждение нейронов.
- Шибире, который отключает нейроны, но только при более высоких температурах (30 °C и выше). Мух с этим геном можно выращивать и тестировать при более низких температурах, при которых их нейроны будут вести себя нормально. Тогда температуру тела мух можно поднять (поскольку они хладнокровны ), и эти нейроны отключатся. [5] Если поведение мухи изменится, это даст четкий ключ к пониманию того, что делают эти нейроны.
- GECI ( ) семейства , часто являющийся генетически кодируемый индикатор кальция . белков членом GCaMP Эти белки флуоресцируют при воздействии кальция , что в большинстве клеток происходит при возбуждении нейрона. Это позволяет ученым делать снимки или видеоролики, показывающие работу нервной системы.
Например, ученые могут сначала визуализировать класс нейронов, выбрав муху из линии GAL4, экспрессирующей GAL4 в нужном наборе нейронов, и скрестив ее с репортерной линией, экспрессирующей GFP. У потомства желаемая подгруппа клеток будет производить GAL4, и в этих клетках GAL4 будет связываться с UAS и обеспечивать выработку GFP. Таким образом, желаемая группа клеток теперь будет светиться зеленым светом, и ее можно будет отслеживать с помощью флуоресцентного микроскопа . Затем, чтобы выяснить, что могут делать эти клетки, экспериментатор может экспрессировать каналородопсин в каждой из этих клеток путем скрещивания одной и той же линии GAL4 с репортерной линией каналородопсина. У потомства выбранные клетки и только эти клетки будут содержать каналродопсин и могут активироваться ярким светом. Теперь учёный может по своему желанию активировать эти конкретные клетки и изучить возникающее в результате поведение, чтобы увидеть, что эти клетки могут делать.
Операция
[ редактировать ]Gal4 представляет собой модульный белок, состоящий в основном из ДНК-связывающего домена и домена активации. UAS, с которым связывается GAL4, представляет собой CGG-N 11 -CCG, где N может быть любым основанием . [6] Хотя GAL4 представляет собой дрожжевой белок, обычно не присутствующий в других организмах, было показано, что он действует как активатор транскрипции у различных организмов, таких как дрозофила . [7] и клетках человека, подчеркивая, что одни и те же механизмы экспрессии генов сохранились в ходе эволюции. [2]
Для исследования на дрозофиле ген GAL4 помещается под контроль нативного промотора гена или гена-драйвера, в то время как UAS контролирует экспрессию целевого гена. GAL4 тогда экспрессируется только в клетках, где ген-драйвер обычно активен. В свою очередь, GAL4 должен активировать транскрипцию гена только там, где был введен UAS. Например, путем слияния гена, кодирующего видимый маркер, такой как GFP ( зеленый флуоресцентный белок ), можно определить характер экспрессии генов-драйверов. GAL4 и UAS очень полезны для изучения экспрессии генов у дрозофилы, поскольку в норме они отсутствуют и их экспрессия не мешает другим процессам в клетке. Например, трансгены, регулируемые GAL4/UAS, у дрозофилы использовались для изменения экспрессии глии с целью вызвать аритмическое поведение в рамках известного ритмического циркадного выхода, называемого фактором диспергирования пигмента (PDF). [8] Однако некоторые исследования показали, что сверхэкспрессия GAL4 у дрозофилы может иметь побочные эффекты, вероятно, связанные с иммунными и стрессовыми реакциями на то, что по сути является чужеродным белком. [9]
Система GAL4-UAS также использовалась для изучения экспрессии генов у организмов, помимо дрозофилы, таких как африканская шпорцевая лягушка Xenopus. [10] и рыбка данио . [11]
Система GAL4/UAS также используется в двухгибридном скрининге — методе выявления взаимодействий между двумя белками или белком с ДНК.
Расширения
[ редактировать ]Экспрессию Gal4 можно сделать еще более специфичной с помощью «стратегий пересечения». Они могут объединять две разные линии GAL4, скажем, A и B, таким образом, что GAL4 экспрессируется только в клетках, которые находятся в линии A, но не в линии B, или в клетках, которые находятся в обеих линиях A и B. редкие линии GAL4, это предлагает очень специфический выбор, часто ограниченный одним типом клеток. Недостаток заключается в том, что требуются как минимум три независимых сайта вставки, поэтому линии должны использовать разные и независимые сайты вставки, а для создания желаемых конечных организмов требуется более чем одно скрещивание. Это очень активная область исследований, и существует множество таких пересекающихся стратегий, две из которых обсуждаются ниже.
Один из способов создать экспрессию GAL4 в клетках, которые находятся в линии A, но не в линии B, требует, чтобы линия A экспрессировала GAL4, а линия B была создана для экспрессии Gal80 , который является ингибитором GAL4. Следовательно, только клетки, находящиеся в A, но не в B, будут иметь активный GAL4, который затем может управлять репортерным геном . [12] [13]
Чтобы экспрессировать GAL4 только в клетках, содержащихся как в A, так и в B, можно использовать метод, называемый «сплит-GAL4». Линия А предназначена для экспрессии половины белка GAL4, который сам по себе неактивен. Аналогично, строка B предназначена для выражения другой половины GAL4, которая сама по себе также неактивна. Только клетки, находящиеся в обеих линиях, образуют обе половинки, которые самособираются с помощью лейциновой застежки-молнии в GAL4 и активируют репортерный ген. [14]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Какидани, Хитоши; Пташне, Марк (1988). «GAL4 активирует экспрессию генов в клетках млекопитающих». Клетка . 52 (2): 161–167. дои : 10.1016/0092-8674(88)90504-1 . ПМИД 2830021 . S2CID 9524012 .
- ^ Jump up to: а б Вебстер, Н.; Джин, младший; Грин, С.; Холлис, М.; Шамбон, П. (1988). «Дрожжевой UASG является усилителем транскрипции в клетках HeLa человека в присутствии транс-активатора GAL4». Клетка . 52 (2): 169–78. дои : 10.1016/0092-8674(88)90505-3 . ПМИД 2830022 . S2CID 26819676 .
- ^ Бранд, Ага ; Перримон, Н. (1993). «Направленная экспрессия генов как средство изменения судеб клеток и создания доминантных фенотипов» . Разработка . 118 (2): 401–415. дои : 10.1242/dev.118.2.401 . ПМИД 8223268 .
- ^ Даффи, Дж. Б. (2002). «Система GAL4 у дрозофилы: швейцарский армейский нож генетика мух» . Бытие . 34 (1–2): 1–15. дои : 10.1002/gen.10150 . ПМИД 12324939 . S2CID 5073328 .
- ^ Китамото, Тошихиро (2001). «Условная модификация поведения дрозофилы путем целенаправленной экспрессии термочувствительного аллеля шибире в определенных нейронах». Журнал нейробиологии . 47 (2): 81–92. дои : 10.1002/neu.1018 . ПМИД 11291099 .
- ^ Кэмпбелл, Р.Н.; Леверенц, МК; Райан, Луизиана; Рис, Р.Дж. (2008). «Метаболический контроль транскрипции: парадигмы и уроки Saccharomyces cerevsiae ». Биохимический журнал . 414 (2): 177–87. дои : 10.1042/BJ20080923 . ПМИД 18687061 . S2CID 19379977 .
- ^ Дженис А. Фишер; Эдвард Джинигер; Том Маниатис; Марк Пташне (1988). «GAL4 активирует транскрипцию у дрозофилы ». Природа . 332 (6167): 853–6. Бибкод : 1988Natur.332..853F . дои : 10.1038/332853a0 . ПМИД 3128741 . S2CID 31793830 .
- ^ Нг, ФС; Тангреди, ММ; Джексон, Франция (апрель 2011 г.). «Глиальные клетки физиологически модулируют часовые нейроны и циркадное поведение кальций-зависимым образом» . Современная биология . 21 (8): 625–34. дои : 10.1016/j.cub.2011.03.027 . ПМК 3081987 . ПМИД 21497088 .
- ^ Лю Ю, Леман М (2008). «Геномный ответ на дрожжевой фактор транскрипции GAL4 у дрозофилы » . Флай (Остин) . 2 (2): 92–8. дои : 10.4161/fly.6311 . ПМК 2803330 . ПМИД 18820459 .
- ^ Кэтрин О. Хартли; Стивен Л. Натт; Энрике Амайя (2002). «Направленная экспрессия генов у трансгенных Xenopus с использованием бинарной системы Gal4-UAS» . Труды Национальной академии наук . 99 (3): 1377–82. Бибкод : 2002PNAS...99.1377H . дои : 10.1073/pnas.022646899 . ПМК 122198 . ПМИД 11818539 .
- ^ Дэвисон, Дж. М.; Акитаке CM; Голл МГ; Ри, Дж. М.; Госс, Н.; Байер, Х.; Халперн, Мэн; Лич, SD; Парсонс, MJ (2007). «Трансактивация трансгенных вставок Gal4-VP16 для тканеспецифической маркировки клеток и абляции у рыбок данио» . Биология развития . 304 (2): 811–24. дои : 10.1016/j.ydbio.2007.01.033 . ПМК 3470427 . ПМИД 17335798 .
- ^ Сустер, Максимилиано Л.; Сегнет, Лоран; Бейт, Майкл; Соколовски, Марла Б. (август 2004 г.). «Уточнение экспрессии трансгена, управляемой GAL4, у дрозофилы с помощью ловушки-энхансера GAL80». Бытие . 39 (4): 240–245. дои : 10.1002/gen.20051 . ПМИД 15286996 . S2CID 43478668 .
- ^ Фудзимото, Эстер; Гейнс, Брук; Бримли, Кэмерон; Дж. Чиен, Чи-Бин и Бонковски, Джошуа Л. (2011). «Пересекательная регуляция Gal80 специфической экспрессии определенного типа клеток у позвоночных» . Динамика развития . 240 (10): 2324–2334. дои : 10.1002/dvdy.22734 . ПМК 3178006 . ПМИД 21905164 .
- ^ Луань, Хаоцзян; Пибоди, Натан К.; Винсон, Чарльз Р. и Уайт, Бенджамин Х. (2006). «Усовершенствованное пространственное манипулирование функциями нейронов путем комбинаторного ограничения экспрессии трансгена» . Нейрон . 52 (3): 425–436. дои : 10.1016/j.neuron.2006.08.028 . ПМК 1713190 . ПМИД 17088209 .