Каэде (белок)

Каеде — фотоактивируемый флуоресцентный белок, образом происходящий из каменистого коралла естественным Trachyphyllia geoffroyi . Его название в переводе с японского означает «клен» . При облучении ультрафиолетовым светом (350–400 нм) Каеде претерпевает необратимую фотоконверсию из зеленой флуоресценции в красную флуоресценцию.

Каеде представляет собой гомотетрамерный белок размером 116 кДа . кДа . Была выведена тетрамерная структура, поскольку ее первичная структура составляет всего 28 Эта тетрамеризация, возможно, приводит к тому, что Каеде имеет низкую склонность к образованию агрегатов при слиянии с другими белками.

Открытие

Свойство фотоконвертируемой флуоресценции белка Kaede было случайно открыто и впервые описано Ando et al. в Трудах Национальной академии наук США . ^[1] Было обнаружено, что аликвота белка Каеде излучает красную флуоресценцию после того, как ее оставили на столе и подвергли воздействию солнечного света. Последующая проверка показала, что Каэде, который изначально был зеленым флуоресцентным, после воздействия ультрафиолетового света фотоконвертируется, становясь красным флуоресцентным. Тогда его называли Каэде.

Характеристики

Свойству фотоконверсии в Каеде способствует трипептид , His ₆₂ - Tyr ₆₃ - Gly ₆₄ , который действует как зеленый хромофор который может превращаться в красный. ^[2] После синтеза Каеде хромофор 4-(п-гидроксибензилиден)-5-имидазолинон, полученный из трипептида, опосредует зеленую флуоресценцию Каеде. Под воздействием УФ-излучения белок Kaede подвергается нетрадиционному расщеплению между амидным азотом и α-углеродом (Cα) в His62 посредством формальной реакции β-элиминирования. После образования двойной связи между His62-Cα и –Cβ π-конъюгация распространяется на имидазольное кольцо His62. Образуется новый хромофор 2-[(1E)-2-(5-имидазолил)этенил]-4-(п-гидроксибензилиден)-5-имидазолинон, обладающий свойством красного излучения.

Расщепление трипептида анализировали с помощью анализа SDS-PAGE. Непреобразованный зеленый Каеде показывает одну полосу при 28 кДа, тогда как две полосы при 18 кДа и 10 кДа наблюдаются для конвертированного красного Каеде, что указывает на то, что расщепление имеет решающее значение для фотоконверсии. ^{[ нужна ссылка ]}

Смещение спектра поглощения и излучения у Каеде вызвано расщеплением трипептида. Перед фотоконверсией Каэде демонстрирует основной максимум длины волны поглощения при 508 нм, сопровождаемый небольшим плечом при 475 нм. При возбуждении длиной волны 480 нм излучается зеленая флуоресценция с пиком 518 нм.Когда Каеде облучают УФ или фиолетовым светом, основной пик поглощения смещается до 572 нм. При возбуждении длиной волны 540 нм Каэде показал максимум излучения при 582 нм с плечом при 627 нм и пиком при 518 нм. После фотоконверсии излучается красная флуоресценция.

Фотоконверсия в Каэде необратима. Экспозиция в темноте или освещение с длиной волны 570 нм не могут восстановить исходную зеленую флуоресценцию. Уменьшение флуоресценции наблюдается у красного фотоконвертированного Каеде при интенсивном воздействии света с длиной волны 405 нм с последующим частичным восстановлением через несколько минут.

Приложения

Как и все другие флуоресцентные белки, Kaede может быть региональным оптическим маркером экспрессии генов и мечения белков для изучения поведения клеток. ^[3]

Одним из наиболее полезных приложений является визуализация нейронов . Выделение отдельного нейрона затруднено из-за длинных и тонких отростков, переплетающихся с другими нейронами. Даже когда культивируемые нейроны помечены флуоресцентными белками, их по-прежнему трудно идентифицировать по отдельности из-за плотной упаковки.

Раньше такую визуализацию можно было осуществлять традиционным способом, заполняя нейроны люциферовым желтым или сульфородамином , что является трудоемким методом.[1] После открытия белка Каеде было обнаружено, что он полезен для определения границ отдельных нейронов. Нейроны трансфицируются белка Kaede кДНК и подвергаются УФ-облучению. Красный фотоконвертированный белок Каеде обладает способностью к свободной диффузии в клетке, за исключением ядра, и распространяется по всей клетке, включая дендриты и аксоны. Этот метод помогает распутать сложные сети, сложившиеся в плотной культуре. Кроме того, маркируя нейроны разными цветами с помощью УФ-облучения с разной продолжительностью, можно визуализировать места контакта между интересующими красными и зелеными нейронами. ^[1]

Возможность визуализации отдельных клеток также является мощным инструментом для определения точной морфологии и миграционного поведения отдельных клеток в живых срезах коры . определенную пару дочерних клеток в соседних Kaede-положительных клетках желудочковой зоны срезов мозга мыши По белку Kaede можно отслеживать . Границы дочерних клеток визуализируются, и можно описать положение и расстояние между двумя или более клетками. ^[4]

Поскольку изменение флуоресцентного цвета индуцируется УФ-светом, маркировка клеток и субклеточных структур эффективна даже тогда, когда индуцируется только частичная фотоконверсия.

Преимущества в качестве оптического маркера

Благодаря особому свойству фотопереключаемой флуоресценции белок Kaede обладает рядом преимуществ в качестве оптического клеточного маркера .

После фотоконверсии фотоконвертированный белок Kaede излучает яркую и стабильную красную флуоресценцию. Эта флуоресценция может длиться месяцами без анаэробных условий. Поскольку это красное состояние Каэдэ является ярким и стабильным по сравнению с зеленым состоянием, а также поскольку непреобразованный зеленый Каэдэ излучает очень низкую интенсивность красной флуоресценции, красные сигналы обеспечивают контраст. ^[1]

Кроме того, перед фотоконверсией Каеде излучает ярко-зеленую флуоресценцию, что позволяет визуализировать локализацию нефотоактивированного белка. Это превосходит другие флуоресцентные белки, такие как PA-GFP и KFP1, которые перед фотоактивацией демонстрируют лишь низкую флуоресценцию. ^[3]

Кроме того, поскольку для наблюдения и зеленая, и красная флуоресценция Каеде возбуждаются синим светом с длиной волны 480 нм, этот свет не вызывает фотоконверсию. Таким образом, осветительные приборы для наблюдения и фотопреобразования могут быть полностью разделены.

Ограничения

Несмотря на полезность отслеживания клеток и визуализации клеток Kaede, существуют некоторые ограничения. Хотя Каэде меняет цвет на красный под воздействием УФ- или фиолетового света и демонстрирует 2000-кратное увеличение соотношения красной и зеленой флуоресценции, использование как красной, так и зеленой полос флуоресценции может вызвать проблемы в экспериментах с несколькими метками. Тетрамеризация Каеде может нарушать локализацию и транспортировку слитых белков. Это ограничивает полезность Kaede в качестве метки слитого белка .

Экологическое значение

Свойство фотоконверсии Каеде не только способствует его применению в мечении белков и отслеживании клеток, но и отвечает за огромные различия в цвете каменистых кораллов Trachyphyllia geoffroyi . Под солнечным светом из-за фотоконверсии Каэде щупальца и диски станут красными. Поскольку зеленый флуоресцентный Каэде синтезируется постоянно, эти кораллы снова кажутся зелеными по мере того, как создается больше непреобразованного Каэде. Из-за разной пропорции фотопреобразованных и непреобразованных Каэде кораллы обнаруживают большое разнообразие цветов.

Ссылки

Томура, М.; Ёсида, Н.; Танака, Дж.; Карасава, С.; Мива, Ю.; Мияваки, А.; Канагава, О. (2008). «Мониторинг клеточного движения in vivo с помощью фотоконвертируемого флуоресцентного белка «Каэде» трансгенных мышей» . Труды Национальной академии наук . 105 (31): 10871–10876. Бибкод : 2008PNAS..10510871T . дои : 10.1073/pnas.0802278105 . ПМК 2504797 . ПМИД 18663225 .
Диттрих, PS; Шефер, СП; Швилле, П. (2005). «Характеристика фотоконверсии реакции флуоресцентного белка Каеде на уровне одиночной молекулы» . Биофизический журнал . 89 (5): 3446–3455. Бибкод : 2005BpJ....89.3446D . doi : 10.1529/biophysj.105.061713 . ПМЦ 1366840 . ПМИД 16055537 .

^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Андо, Р. (2002). «Оптический маркер, основанный на индуцированной УФ-излучением фотоконверсии флуоресцентного белка из зеленого в красный» . Труды Национальной академии наук . 99 (20): 12651–12656. Бибкод : 2002PNAS...9912651A . дои : 10.1073/pnas.202320599 . ПМЦ 130515 . ПМИД 12271129 .
^ Мизуно, Х.; Мал, ТК; Тонг, К.И.; Андо, Р.; Фурута, Т.; Икура, М.; Мияваки, А. (2003). «Фотоиндуцированное расщепление пептида при преобразовании зеленого в красный флуоресцентного белка» . Молекулярная клетка . 12 (4): 1051–1058. дои : 10.1016/s1097-2765(03)00393-9 . ПМИД 14580354 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Липпинкотт-Шварц, Дж.; Альтан-Бонне, Н.; Паттерсон, GH (сентябрь 2003 г.). «Фотоотбеливание и фотоактивация: наблюдение за динамикой белков в живых клетках». Природная клеточная биология . Дополнение: S7–14. CiteSeerX 10.1.1.1072.3400 . doi : 10.1038/ncb1032 (неактивен 31 января 2024 г.). ПМИД 14562845 . S2CID 15044107 . {{cite journal}}: CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на январь 2024 г. ( ссылка ) CS1 maint: дата и год ( ссылка )
^ Муто, Т.; Мията, Т.; Кашиваги, С.; Мияваки, А.; Огава, М. (2006). «Динамическое поведение отдельных клеток в развивающихся органотипических срезах мозга, выявленное фотоконвертируемым белком Каеде». Экспериментальная неврология . 200 (2): 430–437. doi : 10.1016/j.expneurol.2006.03.022 . ПМИД 16753144 . S2CID 22238647 .

[Ando2002-1] Перейти обратно: ^а ^б ^с Андо, Р. (2002). «Оптический маркер, основанный на индуцированной УФ-излучением фотоконверсии флуоресцентного белка из зеленого в красный» . Труды Национальной академии наук . 99 (20): 12651–12656. Бибкод : 2002PNAS...9912651A . дои : 10.1073/pnas.202320599 . ПМЦ 130515 . ПМИД 12271129 .

[Mizuno2003-2] Мизуно, Х.; Мал, ТК; Тонг, К.И.; Андо, Р.; Фурута, Т.; Икура, М.; Мияваки, А. (2003). «Фотоиндуцированное расщепление пептида при преобразовании зеленого в красный флуоресцентного белка» . Молекулярная клетка . 12 (4): 1051–1058. дои : 10.1016/s1097-2765(03)00393-9 . ПМИД 14580354 .

[Lippincott-Schwartz2003-3] Перейти обратно: ^а ^б Липпинкотт-Шварц, Дж.; Альтан-Бонне, Н.; Паттерсон, GH (сентябрь 2003 г.). «Фотоотбеливание и фотоактивация: наблюдение за динамикой белков в живых клетках». Природная клеточная биология . Дополнение: S7–14. CiteSeerX 10.1.1.1072.3400 . doi : 10.1038/ncb1032 (неактивен 31 января 2024 г.). ПМИД 14562845 . S2CID 15044107 . {{cite journal}}: CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на январь 2024 г. ( ссылка ) CS1 maint: дата и год ( ссылка )

[Mutoh2006-4] Муто, Т.; Мията, Т.; Кашиваги, С.; Мияваки, А.; Огава, М. (2006). «Динамическое поведение отдельных клеток в развивающихся органотипических срезах мозга, выявленное фотоконвертируемым белком Каеде». Экспериментальная неврология . 200 (2): 430–437. doi : 10.1016/j.expneurol.2006.03.022 . ПМИД 16753144 . S2CID 22238647 .

[1]

[2]

[3]

[4]