Лизисный буфер

Буфер для лизиса представляет собой буферный раствор, используемый с целью вскрытия клеток для использования в экспериментах по молекулярной биологии , которые анализируют лабильные макромолекулы клеток (например, вестерн-блоттинг для белка или для экстракции ДНК ). Большинство буферов для лизиса содержат буферные соли (например, трис-HCl ) и ионные соли (например, ) для регулирования pH и осмолярности лизата NaCl . моющие средства (например, Тритон Х-100 или ДСН Иногда для разрушения мембранных структур добавляются ). В буферы для лизиса, предназначенные для экстракции белка , ингибиторы протеазы часто включаются , и в сложных случаях они могут быть практически необходимы. Буферы для лизиса можно использовать как на клетках животных, так и на растительных тканях. ^{[ 1 ]}

Выбор буфера

Основная цель лизирующего буфера — изолировать интересующие молекулы и сохранять их в стабильной среде. Что касается белков, то для некоторых экспериментов целевые белки должны быть полностью денатурированы , тогда как в некоторых других экспериментах целевой белок должен оставаться свернутым и функциональным. Различные белки также обладают разными свойствами и находятся в разных клеточных средах. Таким образом, важно выбрать лучший буфер в зависимости от цели и плана экспериментов. Важными факторами, которые следует учитывать, являются: pH, ионная сила, использование моющих средств, ингибиторов протеазы для предотвращения протеолитических процессов. ^{[ 2 ]} Например, добавление детергента необходимо при лизисе грамотрицательных бактерий, но не для грамположительных бактерий. ^{[ 3 ]} Обычно в буфер для лизиса добавляют ингибитор протеазы вместе с другими предпочтительными ингибиторами ферментов, такими как ингибитор фосфатазы, при изучении белков с фосфорилированием.

Компоненты

Буфер

Буфер создает среду для изолированных белков. Каждый выбор буфера имеет определенный диапазон pH, поэтому буфер следует выбирать в зависимости от того, стабилен ли целевой белок эксперимента при определенном pH. Кроме того, для буферов с аналогичными диапазонами pH важно учитывать, совместим ли буфер с целевым белком эксперимента. ^{[ 4 ]} В таблице ниже приведены несколько наиболее часто используемых буферов и их диапазоны pH. ^{[ 4 ]}

Буфер	Диапазон pH
Дигидрофосфат натрия/динатрий гидрофосфат	5.8 - 8.0
Трис - HCl	7.0 - 9.0
ГЕПЕС - NaOH	7.2 - 8.2

Добавки

Соли

Буфер для лизиса обычно содержит одну или несколько солей. Функция солей в лизирующем буфере заключается в установлении ионной силы в буферном растворе. Некоторые из наиболее часто используемых солей — это NaCl, KCl и (NH ₄ ) ₂ SO _4. Обычно их используют в концентрации от 50 до 150 мМ. ^{[ 4 ]}

Структура додецилсульфата натрия (ДСН)

Моющее средство

Моющие средства представляют собой органические амфипатические (с гидрофобным хвостом и гидрофильной головкой) поверхностно-активные вещества. Они используются для отделения мембранных белков от мембраны, поскольку гидрофобная часть детергента может окружать биологические мембраны и, таким образом, изолировать мембранные белки от мембран. ^{[ 5 ]} Хотя моющие средства широко используются и имеют схожие функции, физические и химические свойства интересующих моющих средств необходимо учитывать в свете целей эксперимента.

Моющие средства часто подразделяют на неионогенные, анионные, катионные или цвиттер-ионные в зависимости от их гидрофильной головной группы. ^{[ 5 ]}

Неионогенные детергенты, такие как Triton X-100 , и цвиттерионные детергенты, такие как CHAPS (3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат), неденатурируют (не нарушают функции белка). Ионные детергенты, такие как додецилсульфат натрия (SDS), и катионные детергенты, такие как бромид этилтриметиламмония, денатурируют (нарушают функции белков). ^{[ 6 ]} Детергенты являются основным ингредиентом, определяющим силу лизиса данного лизирующего буфера.

Буферы для клеточного лизиса без детергентов

Одной из распространенных проблем, с которыми сталкиваются многие буферы для лизиса клеток, является разрушение белковых структур во время процесса лизиса, частично вызванное использованием детергентов. Детергенты часто препятствуют восстановлению нативных условий, необходимых для правильного сворачивания белка. ^{[ 7 ]}

В течение длительного времени после лизиса клеток с использованием детергента приходилось проводить замену буфера и/или диализ для удаления детергента среди других мешающих соединений и восстановления нативных условий. ^{[ 8 ]}

Чтобы преодолеть эту проблему, появилось решение в виде буфера для лизиса клеток, не содержащего детергентов. В буфере GentleLys вместо детергентов используются сополимеры, что обеспечивает эффективный лизис клеток, сохраняя при этом нативную среду, необходимую для правильного сворачивания клеточных компонентов, таких как белки.

Другие

Другие добавки включают ионы металлов, сахара, такие как глюкоза, глицерин, хелаторы металлов (например, ЭДТА ) и восстановители, такие как дитиотреитол (ДТТ). ^{[ 4 ]}

Часто используемые буферы

Лизисный буфер NP-40

Это может быть наиболее широко используемый буфер для лизиса. Солюбилизирующим агентом является NP-40 , который можно заменить другими моющими средствами в разных концентрациях. Поскольку NP-40 является неионогенным детергентом, этот буфер для лизиса оказывает более мягкий эффект, чем буфер RIPA. Его можно использовать, когда функции белка должны быть сохранены с минимальными нарушениями. ^{[ 9 ]}

Рецепт: ^{[ 9 ]}

150 мМ NaCl
1,0% Нонидет П-40 или Тритон Х-100
50 мМ Трис-Cl
Доведите pH до 7,4.

Буфер для лизиса RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay)

Буфер RIPA — это широко используемый буфер для лизиса для иммунопреципитации и общей экстракции белка из клеток и тканей. Буфер можно хранить без ванадата при температуре 4 °C до 1 года. ^{[ 10 ]} Буфер RIPA высвобождает белки из клеток, а также нарушает наиболее слабые взаимодействия между белками. ^{[ 9 ]}

Рецепт: ^{[ 10 ]}

1% (по массе) Нонидет П-40 (НП-40)
1% (мас./об.) дезоксихолата натрия
0.1% (w/v) SDS
0,15 М NaCl
0,01 М фосфат натрия, pH 7,2
2 мМ ЭДТА
50 мМ фторид натрия (NaF)
0,2 мМ свежего ортованадата натрия (Na ₃ VO ₄ .2H ₂ O, он обладает функцией ингибитора фосфатазы, поскольку имитирует фосфат)
Ингибитор протеазы 100 ЕД/мл, например апротинин

SDS (додецилсульфат натрия) буфер для лизиса

SDS – ионно-денатурирующее моющее средство. Горячий буфер SDS часто используется, когда белки необходимо полностью солюбилизировать и денатурировать.

Рецепт: ^{[ 10 ]}

0.5% (w/v) SDS
0,05 М Трис⋅Cl
Отрегулируйте pH до 8,0.
Добавьте 1 мМ свежего дитиотреитола (ДТТ).

Лизирующий буфер ACK (аммоний-хлорид-калий)

ACK используется для лизиса эритроцитов другие клетки, такие как лейкоциты . в биологических образцах, где больший интерес представляют ^{[ 11 ]}

Рецепт: ^{[ 12 ]}^{[ 13 ]}

150 мМ хлорид аммония
10 мМ бикарбонат калия
0,1 мМ ЭДТА
Отрегулируйте pH до 7,2-7,4.

ДжентлЛис (Gentle Lysis)

В буфере GentleLys используются синтетические нанодисковые сополимеры, которые мягко разрушают клеточную мембрану, предлагая более мягкую альтернативу обычным буферам для лизиса на основе детергентов. Этот щадящий подход исключает необходимость использования агрессивных химикатов, создавая среду, сохраняющую естественное состояние клеточных белков. Следовательно, белки сохраняют свою структурную целостность и функциональность, что является заметным отличием от денатурирующего воздействия буферов на основе детергентов.

Моющие средства, соли и ферменты

Лизис клеток является важным этапом очистки ферментов из бактериальных клеток. В лизирующие буферы обычно включаются различные компоненты, способствующие эффективному разрушению клеток и высвобождению целевого фермента. Эти компоненты включают детергенты, соли и ферменты, каждый из которых играет определенную роль в процессе лизиса. Примеры детергентов, используемых в лизирующих буферах, включают:

Моющие средства:

Моющие средства представляют собой амфипатические молекулы, обладающие как гидрофильными, так и гидрофобными свойствами. В контексте лизиса клеток детергенты действуют путем разрушения липидного бислоя мембраны бактериальных клеток, что приводит к проницаемости мембраны и высвобождению внутриклеточных компонентов, включая целевой фермент.

Обычно используемые детергенты в лизирующих буферах включают:

а. Тритон Х-100 : неионогенный детергент, часто используемый из-за его мягких и эффективных мембраноразрушающих свойств. Он солюбилизирует липиды и мембранные белки, позволяя высвободить внутриклеточное содержимое.

б. Додецилсульфат натрия (SDS): анионное детергент, который денатурирует белки, разрушая их вторичные и третичные структуры, растворяет клеточные мембраны и способствует экстракции белков.

в. Твин-20: неионогенное моющее средство более мягкое по сравнению с SDS и Triton X-100. Он способствует проницаемости мембран и солюбилизации белков, не вызывая значительной денатурации.

Соли:

Соли являются важнейшими компонентами лизирующих буферов, поскольку они помогают поддерживать оптимальные клеточные условия и обеспечивают ионную силу, способствующую разрушению клеток.

Обычно используемые соли в лизирующих буферах включают:

а. Хлорид натрия (NaCl): NaCl часто добавляют для поддержания изотонических условий, предотвращая осмотический шок и разрыв клеток во время процесса лизиса.

б. Хлорид калия (KCl). Подобно NaCl, KCl можно использовать для регулирования ионной силы и облегчения лизиса клеток.

Ферменты:

Определенные ферменты добавляются в лизирующие буферы для усиления лизиса клеток путем расщепления определенных клеточных компонентов, которые могут мешать экстракции целевого фермента.

Примеры ферментов, используемых в лизирующих буферах, включают:

а. Лизоцим: Лизоцим разрушает пептидогликановый слой клеточных стенок бактерий, ослабляя их структурную целостность и способствуя последующему разрушению. Он особенно эффективен для грамположительных бактерий.

б. ДНКаза (дезоксирибонуклеаза): ДНКаза разрушает ДНК, присутствующую в лизате, уменьшая ее вязкость и предотвращая вмешательство, связанное с ДНК, на последующих этапах очистки.

в. РНКаза (рибонуклеаза): подобно ДНКазе, РНКаза разрушает РНК в лизате, уменьшая его вязкость и сводя к минимуму вмешательство, связанное с РНК.

Конкретная комбинация и концентрации детергентов, солей и ферментов в лизирующих буферах могут варьироваться в зависимости от целевого фермента, типа клеток и экспериментальных требований. Оптимизация этих компонентов имеет решающее значение для достижения эффективного лизиса клеток при сохранении стабильности и активности желаемых фермент в процессе очистки.

Лизисный буфер в исследованиях ДНК и РНК

В таких исследованиях, как дактилоскопия ДНК, для выделения ДНК используется лизирующий буфер. В крайнем случае можно использовать мыло для посуды, чтобы разрушить клеточные и ядерные мембраны, позволяя высвободить ДНК. Другие подобные буферы для лизиса включают запатентованный продукт Qiagen Buffer P2.

Ссылки

^ Пош, Антон (01 декабря 2014 г.). «Руководство по подготовке проб для двумерного электрофореза». Архив физиологии и биохимии . 120 (5): 192–197. дои : 10.3109/13813455.2014.955031 . ISSN 1744-4160 . ПМИД 25211021 . S2CID 42029377 .
^ Персик, Мэнди; Марш, Ноэль; Мискевич, Эвал.; Макфи, Дэниел Дж. (01.01.2015). «Солюбилизация белков: важность выбора буфера для лизиса». В Куриене, Биджи Т.; Скофилд, Р. Хэл (ред.). Вестерн-блоттинг . Методы молекулярной биологии. Том. 1312. Спрингер Нью-Йорк. стр. 49–60. дои : 10.1007/978-1-4939-2694-7_8 . ISBN 9781493926930 . ПМИД 26043989 .
^ Пош, Антон (2008). 2D-СТРАНИЦА: Подготовка проб и фракционирование . Хумана Пресс. стр. 24 . ISBN 978-1-58829-722-8 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д дел, EMBL - Управление информации и общественности. «Очистка белка – Экстракция и осветление – Выбор буфера для лизиса и добавок – EMBL» . www.embl.de. Проверено 16 марта 2016 г.
^ Перейти обратно: ^а ^б Линке, Дирк (1 января 2009 г.). «Глава 34. Моющие средства: обзор». У Ричарда Р. Берджесса; Мюррей П. Дойчер (ред.). Руководство по очистке белков, 2-е издание . Методы энзимологии. Том. 463. стр. 603–617. дои : 10.1016/s0076-6879(09)63034-2 . ISBN 9780123745361 . ПМИД 19892194 .
^ «Моющие средства для лизиса клеток и экстракции белка» . www.thermofisher.com . Проверено 16 марта 2016 г.
^ Шехадул Ислам, Мохаммед; Арьясомаяджула, Адитья; Сельваганапати, Поннамбалам Рави (март 2017 г.). «Обзор методов макро- и микромасштабного лизиса клеток» . Микромашины . 8 (3): 83. дои : 10,3390/ми8030083 . ISSN 2072-666X . ПМК 6190294 .
^ Браун, Роберт Б; Одет, Джули (06 октября 2008 г.). «Современные методы лизиса одиночных клеток» . Журнал интерфейса Королевского общества . 5 (дополнение_2): S131-8. doi : 10.1098/rsif.2008.0009.focus . ISSN 1742-5689 . ПМК 2504493 . ПМИД 18426769 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Цзи, Хун (01 августа 2010 г.). «Лизис культивируемых клеток для иммунопреципитации» . Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2010 (8): pdb.prot5466. дои : 10.1101/pdb.prot5466 . ISSN 1940-3402 . ПМИД 20679375 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Сефтон, Бартоломью М. (1 января 2001 г.). «Метки культивируемых клеток 32Pian и подготовка клеточных лизатов для иммунопреципитации». Мечение культивируемых клеток 32Pi и приготовление клеточных лизатов для иммунопреципитации . Том. Глава 18. John Wiley & Sons, Inc., стр. Раздел 18.2. дои : 10.1002/0471142727.mb1802s40 . ISBN 9780471142720 . ПМИД 18265167 . S2CID 20969356 . {{cite book}}: |journal= игнорируется ( помогите )
^ Буфер освещения ACK
^ «Лизирующий буфер ACK» . Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2014 (11): pdb.rec083295. 2014. doi : 10.1101/pdb.rec083295 .
^ «A10492 — Лизирующий буфер ACK — США» .

[1] Пош, Антон (01 декабря 2014 г.). «Руководство по подготовке проб для двумерного электрофореза». Архив физиологии и биохимии . 120 (5): 192–197. дои : 10.3109/13813455.2014.955031 . ISSN 1744-4160 . ПМИД 25211021 . S2CID 42029377 .

[2] Персик, Мэнди; Марш, Ноэль; Мискевич, Эвал.; Макфи, Дэниел Дж. (01.01.2015). «Солюбилизация белков: важность выбора буфера для лизиса». В Куриене, Биджи Т.; Скофилд, Р. Хэл (ред.). Вестерн-блоттинг . Методы молекулярной биологии. Том. 1312. Спрингер Нью-Йорк. стр. 49–60. дои : 10.1007/978-1-4939-2694-7_8 . ISBN 9781493926930 . ПМИД 26043989 .

[3] Пош, Антон (2008). 2D-СТРАНИЦА: Подготовка проб и фракционирование . Хумана Пресс. стр. 24 . ISBN 978-1-58829-722-8 .

[:0-4] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д дел, EMBL - Управление информации и общественности. «Очистка белка – Экстракция и осветление – Выбор буфера для лизиса и добавок – EMBL» . www.embl.de. Проверено 16 марта 2016 г.

[Linke_603–617-5] Перейти обратно: ^а ^б Линке, Дирк (1 января 2009 г.). «Глава 34. Моющие средства: обзор». У Ричарда Р. Берджесса; Мюррей П. Дойчер (ред.). Руководство по очистке белков, 2-е издание . Методы энзимологии. Том. 463. стр. 603–617. дои : 10.1016/s0076-6879(09)63034-2 . ISBN 9780123745361 . ПМИД 19892194 .

[6] «Моющие средства для лизиса клеток и экстракции белка» . www.thermofisher.com . Проверено 16 марта 2016 г.

[7] Шехадул Ислам, Мохаммед; Арьясомаяджула, Адитья; Сельваганапати, Поннамбалам Рави (март 2017 г.). «Обзор методов макро- и микромасштабного лизиса клеток» . Микромашины . 8 (3): 83. дои : 10,3390/ми8030083 . ISSN 2072-666X . ПМК 6190294 .

[8] Браун, Роберт Б; Одет, Джули (06 октября 2008 г.). «Современные методы лизиса одиночных клеток» . Журнал интерфейса Королевского общества . 5 (дополнение_2): S131-8. doi : 10.1098/rsif.2008.0009.focus . ISSN 1742-5689 . ПМК 2504493 . ПМИД 18426769 .

[:1-9] Перейти обратно: ^а ^б ^с Цзи, Хун (01 августа 2010 г.). «Лизис культивируемых клеток для иммунопреципитации» . Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2010 (8): pdb.prot5466. дои : 10.1101/pdb.prot5466 . ISSN 1940-3402 . ПМИД 20679375 .

[:2-10] Перейти обратно: ^а ^б ^с Сефтон, Бартоломью М. (1 января 2001 г.). «Метки культивируемых клеток 32Pian и подготовка клеточных лизатов для иммунопреципитации». Мечение культивируемых клеток 32Pi и приготовление клеточных лизатов для иммунопреципитации . Том. Глава 18. John Wiley & Sons, Inc., стр. Раздел 18.2. дои : 10.1002/0471142727.mb1802s40 . ISBN 9780471142720 . ПМИД 18265167 . S2CID 20969356 . {{cite book}}: |journal= игнорируется ( помогите )

[11] Буфер освещения ACK

[12] «Лизирующий буфер ACK» . Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2014 (11): pdb.rec083295. 2014. doi : 10.1101/pdb.rec083295 .

[13] «A10492 — Лизирующий буфер ACK — США» .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]