Разрыв в сахарозе
Техника сахарозного разрыва используется для создания блока проводимости в нервных или мышечных волокнах. высокая концентрация сахарозы Во внеклеточное пространство наносится , которая препятствует правильному открытию и закрытию натриевых и калиевых каналов , повышая резистентность между двумя группами клеток. Первоначально он был разработан Робертом Штемпфли для регистрации потенциалов действия в нервных волокнах. [1] и особенно полезен для измерения необратимых или сильно варьирующих фармакологических модификаций свойств каналов, поскольку необработанные участки мембраны могут втягиваться в узел между областями сахарозы . [2]
История
[ редактировать ]Техника разрыва сахарозы была впервые предложена Робертом Штемпфли в 1954 году. [3] который работал с Аланом Ходжкиным и Эндрю Хаксли в период с 1947 по 1949 год. В результате своих исследований Штемпфли определил, что токи, движущиеся по нервным волокнам, легче измерить, когда существует зазор с высоким сопротивлением, который уменьшает количество проводящей среды вне клетки. Штемпфли заметил множество проблем со способами измерения мембранного потенциала, которые использовались в то время. Он экспериментировал с новым методом, который назвал сахарозным разрывом. Метод был использован для изучения потенциалов действия в нервных волокнах. [3]
Хаксли наблюдал за методом Штемпфли и согласился, что он полезен и дает очень мало ошибок. Метод сахарозного разрыва также способствовал открытию Штемпфли и Хаксли потенциалов тормозного соединения. [4] С момента своего появления в эту технику было внесено множество улучшений и изменений. Одна модификация метода одиночного разрыва сахарозы была предложена CHV Hoyle в 1987 году. [5] Метод двойного сахарозного интервала, который впервые был использован Ружье, Вассортом и Штемпфли для изучения сердечных клеток в 1968 году, был усовершенствован К. Леоти и Дж. Аликсом, которые представили улучшенную камеру для двойного сахарозного интервала с методом фиксации напряжения , который устранил внешнее сопротивление от узла. [6]
Метод
[ редактировать ]Классический метод сахарозного разрыва обычно предполагает три камеры, каждая из которых содержит сегмент нейрона изучаемого или клеток. Испытательная камера содержит физиологический раствор, такой как раствор Кребса или Рингера , который имитирует концентрацию ионов и осмотическое давление естественной среды клетки. В эту камеру также можно добавлять тестируемые лекарства, чтобы изучить их влияние на клеточную функцию. Для стимуляции клеток в тестируемом растворе обычно используются электроды Ag-AgCl или платиновая проволока. Сахарозная камера (или щель) — это средняя камера, которая разделяет две другие камеры или участки нервного волокна или клеток. В этой камере находится изотонический сахарозы раствор с высоким удельным сопротивлением. Удельное сопротивление описывает способность материала или раствора противостоять электрическому току, поэтому раствор сахарозы с высоким удельным сопротивлением эффективен для электрической изоляции трех камер. Третья камера обычно содержит раствор KCl, имитирующий внутриклеточный раствор. Высокий Концентрация калия в этой камере деполяризует погруженный сегмент ткани, позволяя измерить разницу потенциалов между двумя сегментами, разделенными сахарозным зазором. Вазелин, силиконовая смазка или смесь кремния и вазелина используются для герметизации нерва или ткани и предотвращения диффузии раствора между камерами. Пара электродов Ag-AgCl с агаровыми мостиками помещается в тестовую камеру и камеру KCl для регистрации изменений мембранного потенциала. [7]
Методика одиночного разрыва сахарозы
[ редактировать ]Метод одиночной сахарозной щели используется для изучения электрической активности клеток. Это полезно при исследовании небольших нервных волокон и электрически связанных клеток, таких как гладкомышечные клетки. Метод создает блок проводимости в нервном или мышечном волокне путем создания зазора с высоким сопротивлением между двумя группами клеток. Неионогенный раствор сахарозы используется для повышения устойчивости во внеклеточной области между двумя группами. [8] Это позволяет всему току, возникающему на одной стороне зазора, течь на другую сторону только через внутреннюю часть нерва или ткани. Изменения электрического потенциала между двумя группами относительно друг друга можно измерить и записать. [7]
Техника двойного разрыва сахарозы
[ редактировать ]Были внесены изменения в метод единственного разрыва сахарозы. Одна из модификаций называется методом двойного разрыва сахарозы. Это используется для измерения сопротивления одновременного и мембранного потенциала. В двух камерах, содержащих растворы сахарозы, выделяют узел нерва или ткани, который погружают в физиологический раствор. Два конца нерва или ткани деполяризуются раствором, богатым ионами калия. Разность потенциалов между узлом или испытательной камерой и одной из камер, богатых калием, может быть измерена, в то время как потенциал в узле может быть изменен за счет тока, вырожденного между другой камерой, богатой калием, и узлом. Полученную информацию можно использовать вместе с уравнением закона Ома для определения сопротивления мембраны клеток внутри узла. [8] Двойной сахарозный промежуток также можно использовать в качестве фиксатора напряжения. [9] При использовании соответствующей электроники двойной сахарозный зазор можно использовать для ограничения мембранного потенциала сегмента нерва или ткани, содержащегося в испытательной камере. [8]
Преимущества и ограничения
[ редактировать ]Преимущества
[ редактировать ]Метод сахарозной щели позволяет измерять ионные токи в многоклеточных тканях. Хотя методы фиксации напряжения и патч-фиксации также эффективны при изучении функций нейронов, метод сахарозного разрыва проще в исполнении и дешевле. Кроме того, метод сахарозного разрыва может обеспечить стабильные записи из небольших клеток, таких как нервные волокна или гладкомышечные клетки, в течение длительного периода времени. Однако очень сложно добиться подобных измерений с помощью внутриклеточных или патч-зажимных электродов, поскольку они могут физически повредить небольшие аксоны или клетки. Благодаря расположению камер с сахарозной щелью техника стимуляции нейрона или клетки проста и надежна. Этот метод также полезен при изучении изменений мембранного потенциала в ответ на различные фармакологически активные вещества, которые можно вводить в испытательную камеру. [7]
Ограничения
[ редактировать ]Основным ограничением одиночного разрыва сахарозы является то, что он не может определить реальные значения мембранного потенциала и амплитуды потенциала действия. он может измерять только относительные изменения потенциала между областями, разделенными раствором сахарозы Из-за эффекта шунтирования . Однако двойная сахарозная щель позволяет измерить мембранный потенциал и сопротивление. Другое ограничение состоит в том, что мембранные потенциалы не могут быть получены из тканей, где нет электрической связи между клетками (т.е. когда пространственная константа λ близка к нулю). [7] Кроме того, раствор сахарозы, имеющий низкую концентрацию ионов, может истощать открытые клетки жизненно важных внутриклеточных ионов, таких как натрий и калий, что может повлиять на их жизнеспособность. [8] Это может привести к гиперполяризации мембраны и повлиять на проводимость потенциалов действия вдоль клетки. Несмотря на эти ограничения, многие преимущества метода сахарозного разрыва делают его полезным и надежным методом в нейробиологических исследованиях. [7]
Приложения
[ редактировать ]Метод сахарозной щели используется для регистрации активности мембран миелинизированных нервов, немиелиновых нервов, гладких мышц и сердечной мышцы. Наряду с микроэлектродными методами и методами «пэтч-кламп» сахарозная щель часто используется экспериментаторами для изучения нервной системы и может служить эффективным методом исследования влияния лекарственных препаратов на активность мембран . [7] Исследования по влиянию холина , ацетилхолина и карбахола на потенциалы покоя верхнего шейного ганглия кроликов проведены методом сахарозной щели. Запись мембранных потенциалов в верхнем шейном ганглии упростилась с помощью метода сахарозной щели, поскольку он позволяет разделить деполяризацию ганглия и внутреннего сонного нерва. [10]
Метод сахарозного разрыва был применен для определения связи между внешней концентрацией калия и мембранным потенциалом гладкомышечных клеток с использованием мочеточников морских свинок. [11] Его также использовали для исправления неточных измерений мембранного потенциала, вызванных токами утечки через мембрану и внеклеточным сопротивлением. Коррекция неточных показаний мембранного тока также возможна за счет использования метода сахарозной щели. [12]
Развитие метода определения сахарозной разницы привело к созданию методов двойной сахарозной разницы. Двойная сахарозная щель обычно предпочтительна при использовании для электрической изоляции меньших сегментов нервных волокон, чем это было бы возможно при использовании одинарной сахарозной щели. [11] как это было сделано в исследованиях мембранных потенциалов и токов в мышечных волокнах желудочков овец и теленка . [13] Метод двойной сахарозной щели также используется вместо одинарной сахарозной щели для изучения сердечной мышцы, где он позволяет более четко определить ранние токи, возникающие в течение первых 10–100 миллисекунд деполяризации. [11]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Штемпфли, Р. (1954). «Новый метод измерения мембранных потенциалов с помощью внешних электродов». Эксперименты . 10 (12): 508–509. дои : 10.1007/BF02166189 . ПМИД 14353097 . S2CID 41384989 .
- ^ Пулер, JP; Валенцено, ДП. (1983). «Пересмотр метода двойной сахарозной щели для изучения гигантских аксонов омара. Теория и эксперименты» . Биофиз Дж . 44 (2): 261–269. Бибкод : 1983BpJ....44..261P . дои : 10.1016/S0006-3495(83)84298-2 . ПМЦ 1434829 . ПМИД 6652217 .
- ^ Jump up to: а б Акерт, К. (август 1996 г.). Вклад Швейцарии в нейронауки за четыреста лет: от эпохи Возрождения до наших дней . Издательство Fachvereine Hochschulverlag AG в ETH Zurich. ISBN 978-3728123626 .
- ^ Беннетт, Макс Р. (2001). «Открытие электрических признаков тормозной передачи: потенциал тормозного перехода». История Синапса . Амстердам: ОПА. стр. 114–118. ISBN 978-9058232335 .
- ^ Стемпфли, Роберт (1988). «Классическое издание этой недели: Штемпфли, Р. Новый метод измерения мембранных потенциалов с помощью внешних электродов» (PDF) . Текущее содержание . 31 (34): 19.
- ^ Леоти, К; Аликс, Дж. (1976). «Некоторые технические улучшения зажима напряжения с двойным сахарозным зазором: Архив Pflügers». Европейский журнал физиологии . 365 (1): 95–97. дои : 10.1007/BF00583633 . ПМИД 988547 . S2CID 20867630 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Мерт, Т (2007). «Техника сахарозного разрыва: преимущества и ограничения». Нейрофизиология . 38 (3): 237–241. дои : 10.1007/s11062-007-0031-8 . S2CID 35099707 .
- ^ Jump up to: а б с д Гагинелла, Тимоти С. (1996). Справочник по методам желудочно-кишечной фармакологии . Бока-Ратон, Флорида: CRC Press, Inc., стр. 248–251. ISBN 978-0849383045 .
- ^ Мур, Джон В. (2007). «Зажим напряжения» . Схоларпедия . 2 (9): 3060. Бибкод : 2007SchpJ...2.3060M . doi : 10.4249/scholarpedia.3060 .
- ^ Костерлиц, HW; Лиз, GM; Уоллис., Д.И. (1968). «Потенциалы покоя и действия, зарегистрированные методом сахарозного разрыва в верхнем шейном ганглии кролика» . Дж. Физиол . 195 (1): 39–53. doi : 10.1113/jphysicalol.1968.sp008445 . ПМЦ 1557902 . ПМИД 5639803 .
- ^ Jump up to: а б с Харрингтон, Л; Джонсон, Э.А. (1973). «Напряженное зажим сердечной мышцы при двойном сахарозном разрыве. Технико-экономическое обоснование» . Биофизический журнал . 13 (7): 626–47. Бибкод : 1973BpJ....13..626H . дои : 10.1016/S0006-3495(73)86013-8 . ПМЦ 1484318 . ПМИД 4715582 .
- ^ Голдман, Йельский университет; Мартин, Морад (1977). «Измерение трансмембранного потенциала и тока в сердечной мышце: новый метод фиксации напряжения» . Дж. Физиол . 268 (3): 613–54. дои : 10.1113/jphysicalol.1977.sp011875 . ПМЦ 1283682 . ПМИД 301933 .
- ^ Макгиган, Джон; Цянь, RW (1974). «Некоторые ограничения двойной сахарозной щели и ее использование в исследовании медленного внешнего тока в желудочковой мышце млекопитающих» . Дж. Физиол . 240 (3): 775–806. doi : 10.1113/jphysicalol.1974.sp010634 . ПМК 1331006 . ПМИД 4415829 .