ЯСНОСТЬ
ЯСНОСТЬ [1] Это метод придания ткани прозрачности с использованием гидрогелей на основе акриламида , построенных изнутри и связанных с тканью, и, как определено в исходной статье, представляет собой «трансформацию интактной биологической ткани в гибридную форму, в которой определенные компоненты заменяются экзогенными». элементы, которые обеспечивают новую доступность или функциональность». [1] В сочетании с маркировкой на основе антител или генов CLARITY позволяет получать очень подробные изображения структуры белков и нуклеиновых кислот органов, особенно мозга . Его разработали Кванхун Чунг и Карл Дейссерот в Медицинской школе Стэнфордского университета . [2]
В нескольких опубликованных статьях метод CLARITY применялся к широкому спектру тканей и болезненных состояний, таких как иммуноонкология при раке молочной железы человека, [3] при болезни Альцгеймера , Человеческий мозг [4] спинной мозг мыши, [5] модели животных с рассеянным склерозом , [6] и растения. [7] CLARITY также сочетается с другими технологиями для разработки новых методов микроскопии, включая конфокальную расширяющую микроскопию , световую листовую микроскопию SPIM и световую листовую микроскопию, оптимизированную для CLARITY (COLM). [8]
Процедура
[ редактировать ]
Процесс применения изображений CLARITY начинается с посмертного образца ткани. В зависимости от типа ткани после фиксации образца могут потребоваться такие этапы предварительной обработки, как деминерализация или обесцвечивание. Затем для достижения прозрачности необходимо применить серию химических обработок, при которых липидное содержимое образца удаляется, в то время как почти все исходные белки и нуклеиновые кислоты остаются на месте. [1] Целью этого является сделать ткань прозрачной и, таким образом, доступной для детального микроскопического исследования составляющих ее функциональных частей (преимущественно белков и нуклеиновых кислот). Для этого существующую белковую структуру необходимо поместить в прозрачный каркас, который сохранит ее, а липидные компоненты будут удалены. Этот «каркас» состоит из мономеров гидрогеля, таких как акриламид. Добавление таких молекул, как формальдегид , параформальдегид или глутаральдегид, может облегчить прикрепление каркаса к белкам и нуклеиновым кислотам, которые необходимо сохранить, а добавление тепла необходимо для установления реальных связей между клеточными компонентами и акриламидом. [9]
После завершения этого этапа белковые компоненты и компоненты нуклеиновых кислот клеток ткани-мишени прочно удерживаются на месте, в то время как липидные компоненты остаются отделенными. Затем липиды удаляются в течение нескольких дней или недель для пассивной диффузии в моющем средстве или ускоряются электрофоретическими методами до нескольких часов или дней. [10] [11] Усилия по ускорению с помощью электрофоретических методов остаются безрезультатными в отношении способности не вызывать повреждения тканей. Когда они проходят, липофильные свойства моющего средства позволяют ему улавливать и удалять любые липиды, встречающиеся на пути. Липофильные красители, такие как DiI, удаляются, однако существуют липофильные красители, совместимые с CLARITY, которые могут фиксироваться на соседних белках. [12] Подавляющее большинство нелипидных молекул, таких как белки и ДНК, остаются незатронутыми этой процедурой благодаря акриламидному гелю и химическим свойствам задействованных молекул. [9]
Как сообщалось в первоначальной статье, ткань расширяется во время этого процесса, но при необходимости может быть восстановлена до своих первоначальных размеров с помощью заключительного этапа инкубации в растворе, согласующем показатель преломления. [1] Расширение тканей действительно происходит в мозге, который богат липидами; однако было отмечено, что другие типы тканей не испытывают такого сильного расширения тканей на протяжении всего процесса.
На этом этапе процесса образец полностью подготовлен к визуализации. Контраст для визуализации может исходить от эндогенных флуоресцентных молекул, меток нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или иммуноокрашивания , при котором антитела используются , специфически связывающиеся с определенным целевым веществом. Кроме того, эти антитела помечены флуоресцентными метками, которые являются ключом к окончательному результату визуализации. Стандартные методы конфокальной, двухфотонной или световой визуализации подходят для последующего обнаружения излучаемой флуоресценции вплоть до масштаба локализации белка, что приводит к получению окончательных высокодетализированных и трехмерных изображений, которые создает CLARITY. [9]
После того, как образец подвергся иммуноокрашиванию для получения изображения, можно удалить антитела и повторно нанести новые, что позволяет визуализировать образец несколько раз и нацеливаться на несколько типов белков. [13] [14]
Приложения
[ редактировать ]Что касается визуализации мозга, способность визуализации CLARITY выявлять конкретные структуры с такой беспрепятственной детализацией привела к многообещающим направлениям будущих приложений, включая прокладку локальных цепей (особенно в рамках проекта «Коннектом» ), взаимоотношения между нервными клетками, роль субклеточных клеток. структуры, лучшее понимание белковых комплексов и визуализация нуклеиновых кислот и нейротрансмиттеров . [1] Примером открытия, сделанного с помощью визуализации CLARITY, является своеобразная «лестничная» модель, в которой нейроны соединяются обратно друг с другом и со своими соседями, что наблюдалось у животных и было связано с поведением, подобным аутизму . [15]
Техника CLARITY распространилась на несколько приложений за пределами мозга. [16] Было опубликовано множество модификаций, основанных на первоначальных публикациях, и были предприняты усилия как в академических кругах, так и в биотехнологической отрасли для применения широкого применения CLARITY. CLARITY продолжает набирать обороты как новая технология, которая может дать ценную информацию о клинической диагностике в будущем. CLARITY можно использовать с небольшими модификациями или без них для очистки большинства других органов, таких как печень, поджелудочная железа, селезенка, яички и яичники, а также других видов, таких как рыбки данио. В то время как кость требует простой стадии декальцинации, растительная ткань требует ферментативного разрушения клеточной стенки. [10]
НИЗ Директор Фрэнсис Коллинз уже выразил надежду на эту новую технологию, заявив: [17]
«CLARITY — это мощный инструмент. Он позволит исследователям изучать неврологические заболевания и расстройства, концентрируясь на больных или поврежденных структурах, не теряя при этом глобальной перспективы. Это то, чего мы никогда раньше не могли сделать в трех измерениях».
Ограничения
[ редактировать ]Хотя процедура CLARITY достигла беспрецедентного уровня удержания белков после экстракции липидов, при этом методе по-прежнему теряется около 8% белков за один раз детергентного электрофореза. [13] Повторная визуализация одного образца только усилит эту потерю, поскольку удаление антител обычно осуществляется с помощью того же процесса детергента, который используется для создания исходного образца. [9] Однако в этих расчетах, похоже, отсутствует последовательный метод расчета общей потери белка на протяжении всего эксперимента. Компания ClearLight Biotechnologies, основанная Карлом Дейссеротом, обнаружила, что первоначально опубликованный процесс удаления антител с помощью моющего средства не был идеальным подходом, и разработала средство для удаления пятен, которое не наносило такого ущерба целостности тканей.
Другими потенциальными недостатками этого метода являются время, необходимое для создания и изображения образца ( только иммуногистохимическое окрашивание занимает до шести недель), а также тот факт, что используемый акриламид высокотоксичен и канцерогенен . Время часто называют ограничивающим фактором и недостатком использования метода CLARITY; однако несколько академических и биотехнологических компаний (Logos Bioscience, ClearLight Biotechnologies) продолжили разработку и оптимизацию реагентов CLARITY, которые значительно сократили сроки иммуноокрашивания, сократив процесс с шести недель до недели в зависимости от типа образца. У всех очисток тканей есть свои проблемы с безопасностью. Хотя акриламид считается токсичным и канцерогенным, его компоненты аналогичны компонентам, содержащимся в гелях, используемых для вестерн-блоттинга.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и Чунг К., Уоллес Дж., Ким С.Ю., Кальянасундарам С., Андалман А.С., Дэвидсон Т.Дж., Мирзабеков Дж.Дж., Залокуски К.А., Мэттис Дж., Денисин А.К., Пак С., Бернштейн Х., Рамакришнан С., Гросеник Л., Градинару В., Дейсерот К. (май 2013 г.) ). «Структурное и молекулярное исследование интактных биологических систем» . Природа . 497 (7449): 332–7. Бибкод : 2013Natur.497..332C . дои : 10.1038/nature12107 . ПМК 4092167 . ПМИД 23575631 .
- ^ Андервуд Э. (апрель 2013 г.). «Нейронаука. Метод визуализации тканей проясняет все». Наука . 340 (6129): 131–2. дои : 10.1126/science.340.6129.131 . ПМИД 23580500 .
- ^ Чен Ю, Шен Кью, Уайт С.Л., Гокмен-Полар Ю, Бадве С., Гудман Л.Дж. (апрель 2019 г.). «Трехмерная визуализация и количественный анализ тканей рака молочной железы, обработанных CLARITY» . Научные отчеты . 9 (1): 5624. Бибкод : 2019НатСР...9.5624С . doi : 10.1038/s41598-019-41957-w . ПМК 6449377 . ПМИД 30948791 .
- ^ Андо К., Лаборд К., Лазар А., Годфруа Д., Юсеф И., Амар М., Пулер А., Потье М.С., Делатур Б., Дуйкертс К. (сентябрь 2014 г.). «Внутри мозга при болезни Альцгеймера с ЯСНОСТЬЮ: старческие бляшки, нейрофибриллярные клубки и аксоны в 3D» . Акта Нейропатологика . 128 (3): 457–9. дои : 10.1007/s00401-014-1322-y . ПМЦ 4131133 . ПМИД 25069432 .
- ^ Чжан М.Д., Торториелло Г., Сюэ Б., Томер Р., Йе Л., Мициос Н., Боргиус Л., Грант Г., Кин О., Ватанабе М., Улен М., Малдер Дж., Дейссерот К., Харкани Т., Хёкфельт Т.Г. (март 2014 г.). «Нейрональные кальцийсвязывающие белки на 1/2 локализуются в ганглиях дорсальных корешков и возбуждающих нейронах спинного мозга и регулируются повреждением нервов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 111 (12): E1149-58. Бибкод : 2014PNAS..111E1149Z . дои : 10.1073/pnas.1402318111 . ПМК 3970515 . ПМИД 24616509 .
- ^ Спенс Р.Д., Курт Ф., Ито Н., Монгерсон Ч.Р., Уэйлс С.Х., Пэн М.С., Маккензи-Грэм А.Дж. (ноябрь 2014 г.). «Внесение ЯСНОСТИ в атрофию серого вещества» . НейроИмидж . 101 : 625–32. doi : 10.1016/j.neuroimage.2014.07.017 . ПМЦ 4437539 . ПМИД 25038439 .
- ^ Палмер В.М., Мартин А.П., Флинн Дж.Р., Рид С.Л., Уайт Р.Г., Фёрбанк РТ, Гроф К.П. (сентябрь 2015 г.). «PEA-CLARITY: 3D-молекулярная визуализация целых органов растения» . Научные отчеты . 5 : 13492. Бибкод : 2015NatSR...513492P . дои : 10.1038/srep13492 . ПМК 4556961 . ПМИД 26328508 .
- ^ Томер Р., Йе Л., Сюэ Б., Дейссерот К. (июль 2014 г.). «Advanced CLARITY для быстрого получения изображений интактных тканей с высоким разрешением» . Протоколы природы . 9 (7): 1682–97. дои : 10.1038/nprot.2014.123 . ПМК 4096681 . ПМИД 24945384 .
- ^ Jump up to: а б с д Гиган-Брейнер С. (2013). «ЯСНОСТЬ Мозговой визуализации» . Стэнфордский университет.
- ^ Jump up to: а б Дженсен К.Х., Берг Р.В. (декабрь 2017 г.). «Достижения и перспективы очистки тканей с помощью CLARITY» . Журнал химической нейроанатомии . 86 : 19–34. doi : 10.1016/j.jchemneu.2017.07.005 . ПМИД 28728966 . S2CID 27575056 .
- ^ Lee E, Choi J, Jo Y, Kim JY, Jang YJ, Lee HM, Kim SY, Lee HJ, Cho K, Jung N, Hur EM, Jeong SJ, Moon C, Choe Y, Рю IJ, Ким Х, Сун W (январь 2016 г.). «ACT-PRESTO: метод быстрой и последовательной очистки и маркировки тканей для трехмерной (3D) визуализации» . Научные отчеты . 6 (1): 18631. Бибкод : 2016NatSR...618631L . дои : 10.1038/srep18631 . ПМЦ 4707495 . ПМИД 26750588 .
- ^ Дженсен К.Х., Берг Р.В. (сентябрь 2016 г.). «CLARITY-совместимые липофильные красители для маркировки электродов и отслеживания нейронов» . Научные отчеты . 6 : 32674. Бибкод : 2016NatSR...632674J . дои : 10.1038/srep32674 . ПМК 5011694 . ПМИД 27597115 .
- ^ Jump up to: а б Шен, Хелен (10 апреля 2013 г.). «Прозрачный мозг проясняет связи» . Новости природы .
- ^ Мюррей Э, Чо Дж.Х., Гудвин Д., Ку Т., Суэйни Дж., Ким С.И., Чой Х., Пак Ю.Г., Пак Дж.Й., Хабберт А., МакКью М., Вассалло С., Бах Н., Фрош М.П., Ведин В.Дж., Сын Х.С., Чунг К. (декабрь 2015 г.). «Простая масштабируемая протеомная визуализация для многомерного профилирования интактных систем» . Клетка . 163 (6): 1500–14. дои : 10.1016/j.cell.2015.11.025 . ПМК 5275966 . ПМИД 26638076 .
- ^ «Прозрачные мозги» . Видео о природе.
- ^ «Применение очистки тканей: ЯСНОСТЬ за пределами мозга» .
- ^ Коллинз Ф (11 апреля 2013 г.). «Мозг: сейчас видишь, скоро не увидишь» . Блог директоров НИЗ . НАЦИОНАЛЬНЫЕ ИНСТИТУТЫ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ США.