STARR-последовательность
STARR-seq (сокращение от самотранскрибируемого секвенирования активной регуляторной области ) — это метод анализа активности энхансеров миллионов кандидатов из произвольных источников ДНК. Он используется для идентификации последовательностей, которые действуют как усилители транскрипции, прямым, количественным и общегеномным способом. [1]
У эукариот . транскрипция регулируется специфичными для последовательности ДНК-связывающими белками ( факторами транскрипции гена ), связанными с промотором , а также последовательностями удаленного контроля, включая энхансеры Энхансеры представляют собой некодирующие последовательности ДНК, содержащие несколько сайтов связывания различных факторов транскрипции. [2] Обычно они рекрутируют транскрипционные факторы, которые модулируют структуру хроматина и напрямую взаимодействуют с транскрипционным аппаратом, расположенным на промоторе гена. Энхансеры способны регулировать транскрипцию генов-мишеней в зависимости от типа клеток. [1] независимо от их местоположения или расстояния от промотора генов. В определенных контекстах (см. Трансвекция (генетика) ) они могут даже регулировать транскрипцию генов, расположенных в другой хромосоме . [3] Однако знания об энхансерах до сих пор ограничивались исследованиями небольшого числа энхансеров, поскольку их было трудно точно идентифицировать в масштабе всего генома. [2] Более того, многие регуляторные элементы функционируют только в определенных типах клеток и определенных условиях. [4]
Обнаружение усилителя
[ редактировать ]Обнаружение энхансера у дрозофилы представляет собой оригинальную методологию, использующую случайную вставку вектора, полученного из транспозона, который кодирует репортерный белок после минимального промотора. Этот подход позволяет наблюдать экспрессию репортера у трансгенных животных и предоставляет информацию о близлежащих генах, которые регулируются этими последовательностями. Открытие и характеристика типов клеток, а также генов, участвующих в их определении, были значительно улучшены с открытием этого метода. [5] [6] [7] [8]
За последние несколько лет постгеномные технологии продемонстрировали специфические особенности готовых и активных энхансеров, которые улучшили обнаружение энхансеров. [2] Разработка новых методов, таких как глубокое секвенирование гиперчувствительных участков ДНКазы I ( DNase-Seq ), выделение секвенирования регуляторных элементов с помощью формальдегида ( FAIRE-Seq ), иммунопреципитация хроматина с последующим глубоким секвенированием ( ChIP-секвенирование ) и цистром, определяемый MNase. -Анализ занятости (MOA-seq) [9] ), обеспечивают прогнозирование энхансера по всему геному на основе свойств хроматина, связанных с энхансером. [1]
Приложение
[ редактировать ]Однако сами по себе DNase-seq и FAIRE-seq не могут обеспечить прямое функциональное или количественное считывание активности энхансера, поэтому для количественной оценки активности энхансера необходимы репортерные анализы, которые могут определить силу энхансера на основе количественного обогащения репортерных транскриптов. Тем не менее, эти анализы не являются высокопроизводительными ( Высокопроизводительная биология ), поскольку невозможно провести миллионы тестов, необходимых для идентификации энхансеров в масштабе всего генома. [1] Разработка STARR-seq пытается обойти этот аналитический барьер. Используя знание о том, что энхансеры могут работать независимо от их относительного местоположения, последовательности-кандидаты размещаются ниже минимального промотора, что позволяет активным энхансерам транскрибировать себя. Сила каждого энхансера затем отражается его относительным обогащением среди клеточных РНК. Такое прямое связывание последовательностей-кандидатов с активностью энхансера позволяет параллельно оценивать миллионы фрагментов ДНК из произвольных источников. [1]
Методология
[ редактировать ]Геномная ДНК случайным образом разрезается и распадается на мелкие фрагменты. Адаптеры лигируются с фрагментами ДНК выбранного размера. Затем фрагменты, связанные с адаптером, амплифицируются и продукты ПЦР очищаются с последующим размещением последовательностей-кандидатов после минимального промотора скрининговых векторов, что дает им возможность транскрибировать себя. Затем клетки-кандидаты трансфицируют репортерной библиотекой и культивируют. тотальные РНК После этого экстрагируют поли-А и выделяют -РНК. Используя обратной транскрипции метод , кДНК получают, амплифицируют, а затем фрагменты-кандидаты используются для высокопроизводительного секвенирования парных концов . Считывания последовательностей сопоставляются с эталонным геномом и выполняется вычислительная обработка данных. [1]
Идентификация энхансеров
[ редактировать ]Применяя эту технологию к геному дрозофилы, Арнольд и др. [1] обнаружили 96% неповторяющихся геномов с как минимум 10-кратным покрытием. Авторы обнаружили, что большинство идентифицированных энхансеров (55,6%) располагались внутри интронов , особенно в первом интроне и межгенных областях . 4,5% энхансеров были расположены в сайтах начала транскрипции (TSS), что позволяет предположить, что эти энхансеры могут начинать транскрипцию, а также улучшать транскрипцию из удаленного TSS. [1] Самые сильные энхансеры находились рядом с генами домашнего хозяйства, такими как ферменты или компоненты цитоскелета , и регуляторами развития, такими как факторы транскрипции. Самый сильный энхансер располагался внутри интрона транскрипционного фактора zfh1. Этот транскрипционный фактор регулирует экспрессию нейропептидов и рост личиночных нервно-мышечных соединений у дрозофилы. [10] Гены рибосомальных белков были единственным классом генов с плохим рейтингом энхансеров. Более того, авторы продемонстрировали, что многие гены регулируются несколькими независимыми активными энхансерами даже в одном типе клеток. Более того, уровни экспрессии генов в среднем коррелировали с суммой сил энхансеров на один ген, что подтверждает прямую связь между экспрессией генов и активностью энхансера. [1]
Характеристика вариантов аллелей
[ редактировать ]Применяя эту технологию для характеристики и обнаружения аллелей регуляторных вариантов, Vockley et al. [11] охарактеризовали влияние генетических вариаций человека на функцию некодирующих регуляторных элементов, измеряя активность 100 предполагаемых энхансеров, полученных непосредственно из геномов 95 членов исследуемой группы. Этот подход позволяет функционально точно картировать причинные регуляторные варианты в областях высокого неравновесия по сцеплению, выявленных с помощью анализа eQTL . Этот подход обеспечивает общий путь для выявления нарушений в регуляторных элементах генов, которые способствуют сложным фенотипам.
Количественная оценка активности энхансера
[ редактировать ]STARR-seq использовался для измерения регуляторной активности фрагментов ДНК, которые были обогащены сайтами, занятыми специфическими факторами транскрипции. Клонирование библиотек ДНК ChIP , полученных в результате иммунопреципитации хроматина глюкокортикоидного рецептора , в STARR-seq позволило количественно оценить активность энхансера, индуцированного глюкокортикоидами, в масштабе генома. [12] Этот подход полезен для измерения различий в активности энхансеров между сайтами, связанными одним и тем же фактором транскрипции.
Преимущества
[ редактировать ] |
- Количественный полногеномный анализ для обнаружения энхансеров. [1]
- Применимый метод скрининга произвольных источников ДНК в любом типе клеток или ткани, позволяющий адекватно внедрить репортерные конструкции. [1]
- Метод с высокой степенью обнаружения (>99%) за счет использования парного секвенирования, даже для последовательностей, содержащих элементы, дестабилизирующие транскрипт.
- Метод количественной оценки силы энхансеров и идентификации эндогенно молчащих энхансеров путем интеграции их в хромосомный контекст. [1]
Будущие направления
[ редактировать ]Сочетая традиционный подход с технологией высокопроизводительного секвенирования и узкоспециализированными биокомпьютерными методами, STARR-seq способен обнаруживать энхансеры количественно и по всему геному. Изучение регуляции генов и их ответственных путей в геноме во время нормального развития, а также при заболевании может быть очень сложным. Таким образом, применение STARR-seq ко многим типам клеток разных организмов помогает идентифицировать регуляторные элементы генов, специфичных для типа клеток, и практически оценить некодирующие мутации, вызывающие заболевания. Недавно был разработан и широко проверен на клеточных линиях млекопитающих родственный подход, сочетающий захват интересующих областей с методом STARR-seq. [13]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л Арнольд С.Д., Герлах Д., Стельцер С., Боринь Л.М., Рат М., Старк А. (март 2013 г.). «Карты количественной активности энхансеров по всему геному, определенные с помощью STARR-seq». Наука . 339 (6123): 1074–1077. Бибкод : 2013Sci...339.1074A . дои : 10.1126/science.1232542 . ПМИД 23328393 . S2CID 54488955 .
- ^ Jump up to: а б с Сюй Дж, Смейл СТ (ноябрь 2012 г.). «Проектирование ландшафта энхансеров» . Клетка . 151 (5): 929–931. дои : 10.1016/j.cell.2012.11.007 . ПМЦ 3732118 . ПМИД 23178114 .
- ^ Онг КТ, Корсес В.Г. (апрель 2011 г.). «Функция усилителя: новое понимание регуляции экспрессии тканеспецифичных генов» . Обзоры природы. Генетика . 12 (4): 283–293. дои : 10.1038/nrg2957 . ПМК 3175006 . ПМИД 21358745 .
- ^ Бейкер М. (май 2011 г.). «Усилители мелирования» . Природные методы . 8 (5): 373. doi : 10.1038/nmeth0511-373 . ПМИД 21678620 .
- ^ Беллен HJ (декабрь 1999 г.). «Десять лет обнаружения энхансеров: уроки с лету» . Растительная клетка . 11 (12): 2271–2281. дои : 10.2307/3870954 . JSTOR 3870954 . ПМЦ 144146 . ПМИД 10590157 .
- ^ Бир Э., Вассин Х., Шеперд С., Ли К., МакКолл К., Барбел С. и др. (сентябрь 1989 г.). «Поиск закономерностей и мутаций в геноме дрозофилы с помощью вектора P-lacZ» . Гены и развитие . 3 (9): 1273–1287. дои : 10.1101/gad.3.9.1273 . ПМИД 2558049 .
- ^ Уилсон С., Пирсон Р.К., Беллен Х.Дж., О'Кейн С.Дж., Гроссниклаус У., Геринг В.Дж. (сентябрь 1989 г.). «Обнаружение энхансера, опосредованное P-элементом: эффективный метод выделения и характеристики генов, регулируемых развитием, у дрозофилы» . Гены и развитие . 3 (9): 1301–1313. дои : 10.1101/gad.3.9.1301 . ПМИД 2558051 .
- ^ О'Кейн CJ, Геринг WJ (декабрь 1987 г.). «Обнаружение in situ геномных регуляторных элементов у дрозофилы» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 84 (24): 9123–9127. Бибкод : 1987PNAS...84.9123O . дои : 10.1073/pnas.84.24.9123 . ПМК 299704 . ПМИД 2827169 .
- ^ Савадель С.Д., Хартвиг Т., Терпин З.М., Вера Д.Л., Лунг П.Ю., Суй X и др. (август 2021 г.). «Нативные семейства цистромов и последовательностей мотивов кукурузного початка» . ПЛОС Генетика . 17 (8): e1009689. дои : 10.1371/journal.pgen.1009689 . ПМЦ 8360572 . ПМИД 34383745 .
- ^ Фоглер Дж., Урбан Дж. (июль 2008 г.). «Транскрипционный фактор Zfh1 участвует в регуляции экспрессии нейропептидов и роста личиночных нервно-мышечных соединений у Drosophila melanogaster» . Биология развития . 319 (1): 78–85. дои : 10.1016/j.ydbio.2008.04.008 . ПМИД 18499094 .
- ^ Вокли CM, Го C, Майорос WH, Нодзенски М, Шолтенс DM, Хейс MG и др. (август 2015 г.). «Массовая параллельная количественная оценка регуляторных эффектов некодирующих генетических вариаций в группе людей» . Геномные исследования . 25 (8): 1206–1214. дои : 10.1101/гр.190090.115 . ПМК 4510004 . ПМИД 26084464 .
- ^ Вокли CM, Д'Ипполито AM, Макдауэлл IC, Майорос WH, Сафи А, Сонг Л и др. (август 2016 г.). «Сайты прямого связывания GR усиливают кластеры связывания TF в геноме человека» . Клетка . 166 (5): 1269–1281.e19. дои : 10.1016/j.cell.2016.07.049 . ПМК 5046229 . ПМИД 27565349 .
- ^ Ванхилл Л., Гриффон А., Макбул М.А., Закариас-Кабеса Дж., Дао Л.Т., Фернандес Н. и др. (апрель 2015 г.). «Высокопроизводительная и количественная оценка активности энхансера у млекопитающих с помощью CapStarr-seq» . Природные коммуникации . 6 : 6905. Бибкод : 2015NatCo...6.6905V . дои : 10.1038/ncomms7905 . ПМИД 25872643 . S2CID 205336994 .