Флуоресцентная корреляционная спектроскопия

Корреляционная спектроскопия флуоресценции ( FCS ) представляет собой статистический анализ посредством временной корреляции стационарных колебаний интенсивности флуоресценции . Ее теоретическая основа возникла из регрессионной гипотезы Л. Онсагера . Анализ позволяет получить кинетические параметры физических процессов, лежащих в основе колебаний. Одним из интересных применений этого метода является анализ флуктуаций концентрации флуоресцентных частиц (молекул) в растворе. В этом приложении наблюдается флуоресценция, излучаемая из очень маленького пространства в растворе, содержащем небольшое количество флуоресцентных частиц (молекул). Интенсивность флуоресценции колеблется из-за броуновского движения частиц. Другими словами, количество частиц в подпространстве, определяемом оптической системой, случайным образом меняется вокруг среднего числа. Анализ дает среднее количество флуоресцентных частиц и среднее время диффузии, когда частица проходит через пространство. В конечном итоге определяются как концентрация, так и размер частицы (молекулы). Оба параметра важны в биохимических исследованиях, биофизике и химии.

FCS является таким чувствительным аналитическим инструментом, поскольку он наблюдает небольшое количество молекул (концентрации от наномолярных до пикомолярных) в небольшом объеме (~ 1 мкм). ³ ). В отличие от других методов (таких как анализ ВЭЖХ ) в FCS не используется процесс физического разделения; вместо этого он достигает своего пространственного разрешения посредством своей оптики. Кроме того, FCS позволяет наблюдать молекулы с флуоресцентными метками на биохимическом пути в интактных живых клетках. Это открывает новую область — «биохимию in situ или in vivo»: отслеживание биохимических путей в интактных клетках и органах.

Обычно FCS используется в контексте оптической микроскопии , в частности, конфокальной микроскопии или микроскопии с двухфотонным возбуждением . В этих методах свет фокусируется на образце, а измеренные флуктуации интенсивности флуоресценции (из-за диффузии , физических или химических реакций, агрегации и т. д.) анализируются с использованием временной автокорреляции. Поскольку измеряемое свойство по существу связано с величиной и/или величиной колебаний, существует оптимальный режим измерения на уровне, когда отдельные виды входят или выходят из объема наблюдения (или включаются и выключаются в объеме). Когда одновременно измеряется слишком много объектов, общие флуктуации малы по сравнению с общим сигналом и могут быть неразрешимыми. В другом направлении, если отдельные события флуктуации слишком разрежены во времени, одно измерение может занять слишком много времени. длинный. FCS в некотором смысле является флуоресцентным аналогом динамического рассеяния света , в котором используется когерентное рассеяние света вместо (некогерентной) флуоресценции.

Когда известна соответствующая модель, FCS можно использовать для получения количественной информации, такой как

• коэффициенты диффузии
• гидродинамические радиусы
• средние концентрации
• кинетические скорости химических реакций
• синглет-триплетная динамика

Поскольку флуоресцентные маркеры бывают разных цветов и могут быть специфически связаны с конкретной молекулой (например, белками, полимерами, металлокомплексами и т. д.), можно изучать поведение отдельных молекул (в быстрой последовательности в сложных растворах). . С развитием чувствительных детекторов, таких как лавинные фотодиоды, обнаружение сигнала флуоресценции, исходящего от отдельных молекул в сильно разбавленных образцах, стало практичным. Благодаря этому появилась возможность проводить эксперименты FCS на самых разных образцах, от материаловедения до биологии. Появление сконструированных клеток с генетически помеченными белками (например, зеленым флуоресцентным белком ) сделало FCS распространенным инструментом для изучения молекулярной динамики в живых клетках.

История

Методы корреляции сигналов были впервые экспериментально применены к флуоресценции в 1972 году Магдом, Элсоном и Уэббом. поэтому их обычно называют изобретателями FCS. Вскоре после этого метод получил дальнейшее развитие в группе статей этих и других авторов, в которых были установлены теоретические основы и типы приложений. Примерно в 1990 году, когда появилась возможность обнаруживать достаточно небольшое количество частиц флуоресценции, возникли две проблемы: негауссово распределение интенсивности флуоресценции и трехмерный конфокальный измерительный объем системы лазерной микроскопии. Первое привело к анализу распределений и моментов флуоресцентных сигналов для извлечения молекулярной информации. который в конечном итоге стал набором методов, известных как анализ яркости . См. Томпсон (1991). для обзора того периода.

Начиная с 1993 года, Ряд усовершенствований в методах измерения — в частности, использование конфокальной микроскопии, а затем двухфотонной микроскопии — для лучшего определения объема измерения и исключения фона — значительно улучшили соотношение сигнал/шум и обеспечили чувствительность к одной молекуле. С тех пор интерес к FCS возобновился, и по состоянию на август 2007 года в Web of Science было найдено более 3000 статей, использующих FCS. См. Кричевский и Бонне. для обзора. Кроме того, наблюдался шквал активности по расширению FCS различными способами, например, до лазерного сканирования и конфокальной микроскопии с вращающимся диском (из стационарного измерения в одной точке), с использованием вместо этого кросс-корреляции (FCCS) между двумя флуоресцентными каналами. автокорреляции и использования резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) вместо флуоресценции.

Типичная установка

Базовая схема прибора флуоресцентной корреляционной спектроскопии.

Типичная установка FCS состоит из лазерной линии (длины волн обычно варьируются от 405 до 633 нм ( непрерывный ) и от 690 до 1100 нм (импульсный)), которая отражается в объектив микроскопа дихроичным зеркалом. Лазерный луч фокусируется в образце, который содержит флуоресцентные частицы (молекулы) в таком высоком разбавлении, что лишь немногие из них попадают в фокальное пятно (обычно 1–100 молекул в одной фл). Когда частицы пересекают фокальный объем, они флуоресцируют. Этот свет собирается тем же объективом и, поскольку он смещен в красную сторону по отношению к свету возбуждения, он проходит через дихроичное зеркало и достигает детектора, обычно фотоумножителя , лавинного фотодиода или сверхпроводящего однофотонного детектора на нанопроволоке . Результирующий электронный сигнал может быть сохранен либо непосредственно в виде кривой зависимости интенсивности от времени для последующего анализа, либо вычислен для генерации автокорреляции непосредственной (для чего требуются специальные карты сбора данных). Кривая FCS сама по себе представляет собой только временной спектр. Выводы о физических явлениях приходится извлекать оттуда с помощью соответствующих моделей. Интересующие параметры находятся после подгонки автокорреляционной кривой к смоделированным функциональным формам.

Объем измерения

Измерительный объем представляет собой свертку геометрий освещения (возбуждения) и обнаружения, которые возникают в результате задействованных оптических элементов. Результирующий объем математически описывается функцией рассеяния точки (или PSF), по сути это изображение точечного источника. PSF часто описывают как эллипсоид (с нерезкими границами) диаметром фокуса в несколько сотен нанометров и почти один микрометр вдоль оптической оси. Форма существенно меняется (и оказывает большое влияние на результирующие кривые ФТС) в зависимости от качества оптических элементов (очень важно избегать астигматизма и проверять реальную форму ФТС на приборе). В случае конфокальной микроскопии и для небольших отверстий (около одной единицы Эйри) PSF хорошо аппроксимируется гауссианами:

$PSF(r,z)=I_{0}e^{-2r^{2}/\omega _{xy}^{2}}e^{-2z^{2}/\omega _{z}^{2}}$

где $I_{0}$ — пиковая интенсивность, r и z — радиальное и осевое положение, а $\omega _{xy}$ и $\omega _{z}$ - радиальный и осевой радиусы, а $\omega _{z}>\omega _{xy}$. Эта гауссова форма принимается при выводе функциональной формы автокорреляции.

Обычно $\omega _{xy}$ составляет 200–300 нм, а $\omega _{z}$ в 2–6 раз больше. Одним из распространенных способов калибровки параметров объема измерения является проведение FCS для веществ с известным коэффициентом диффузии и концентрацией (см. ниже). Коэффициенты диффузии обычных флуорофоров в воде приведены в следующем разделе.

Гауссово приближение работает в разной степени в зависимости от оптических деталей, и иногда можно применять поправки для компенсации ошибок аппроксимации.

Автокорреляционная функция

Необработанные данные FCS и коррелированные данные.

(Временная) автокорреляционная функция — это корреляция временного ряда с самим собой, сдвинутая по времени. $\tau$, как функция $\tau$:

$G(\tau )={\frac {\langle \delta I(t)\delta I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}={\frac {\langle I(t)I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}-1$

где $\delta I(t)=I(t)-\langle I(t)\rangle$ – отклонение от средней интенсивности. Нормализация (знаменатель) здесь наиболее часто используется для FCS, поскольку тогда корреляция при $\tau =0$, G (0), связано со средним числом частиц в измерительном объеме.

В качестве примера необработанные данные FCS и их автокорреляция на рисунке справа показаны для свободно диффундирующего родамина 6G. График сверху показывает интенсивность флуоресценции в зависимости от времени. Интенсивность колеблется по мере того, как Родамин 6G входит и выходит из фокального объема. На нижнем графике показана автокорреляция тех же данных. Информацию о скорости диффузии и концентрации можно получить с помощью одной из моделей, описанных ниже.

Для профиля освещенности по Гауссу $PSF(r,z)$, автокорреляционная функция задается общей основной формулой

$G(\tau )={\frac {1}{\langle N\rangle }}\left\langle \exp \left(-{\frac {\Delta X(\tau )^{2}+\Delta Y(\tau )^{2}}{w_{xy}^{2}}}-{\frac {\Delta Z(\tau )^{2}}{w_{z}^{2}}}\right)\right\rangle ,$

где вектор $\Delta {\vec {R}}(\tau )=(\Delta X(\tau ),\Delta Y(\tau ),\Delta Z(\tau ))$ обозначает стохастическое смещение флуорофора в пространстве с течением времени $\tau$.Выражение справедливо, если среднее число $\langle N\rangle$ флуорофоров в фокальном объеме невелико, и темными состояниями и т. д. флуорофора можно пренебречь. В частности, не делалось никаких предположений о типе исследуемого диффузионного движения. Формула позволяет интерпретировать $G(\tau )$ как (i) вероятность возврата для малых параметров пучка $w_{xy},w_{z}$ и (ii) производящая момент функция $|\Delta {\vec {R}}(\tau )|^{2}$ если $w_{xy},w_{z}$ разнообразны.

Интерпретация автокорреляционной функции

Чтобы извлечь интересующие величины, можно подобрать данные автокорреляции, обычно с использованием нелинейного алгоритма наименьших квадратов . Функциональная форма подгонки зависит от типа динамики (и рассматриваемой оптической геометрии).

Нормальная диффузия

Коррелированные данные и модель нормальной диффузии

Флуоресцентные частицы, используемые в FCS, малы и поэтому испытывают тепловые движения в растворе. Таким образом, простейший эксперимент FCS представляет собой нормальную трехмерную диффузию, для которой автокорреляция равна:

$\ G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D}))^{1/2}}}+G(\infty )$

где $a=\omega _{z}/\omega _{xy}$ это отношение осевого и радиального $e^{-2}$ радиусы измерительного объема и $\tau _{D}$ – характерное время пребывания. Эта форма была получена в предположении гауссовского объема измерения. Обычно аппроксимация имеет три свободных параметра: G(0), $G(\infty )$, и $\tau _{D}$– из которого можно получить коэффициент диффузии и концентрацию флуорофора.

С нормализацией, использованной в предыдущем разделе, G (0) дает среднее количество диффузоров в объеме <N> или, что то же самое - с знанием размера объема наблюдения - среднюю концентрацию:

$\ G(0)={\frac {1}{\langle N\rangle }}={\frac {1}{V_{\text{eff}}\langle C\rangle }},$

где эффективный объем находится путем интегрирования гауссовой формы измерительного объема и определяется по формуле:

$\ V_{\text{eff}}=\pi ^{3/2}\omega _{xy}^{2}\omega _{z}.\,$

D дает коэффициент диффузии:

$\ D=\omega _{xy}^{2}/{4\tau _{D}}.$

Аномальная диффузия

См. Также: Аномальная диффузия.

Если диффундирующим частицам мешают препятствия или толкает их сила (молекулярные двигатели, поток и т. д.), динамика часто недостаточно хорошо описывается моделью нормальной диффузии, в которой среднеквадратичное смещение (MSD) растет линейно со временем. Вместо этого диффузию лучше описать как аномальную диффузию , где временная зависимость MSD нелинейна, как в степенном законе:

$\ MSD=6D_{a}t^{\alpha }\,$

где $D_{a}$ – аномальный коэффициент диффузии. «Аномальная диффузия» обычно относится только к этой очень общей модели, а не ко многим другим возможностям, которые можно было бы назвать аномальными. Кроме того, степенной закон в строгом смысле слова является ожидаемой формой только для узкого круга строго определенных систем, например, когда распределение препятствий фрактально . Тем не менее, степенной закон может быть полезным приближением для более широкого круга систем.

Автокорреляционная функция FCS для аномальной диффузии:

$G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D})^{\alpha })(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D})^{\alpha })^{1/2}}}+G(\infty ),$

где аномальный показатель $\alpha$ такой же, как указано выше, и становится свободным параметром фитинга.

Было показано, что с помощью FCS аномальный показатель степени является показателем степени скученности молекул (он меньше единицы и меньше для большей степени скученности).

Полидисперсная диффузия

Если существуют диффундирующие частицы разных размеров (коэффициентов диффузии), обычно их называют функцией, которая представляет собой сумму однокомпонентных форм:

$\ G(\tau )=G(0)\sum _{i}{\frac {\alpha _{i}}{(1+(\tau /\tau _{D,i}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D,i}))^{1/2}}}+G(\infty )$

где сумма рассчитывается по числу частиц различных размеров, имеющих индекс i, и $\alpha _{i}$ дает вес, который связан с квантовым выходом и концентрацией каждого типа. Это вводит новые параметры, что усложняет подгонку, поскольку необходимо искать в пространстве более высокой размерности. Нелинейная аппроксимация методом наименьших квадратов обычно становится нестабильной даже при небольшом числе $\tau _{D,i}$с. Более надежная схема подбора, особенно полезная для полидисперсных образцов, — это метод максимальной энтропии.

Диффузия с потоком

При диффузии вместе с однородным потоком со скоростью $v$ в латеральном направлении автокорреляция равна:

$\ G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D}))^{1/2}}}\times \exp[-(\tau /\tau _{v})^{2}\times {\frac {1}{1+\tau /\tau _{D}}}]+G(\infty )$

где $\tau _{v}=\omega _{xy}/v$ — среднее время пребывания, если есть только поток (без диффузии).

Химическая релаксация

Широкий спектр возможных экспериментов FCS включает химические реакции, которые постоянно отклоняются от равновесия из-за тепловых движений (а затем «расслабляются»). В отличие от диффузии, которая также является процессом релаксации, флуктуации вызывают изменения между состояниями разных энергий. Одной из очень простых систем, демонстрирующих химическую релаксацию, может быть стационарное место связывания в измерительном объеме, где частицы производят сигнал только при связывании (например, посредством FRET или если время диффузии намного меньше интервала отбора проб). В этом случае автокорреляция равна:

$\ G(\tau )=G(0)\exp(-\tau /\tau _{B})+G(\infty )$

где

$\ \tau _{B}=(k_{\text{on}}+k_{\text{off}})^{-1}$

— время релаксации, зависящее от кинетики реакции (скорости включения и выключения), а также:

$G(0)={\frac {1}{\langle N\rangle }}{\frac {k_{on}}{k_{off}}}={\frac {1}{\langle N\rangle }}K$

связано с константой равновесия K .

Большинство систем с химической релаксацией также демонстрируют измеримую диффузию, и автокорреляционная функция будет зависеть от деталей системы. Если диффузия и химическая реакция разделены, комбинированная автокорреляция является продуктом химической и диффузионной автокорреляции.

Коррекция триплетного состояния

Приведенные выше автокорреляции предполагают, что флуктуации не связаны с изменением флуоресцентных свойств частиц. Однако для большинства (био)органических флуорофоров — например, зеленого флуоресцентного белка , родамина, красителей Cy3 и Alexa Fluor — некоторая часть освещенных частиц возбуждается до триплетного состояния (или других безызлучательных состояний распада), а затем не излучает фотоны за характерное время релаксации $\tau _{F}$. Обычно $\tau _{F}$ имеет порядок микросекунд, что обычно меньше, чем интересующая динамика (например, $\tau _{D}$), но достаточно большой, чтобы ее можно было измерить. К автокорреляции добавляется мультипликативный член для учета триплетного состояния. Для нормальной диффузии:

$\ G(\tau )=G(0){\frac {(1-F+Fe^{-\tau /\tau _{F}})}{(1-F)}}{\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D,i}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D,i}))^{1/2}}}+G(\infty )$

где $\ F$ – доля частиц, перешедших в триплетное состояние и $\ \tau _{F}$ – соответствующее время релаксации триплетного состояния. Если интересующая динамика намного медленнее, чем релаксация триплетного состояния, коротковременную составляющую автокорреляции можно просто усечь, и триплетный член станет ненужным.

Обычные флуоресцентные зонды

Флуоресцентные виды, используемые в FCS, обычно представляют собой представляющую интерес биомолекулу, помеченную флуорофором (например, с помощью иммуногистохимии ), или представляет собой голый флуорофор, который используется для исследования некоторой интересующей среды (например, цитоскелета клетки). В следующей таблице приведены коэффициенты диффузии некоторых распространенных флуорофоров в воде при комнатной температуре и длины волн их возбуждения.

Флуоресцентный краситель	$\ D$ [10 −10 м 2 с −1 ]	Т [°С]	Возбуждение длина волны [нм]	Ссылка
Родамин 6G	2.8, 3.0, 4.14 ± 0.05, 4.20 ± 0.06	25	514
Родамин 110	2.7		488
Тетраметил родамин	2.6		543
Сай3	2.8		543
Сай5	2.5, 3.7 ± 0.15	25	633
карбоксифлуоресцеин	3.2		488
Алекса 488	1.96, 4.35	22.5±0.5	488
Закон 655-малеимид	4.07 ± 0.1	25	663
Акт 655-карбоновая кислота	4.26 ± 0.08	25	663
2',7'-дифторфлуоресцеин (Орегон Грин 488)	4.11 ± 0.06	25	498

Вариации

FCS почти всегда относится к одноточечному, одноканальному измерению временной автокорреляции, хотя термин «флуоресцентная корреляционная спектроскопия» вне его исторического научного контекста не подразумевает такого ограничения. FCS была расширена разными исследователями в нескольких вариантах, при этом каждое расширение порождало другое имя (обычно аббревиатуру).

Пятно-вариационная флуоресцентная корреляционная спектроскопия (svFCS)

В то время как FCS — это точечное измерение, обеспечивающее время диффузии в заданном объеме наблюдения, svFCS — это метод, при котором пятно наблюдения варьируется для измерения времени диффузии при разных размерах пятна. Зависимость между временем диффузии и площадью пятна линейна и может быть построена для расшифровки основного вклада ограничения. Полученная кривая называется законом диффузии.Этот метод используется в биологии для изучения организации плазматической мембраны живых клеток.

$\ \omega _{xy}^{2}=4D\tau _{D}+t_{0}$

где $t_{0}$ это точка пересечения оси Y. В случае броуновской диффузии $t_{0}=0$. В случае ограничения из-за изолированных доменов, $t_{0}>0$ тогда как в случае изолированных доменов, $t_{0}<0$.

исследования svFCS живых клеток и документы по моделированию

Корреляционная флуоресцентная спектроскопия с контролем объема выборки (SVC-FCS):

z-скан ФКС

ФКС с наноапертурами: преодоление дифракционного барьера

СТЕД-FCS:

Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS)

Основная статья: Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия

FCS иногда используется для изучения молекулярных взаимодействий с использованием различий во времени диффузии (например, продукт реакции ассоциации будет больше и, следовательно, будет иметь большее время диффузии, чем реагенты по отдельности); однако FCS относительно нечувствителен к молекулярной массе, как видно из следующего уравнения, связывающего молекулярную массу со временем диффузии глобулярных частиц (например, белков):

$\ \tau _{D}={\frac {3\pi \omega _{xy}^{2}\eta }{2kT}}(M)^{1/3}$

где $\ \eta$ вязкость образца и $\ M$ - молекулярная масса флуоресцентных частиц. На практике время диффузии должно существенно отличаться — как минимум в 1,6 раза, — что означает, что молекулярные массы должны различаться в 4 раза. Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS) измеряет взаимодействия путем взаимной корреляции двух или более флуоресцентных каналов (по одному каналу для каждого реагента), что позволяет различать взаимодействия более чувствительно, чем FCS, особенно когда изменение массы в реакции невелико.

Методы анализа яркости

Этот набор методов включает число и яркость (N&B), гистограмма счета фотонов (PCH), анализ распределения интенсивности флуоресценции (FIDA), и кумулянтный анализ. и анализ пространственного распределения интенсивности. Также сообщается о сочетании нескольких методов. Флуоресцентная кросскорреляционная спектроскопия преодолевает слабую зависимость скорости диффузии от молекулярной массы, рассматривая многоцветное совпадение. А как насчет гомо-взаимодействий? Решение заключается в анализе яркости. Эти методы используют неоднородность распределения интенсивности флуоресценции для измерения молекулярной яркости различных видов в образце. Поскольку димеры будут содержать вдвое больше флуоресцентных меток, чем мономеры, их молекулярная яркость будет примерно вдвое больше, чем у мономеров. В результате относительная яркость является чувствительным показателем олигомеризации. Средняя молекулярная яркость ( $\langle \epsilon \rangle$) связано с дисперсией ( $\sigma ^{2}$) и среднюю интенсивность ( $\langle I\rangle$) следующее:

$\ \langle \varepsilon \rangle ={\frac {\sigma ^{2}-\langle I\rangle }{\langle I\rangle }}=\sum _{i}f_{i}\varepsilon _{i}$

Здесь $f_{i}$ и $\epsilon _{i}$ – фракционная интенсивность и молекулярная яркость соответственно частиц $i$.

FRET-FCS

Другой подход к изучению молекулярных взаимодействий, основанный на FCS, использует резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) вместо флуоресценции и называется FRET-FCS. В случае FRET, как и в случае FCCS, существует два типа датчиков; однако канал только один, и свет обнаруживается только тогда, когда два зонда находятся очень близко — достаточно близко, чтобы обеспечить взаимодействие. Сигнал FRET слабее, чем при флуоресценции, но имеет то преимущество, что сигнал присутствует только во время реакции (не считая автофлуоресценции ).

Сканирование ФКС

В сканирующей флуоресцентной корреляционной спектроскопии (sFCS) измеряемый объем перемещается по образцу определенным образом. Введение сканирования мотивировано его способностью облегчить или устранить несколько отдельных проблем, часто встречающихся в стандартной FCS, и, таким образом, расширить диапазон применимости методов корреляции флуоресценции в биологических системах.

Некоторые варианты FCS применимы только к серийным сканирующим лазерным микроскопам. Корреляционная спектроскопия изображений и ее варианты были реализованы на сканирующем конфокальном или сканирующем двухфотонном микроскопе, но переносились на другие микроскопы, например, на конфокальный микроскоп с вращающимся диском. Растровая ИКС (RICS), и позиционно-чувствительная FCS (PSFCS) включить в анализ временную задержку между частями сканирования изображения. Также низкоразмерные сканы (например, круглое кольцо) — возможно только в системе сканирования — может получить доступ к временным шкалам между измерениями в одной точке и полным изображением. Путь сканирования также был сделан для адаптивного отслеживания частиц.

Вращающийся диск FCS и пространственное картографирование

Любой из методов корреляционной спектроскопии изображений также может быть выполнен на конфокальном микроскопе с вращающимся диском, который на практике может обеспечить более высокую скорость получения изображений по сравнению с лазерным сканирующим конфокальным микроскопом. Этот подход недавно был применен к диффузии в сложной пространственно изменяющейся среде, создав карту коэффициента диффузии с разрешением пикселей. Пространственное картирование диффузии с помощью FCS впоследствии было распространено на систему TIRF. Пространственное картирование динамики с использованием методов корреляции применялось и раньше, но только в редких точках. или в грубом разрешении.

Корреляционная спектроскопия изображений (ICS)

Когда движение медленное (в биологии, например, диффузия в мембране), получение адекватной статистики из одноточечного эксперимента FCS может занять непомерно много времени. Больше данных можно получить, проведя эксперимент одновременно в нескольких пространственных точках с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Этот подход получил название корреляционной спектроскопии изображений (ICS). Затем измерения можно усреднить.

Другой вариант ICS выполняет пространственную автокорреляцию изображений, что дает информацию о концентрации частиц. Затем корреляция усредняется по времени. Хотя белый шум камеры не автокоррелирует во времени, он автокоррелирует в пространстве - это создает амплитуду белого шума в функции пространственной автокорреляции, которую необходимо учитывать при подборе амплитуды автокорреляции, чтобы найти концентрацию флуоресцентных молекул.

Естественным расширением версий временной и пространственной корреляции является пространственно-временная ICS (STICS). В STICS нет явного усреднения по пространству или времени (только усреднение, присущее корреляции). В системах с неизотропным движением (например, направленный поток, асимметричная диффузия) STICS может извлекать информацию о направлении. Вариантом, который тесно связан с STICS (посредством преобразования Фурье), является корреляционная спектроскопия изображений в k -пространстве (kICS).

Существуют также версии ICS с кросс-корреляцией, которые могут определять концентрацию, распределение и динамику совместно локализованных флуоресцентных молекул. Молекулы считаются совместно локализованными, когда отдельные вклады флуоресценции неразличимы из-за перекрытия функций распределения точек интенсивностей флуоресценции.

Корреляционная спектроскопия изображений частиц (PICS)

Источник:

PICS — это мощный инструмент анализа, который разрешает корреляции нанометровой длины и в миллисекундном масштабе времени. Адаптировано на основе методов пространственно-временной корреляционной спектроскопии изображений. он использует высокую позиционную точность отслеживания одиночных частиц. В то время как традиционные методы отслеживания не работают, если траектории нескольких частиц пересекаются, этот метод работает в принципе для произвольно больших плотностей молекул и динамических параметров (например, коэффициентов диффузии, скоростей), пока можно идентифицировать отдельные молекулы. Он дешев в вычислительном отношении и надежен и позволяет идентифицировать и количественно оценивать движения (например, диффузию, активный транспорт, ограниченную диффузию) внутри ансамбля частиц без каких-либо априорных знаний о динамике.

Расширение кросс-корреляционной спектроскопии изображений частиц (PICCS) доступно для биологических процессов, в которых участвуют несколько партнеров по взаимодействию, что можно наблюдать с помощью двухцветной микроскопии.

FCS Визуализация оптических колебаний сверхвысокого разрешения (fcsSOFI)

Визуализация оптических флуктуаций со сверхвысоким разрешением (SOFI) — это метод сверхвысокого разрешения, который обеспечивает пространственное разрешение ниже дифракционного предела за счет анализа постобработки с использованием корреляционных уравнений, аналогично FCS. В то время как в первоначальных отчетах SOFI использовались колебания от неподвижного мигания флуорофоров, FCS был объединен с SOFI, где флуктуации создаются диффузионными зондами для создания пространственных карт коэффициентов диффузии со сверхвысоким разрешением. Это применялось для понимания диффузии и пространственных свойств пористых и замкнутых материалов. Сюда входит агароза и термочувствительные гидрогели PNIPAM, жидкие кристаллы, и полимеры с разделенными фазами и конденсаты РНК/белка.

Полное внутреннее отражение FCS

Флуоресценция полного внутреннего отражения (TIRF) — это метод микроскопии, который чувствителен только к тонкому слою вблизи поверхности покровного стекла, что значительно минимизирует фоновую флуоресценцию. FCS была распространена на этот тип микроскопа и называется TIR-FCS. Поскольку интенсивность флуоресценции в TIRF падает экспоненциально с расстоянием от покровного стекла (а не по Гауссу с конфокальным), автокорреляционная функция отличается.

Визуализация FCS с использованием световой флуоресцентной микроскопии

Световая листовая флуоресцентная микроскопия или микроскопия с селективной плоскостной визуализацией (SPIM) использует освещение, которое осуществляется перпендикулярно направлению наблюдения с помощью тонкого слоя (лазерного) света. При определенных условиях этот принцип освещения можно комбинировать с корреляционной спектроскопией флуоресценции, чтобы обеспечить получение изображений с пространственным разрешением подвижности и взаимодействий флуоресцирующих частиц, таких как белки, меченные GFP, внутри живых биологических образцов.

Другие флуоресцентные динамические подходы

Существуют две основные некорреляционные альтернативы FCS, которые широко используются для изучения динамики флуоресцентных видов.

Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP)

При FRAP область кратковременно подвергается воздействию интенсивного света, безвозвратно фотообесцвечивающего флуорофоры, и визуализируется восстановление флуоресценции за счет диффузии близлежащих (необесцвеченных) флуорофоров. Основным преимуществом FRAP перед FCS является простота интерпретации качественных экспериментов, распространенных в клеточной биологии. Различия между клеточными линиями или областями клетки, а также до и после применения лекарства часто можно охарактеризовать с помощью простого просмотра видеороликов. Эксперименты FCS требуют определенного уровня обработки и более чувствительны к потенциально мешающим влияниям, таким как: вращательная диффузия, вибрации, фотообесцвечивание, зависимость от освещения и цвета флуоресценции, неадекватная статистика и т. д. Гораздо проще изменить объем измерения в FRAP, что позволяет больший контроль. На практике объемы обычно больше, чем в ФТС. Хотя эксперименты FRAP обычно носят более качественный характер, некоторые исследователи изучают FRAP количественно, включая динамику связывания. Недостатком FRAP в клеточной биологии является возмущение клетки свободными радикалами, вызванное фотообесцвечиванием. Он также менее универсален, поскольку не может измерять концентрацию, вращательную диффузию или совместную локализацию. FRAP требует значительно более высокой концентрации флуорофоров, чем FCS.

Отслеживание частиц

При отслеживании частиц измеряются траектории набора частиц, обычно путем применения алгоритмов отслеживания частиц к фильмам. [1] Преимущество отслеживания частиц заключается в том, что вся динамическая информация сохраняется при измерении, в отличие от FCS, где корреляция усредняет динамику до одной плавной кривой. Преимущество очевидно в системах, демонстрирующих сложную диффузию, где непосредственное вычисление среднеквадратического смещения позволяет проводить прямое сравнение с диффузией по нормальному или степенному закону. Чтобы применить отслеживание частиц, частицы должны быть различимы и, следовательно, иметь более низкую концентрацию, чем требуется для FCS. Кроме того, отслеживание частиц более чувствительно к шуму, который иногда может непредсказуемо повлиять на результаты.

Автофлуоресцентная корреляционная спектроскопия

Недавние достижения в области ультрафиолетовой нанофотоники привели к развитию исследований одиночных молекул белков без меток путем их возбуждения глубоким ультрафиолетовым светом и изучения динамических процессов.

Двух- и трехфотонное ФТС-возбуждение

Ряд преимуществ как в пространственном разрешении, так и в минимизации фотоповреждений/фотообесцвечивания органических и/или биологических образцов достигается с помощью двухфотонного или трехфотонного возбуждения FCS.

См. также

• Конфокальная микроскопия
• Коэффициент диффузии
• Динамическое рассеяние света
• Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS)
• Резонансная передача энергии Фёрстера (FRET)

Дальнейшее чтение

• Риглер Р. и Виденгрен Дж. (1990). Сверхчувствительное обнаружение одиночных молекул с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии, BioScience (Ed. Klinge & Owman), с. 180
• Оленшлегер, Ф.; Швилле, П.; Эйген, М. (1996). «Обнаружение РНК ВИЧ-1 методом амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот в сочетании с флуоресцентной корреляционной спектроскопией» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 93 (23): 12811–12816. Бибкод : 1996PNAS...9312811O . дои : 10.1073/pnas.93.23.12811 . ПМК   24002 . ПМИД   8917501 .

Внешние ссылки

• Хауштайн, Эльке; Швилле, Петра (2004). «Одномолекулярные спектроскопические методы». Современное мнение в области структурной биологии . 14 (5): 531–540. дои : 10.1016/j.sbi.2004.09.004 . hdl : 11858/00-001M-0000-0029-D76C-C . ПМИД   15465312 .
• Класс ФКС
• Учебное пособие по FCS Института Стоуэрса
• Учебное пособие по FCS Консорциума клеточной миграции, заархивировано 24 сентября 2010 г. в Wayback Machine.
• Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) (Becker & Hickl GmbH, веб-страница)