Хим-сек
 | В этой статье есть несколько проблем. Пожалуйста, помогите улучшить его или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти сообщения )
|
Chem-seq — это метод, который используется для картирования полногеномных взаимодействий между небольшими молекулами и их белками- мишенями в хроматине ядер эукариотических клеток . [ 1 ] В этом методе используется захват химического сродства в сочетании с массовым параллельным секвенированием ДНК для идентификации геномных участков, где небольшие молекулы взаимодействуют со своими целевыми белками или ДНК. Впервые он был описан Ларсом Андерсом и др. в январском номере журнала « Природная биотехнология » за 2014 год.
Использование Chem-seq
[ редактировать ]Значительное количество низкомолекулярных лигандов , включая терапевтические препараты, проявляют свое действие путем связывания специфических белков, связанных с геномом. Картирование глобальных взаимодействий этих химических веществ с хроматином по всему геному может дать представление о механизмах, с помощью которых небольшая молекула влияет на клеточные функции. В сочетании с другими методами анализа хроматина, такими как ChIP-seq , [ 2 ] Chem-seq можно использовать для исследования общегеномных эффектов терапевтических методов и для понимания влияния лекарств на ядерную архитектуру в различных биологических контекстах. В более широком смысле эти методы будут полезны для улучшения нашего понимания терапевтических механизмов, с помощью которых малые молекулы модулируют функцию и активность белков, связанных с геномом. [ 1 ] Благодаря идентификации клеточных мишеней лекарства становится возможным лучше понять причины побочных эффектов и токсичности на ранних стадиях разработки лекарства, что должно помочь снизить уровень отсева в разработке. [ 3 ]
Рабочий процесс Chem-seq
[ редактировать ]
Chem-seq основан на способности создавать биотинилированную версию интересующей небольшой молекулы, что позволяет осуществлять последующий аффинный захват . Chem-seq можно проводить как In vitro , так и In vivo , хотя результаты каждого из них оказались весьма схожими. [ 1 ]
In vivo Chem-seq
Во время In vivo Chem-seq [ 1 ] культивируемые клетки в среде обрабатывают одновременно либо биотинилированной версией исследуемой небольшой молекулы, либо ДМСО (в качестве контроля) и 1% формальдегида для сшивания ДНК, белков и малых молекул. Затем ДНК экстрагируют из клеток, обрабатывают ультразвуком и обогащают областями, содержащими интересующую биотинилированную молекулу, путем инкубации с магнитными шариками стрептавидина , которые имеют очень высокое сродство к биотину. Затем обогащенную фракцию ДНК очищают, элюируют из шариков и подвергают секвенированию следующего поколения. Геномные участки, обогащенные библиотекой Chem-seq по сравнению с контролем, связаны с исследуемой малой молекулой.
In vitro Chem-seq
In vitro Chem-seq [ 1 ] начинается со сшивания культивируемых клеток в среде с 0,5% формальдегидом. Затем из клеток извлекают клеточные ядра и экстрагируют их ДНК. Этот экстракт обрабатывается ультразвуком перед инкубацией с магнитными шариками стрептавидина, которые связаны с биотинилированной формой интересующего нас соединения. Это дает возможность интересующей небольшой молекуле взаимодействовать с целевыми геномными областями. Эти геномные области затем изолируют с помощью магнита и подвергают секвенированию и анализу следующего поколения для определения областей, обогащенных интересующей нас небольшой молекулой.
Чувствительность
[ редактировать ]Chem-seq был протестирован на трех классах препаратов с использованием клеток множественной миеломы MM1.S для: [ 1 ]
1) Исследовать полногеномное связывание бромодомена ингибитора JQ1 с членами семейства бромодоменов BET BRD2 , BRD3 и BRD4.
2) Картировать геномные сайты связывания AT7519 , ингибитора циклинзависимой киназы CDK9 , и
3) Изучить, как ДНК- интеркалирующий агент псорален взаимодействует с геномной ДНК in vivo.
В первых двух исследованиях сигналы Chem-seq возникали в геномных участках, занятых соответствующими целевыми белками лекарств, и согласовывались с результатами ChIP-seq. Однако bio-AT7519 давал более слабые сигналы Chem-seq по сравнению с сигналами, наблюдаемыми для bio-JQ1. Также было обнаружено значительное количество локусов, которые не были совместно заняты био-AT7519 и его мишенью CDK9, что можно объяснить более слабым сигналом, полученным для био-AT7519, или тем, что AT7519 может связывать и ингибировать другую циклин-зависимую киназу, такую как cdks 1. , 2, 4, 5. [ 1 ] [ 3 ] В третьем эксперименте Chem-seq оказался эффективным в картировании геномных сайтов связывания ДНК-интеркалирующего агента псоралена и показал, что биопсорален преимущественно связывается с сайтом начала транскрипции активных генов.
Преимущества и ограничения
[ редактировать ]Преимущества
Chem-seq — первый метод, который дает исследователям возможность определять расположение малых молекул по всему геному. Его можно использовать в сочетании с ChIP-seq для перекрестного сопоставления местоположения определенных лекарств с ДНК-связывающими белками , такими как факторы транскрипции , для обнаружения новых взаимодействий и помощи в описании молекулярных механизмов, посредством которых небольшие молекулы влияют на геном.
Поскольку Chem-seq использует секвенирование нового поколения для определения сайтов связывания малых молекул, он обладает очень высокой чувствительностью и совместим с другими методами, основанными на секвенировании следующего поколения.
Ранее другой аналогичный метод, известный как анализ сродства к хроматину (ChAP), использовался для картирования мест взаимодействия метаболических соединений в геноме дрожжей. [ 4 ] но Chem-seq — это первый метод оценки полногеномной локализации малых молекул в клетках млекопитающих.
Ограничения
Чтобы Chem-seq был осуществим, исследуемая небольшая молекула должна быть поддающейся биотинилированию без нарушения ее естественных связывающих свойств. Это просто невозможно с некоторыми небольшими молекулами, и даже если это возможно, процесс может потребовать знаний в области органической химии. После синтеза необходимо проверить связывающие свойства биотинилированного соединения. На сегодняшний день это было достигнуто путем сравнения кинетики связывания биотинилированных и немодифицированных соединений. [ 1 ] процесс, который требует предварительного знания белков, с которыми связывается соединение.
Расположение Bio-JQ1 по всему геному, определенное с помощью Chem-seq, почти идентично местоположениям известного целевого белка JQ1, BRD4, полученного из ChIP-seq. [ 1 ] Хотя это можно рассматривать как свидетельство точности метода, оно также подчеркивает дублирование между двумя методами, особенно когда целевые белки известны ранее.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я Андерс, Ларс; Гюнтер, Мэтью Дж; Ци, Цзюнь; Фань, Цзы Пэн; Марино, Джейсон Дж; Рал, Питер Б; Ловен, Якоб; Сигова Алла А; Смит, Уильям Б; Ли, Тонг Ин; Брэднер, Джеймс Э; Янг, Ричард А. (15 декабря 2013 г.). «Полногеномная локализация малых молекул» . Природная биотехнология . 32 (1): 92–96. дои : 10.1038/nbt.2776 . ПМК 4189815 . ПМИД 24336317 .
- ^ Джонсон, Д.С.; Мортазави, А; Майерс, Р.М.; Уолд, Б. (8 июня 2007 г.). «Полногеномное картирование взаимодействий белка и ДНК in vivo» (PDF) . Наука . 316 (5830): 1497–502. Бибкод : 2007Sci...316.1497J . дои : 10.1126/science.1141319 . ПМИД 17540862 . S2CID 519841 .
- ^ Перейти обратно: а б Сквайрс, MS; Кук, Л; Лок, В; Ци, Вт; Льюис, Э.Дж.; Томпсон, Северная Каролина; Лайонс, Дж. Ф.; Махадеван, Д. (апрель 2010 г.). «AT7519, ингибитор циклин-зависимой киназы, оказывает свое действие путем ингибирования транскрипции в клеточных линиях лейкемии и образцах пациентов» . Молекулярная терапия рака . 9 (4): 920–8. дои : 10.1158/1535-7163.MCT-09-1071 . ПМИД 20354122 .
- ^ Тунг, Ю.Ю.; Хонг, JY; Вальц, Т; Моазед, Д; Лиу, Г.Г. (февраль 2012 г.). «Аффинное осаждение хроматина с использованием небольшой метаболической молекулы: его применение для анализа О-ацетил-АДФ-рибозы» . Клеточные и молекулярные науки о жизни . 69 (4): 641–50. дои : 10.1007/s00018-011-0771-x . ПМК 3266462 . ПМИД 21796450 .