✖


Jump to content

Теломеры в клеточном цикле

Add links

Теломеры , колпачки на концах эукариотических хромосом , играют решающую роль в клеточном старении и раке . Важным аспектом того, как теломеры выполняют эти функции, является их участие в регуляции клеточного цикла .

Эукариотические клетки

[ редактировать ]

Поскольку эукариотические хромосомы линейны и поскольку репликация ДНК с помощью ДНК-полимеразы требует присутствия праймера РНК , который позже разрушается, эукариотические клетки сталкиваются с проблемой конечной репликации. [ 1 ] Эта проблема делает эукариотические клетки неспособными копировать последние несколько оснований на 3'-конце цепи матричной ДНК, что приводит к укорочению хромосомы и, следовательно, теломеры в каждой S-фазе . [ 2 ] Измерения длины теломер разных типов клеток в разном возрасте позволяют предположить, что это постепенное укорочение хромосом приводит к постепенному уменьшению длины теломер со скоростью примерно 25 нуклеотидов в год. [ 3 ]

Активаторы и регуляторы клеточного цикла

[ редактировать ]

Комплексы теломер -убежище , которые покрывают все эукариотические хромосомы, гарантируют, что здоровые клетки могут продвигаться по клеточному циклу, не позволяя реакции повреждения клеточной ДНК идентифицировать концы хромосом как двухцепочечные разрывы (DSB). [ 4 ] [ 5 ] Без защитного колпачка концы хромосом выглядели бы идентичными внутрихромосомным DSB. Эти DSB активируют путь ответа на повреждение ДНК, который останавливает клеточный цикл до тех пор, пока разрывы не будут устранены. Этот путь контрольной точки инициируется у S. cerevisiae путем рекрутирования протеинкиназ Mec1 и Tel1, а у млекопитающих - путем рекрутирования протеинкиназ ATR и ATM . [ 6 ] Что касается восстановления DSB, эукариоты обычно используют две стратегии: негомологическое соединение концов (NHEJ), которое включает быстрое присоединение сломанных концов; и гомологичная рекомбинация (HR), которая включает использование гомологичной последовательности ДНК для восстановления разрыва. Поскольку HR требует гомологичной последовательности, ее использование ограничено фазой S/G2 . [ 7 ] (Интересно, что, как и во многих других аспектах клеточного цикла, [ 8 ] циклин-зависимые киназы ответственны за подавление NHEJ во время фазы S/G2, чтобы обеспечить использование более точного HR. [ 9 ] ) Как показано на рисунке 1А, комплексы теломер-убежище содержат мотивы, которые ингибируют контрольную точку повреждения ДНК, NHEJ и HR.

Первоначальная работа по изучению роли связанных с теломерами белковых комплексов у S. cerevisiae выявила механизм, с помощью которого эти комплексы предотвращают активацию контрольных точек и репарацию DSB концов хромосом. Двумя основными белковыми комплексами, которые связываются с теломерной ДНК S. cerevisiae, являются:

  • комплекс Cdc13-Stn1-Ten1 (CST), который связывает одноцепочечную ДНК (оцДНК) 3'-G-богатого выступа на конце теломеры, и
  • комплекс Rif1 -Rif2- Rap1 , который связывает двухцепочечную ДНК (дцДНК), предшествующую 3'-концу.

Комплекс CST и Rif1 предотвращают рекрутирование Mec1, тем самым предотвращая активацию контрольных точек. [ 5 ] [ 10 ] Между тем, Rif2 и Rap1 ингибируют NHEJ: нокаут Rif2 или Rap1 приводит к увеличению длины теломер по данным ПЦР , что указывает на возникновение NHEJ. [ 11 ] Эти нокаутные штаммы (в отличие от штаммов, лишенных функционального CST или Rif1) продолжают циклически развиваться, что дополнительно позволяет предположить, что Rif2 и Rap1 не участвуют в ингибировании активации контрольных точек. [ 12 ]

Аналогично, белки, которые связываются с теломерами человека как часть комплекса шелтерина, обеспечивают прогресс клеточного цикла и предотвращают ошибочную репарацию DSB. Белок POT1 связывается с оцДНК, предотвращает активацию контрольных точек путем ингибирования рекрутирования ATR и предотвращает HR; [ 13 ] [ 14 ] RAP1, ГТФаза, связывается с дцДНК и предотвращает HR; [ 15 ] а белок TRF2 (также известный как TERF2) связывается с дцДНК, предотвращает активацию контрольных точек путем ингибирования рекрутирования ATM и предотвращает NHEJ. [ 16 ] [ 17 ] TRF2 уникален среди этих белков своей ролью в формировании и поддержании Т-петлей: лариатные структуры, образующиеся в результате сворачивания оцДНК, нависают обратно на дцДНК. Т-петли могут дополнительно ингибировать связывание белков активации контрольных точек. [ 18 ]

Рисунок 1. (A) Белки, связанные с теломерами, участвуют в предотвращении активации контрольной точки ответа на повреждение ДНК и механизмов репарации DSB у S. cerevisiae (вверху) и у людей (внизу). (B) Обзор нормальной функции комплексов теломер-убежище и путей, активируемых укорочением теломер. [ 5 ]

Поскольку теломеры укорачиваются как естественное следствие повторного деления клеток или из-за других факторов, таких как окислительный стресс , [ 19 ] Белки шелтерина теряют способность связываться с теломерной ДНК. Когда теломеры достигают критически короткой длины, белки шелтерина, достаточные для ингибирования активации контрольных точек, становятся недоступными, хотя NHEJ и HR обычно остаются ингибированными в этот момент. [ 5 ] Эта потеря торможения является одной из причин, почему укорочение теломер вызывает старение (рис. 1B).

Теломеры и дерегуляция клеточного цикла

[ редактировать ]

Почти все раковые клетки имеют укороченные теломеры. [ 20 ] Это может показаться нелогичным, поскольку короткие теломеры должны активировать контрольную точку повреждения ДНК ATR/ATM и тем самым предотвращать деление. Решение вопроса о том, почему раковые клетки имеют короткие теломеры, привело к разработке двухэтапной модели того, как раковые клетки нарушают теломерную регуляцию клеточного цикла. Во-первых, контрольная точка повреждения ДНК должна быть инактивирована, чтобы позволить клеткам продолжать делиться, даже когда теломеры преодолеют порог критической длины. Это требование следует не только из приведенного выше обсуждения, но и из данных in vivo, показывающих функцию этой контрольной точки при предраковых поражениях и ее дисфункцию при опухолях поздних стадий. [ 21 ] Во-вторых, чтобы выжить после отключения контрольной точки повреждения ДНК, предраковые клетки должны активировать механизмы удлинения своих теломер. [ 22 ] [ 23 ] В результате продолжающегося деления после точки нормального старения теломеры этих клеток становятся слишком короткими, чтобы предотвратить NHEJ (негомологическое соединение концов) и HR (гомологичная рекомбинация) концов хромосом, вызывая состояние, известное как кризис. [ 24 ] Применение этих механизмов восстановления DSB (двойных разрывов цепи) к концам хромосом приводит к генетической нестабильности, и хотя эта нестабильность может способствовать канцерогенезу, она индуцирует апоптоз, если происходит слишком долго. [ 23 ] Чтобы выжить и размножаться, предраковые клетки должны стабилизировать длину своих теломер. Это происходит посредством активации теломеразы или активации пути рекомбинации теломер (т. е. пути АЛТ). [ 22 ] [ 25 ] Таким образом, раковые клетки имеют короткие теломеры, потому что они проходят промежуточную стадию укорочения теломер, вызванную делением после инактивации контрольной точки повреждения ДНК, прежде чем активировать механизмы поддержания длины теломер.

С конца 1990-х годов исследователи предложили использовать ингибиторы теломеразы в качестве лечения рака. [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ] Хотя такие ингибиторы серьезно рассматривались для лечения рака с конца 2000-х годов, они широко не используются. [ 29 ] Две проблемы, связанные с применением ингибиторов теломеразы в лечении рака, заключаются в том, что эффективное лечение требует непрерывного, долгосрочного применения лекарств и что часто наблюдаются нецелевые эффекты. [ 30 ] Например, ингибитор теломеразы ителстат, впервые предложенный в 2003 году. [ 31 ] [ 32 ] был задержан в клинических испытаниях из-за гематологической токсичности. [ 30 ] Несмотря на эти опасения, разработка методов лечения рака на основе теломеразы остается активной областью исследований.

Время клеточного цикла удлинения теломер

[ редактировать ]

Хотя активация теломеразы не происходит во время клеточного цикла нормальных соматических клеток человека, связь между удлинением теломер (особенно удлинением теломеразы) и развитием опухоли подчеркивает важность понимания того, когда такое удлинение может происходить во время клеточного цикла. Работа с S. cerevisiae выявила, что активность теломеразы ограничена поздней S-фазой. [ 33 ] [ 34 ] Исследователи создали штаммы S. cerevisiae с укороченными теломерами, индуцируемыми галактозой. [ 33 ] Затем они использовали α-фактор для блокирования клеток с индуцированными короткими теломерами в поздней фазе G1 и измерили изменение длины теломер, когда клетки высвобождались в различных условиях. Они обнаружили, что когда клетки высвобождали и одновременно обрабатывали нокодазолом , ингибитором клеточного цикла фазы G2/M, длина теломер увеличивалась в течение первых нескольких часов, а затем оставалась постоянной. Для сравнения, когда клетки высвобождались и им давали возможность работать на цикле, длина теломер увеличивалась линейно со временем. [ 34 ] Эти данные позволяют предположить, что удлинение теломер происходит только в S-фазе. Дополнительные эксперименты с большим временным разрешением подтверждают эту гипотезу и сужают временные рамки до поздней S-фазы. Исследователи связали удлинение теломер в этих экспериментах с активностью теломеразы, наблюдая, что у штамма S. cerevisiae с дисфункциональным путем АЛТ удлинение теломер все еще происходит. [ 34 ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Леви, Майкл З.; Олсопп, Ричард С.; Футчер, А.Брюс; Грейдер, Кэрол В.; Харли, Кэлвин Б. (июнь 1996 г.). «Проблема репликации концов теломер и старение клеток». Журнал молекулярной биологии . 225 (4): 951–960. дои : 10.1016/0022-2836(92)90096-3 . ISSN   0022-2836 . ПМИД   1613801 .
  2. ^ Обер, Джеральдин; Лансдорп, Питер М. (апрель 2008 г.). «Теломеры и старение». Физиологические обзоры . 88 (2): 557–579. doi : 10.1152/physrev.00026.2007 . ISSN   0031-9333 . ПМИД   18391173 . S2CID   8372200 .
  3. ^ Даниали, Лилия; Бенетос, Афанасий; Сассер, Эзра; Карк, Джереми Д.; Лабат, Карлос; Кимура, Масаюки; Десаи, Кундж К.; Граник, Марк; Авив, Авраам (24 июля 2013 г.). «Ошибка: исправление: теломеры укорачиваются с одинаковой скоростью в соматических тканях взрослых» . Природные коммуникации . 4 (1). дои : 10.1038/ncomms2976 . ISSN   2041-1723 .
  4. ^ Мартинес, Паула; Бласко, Мария А. (16 сентября 2010 г.). «Роль убежища в развитии рака и старения» . Стареющая клетка . 9 (5): 653–666. дои : 10.1111/j.1474-9726.2010.00596.x . ISSN   1474-9718 . ПМИД   20569239 .
  5. ^ Jump up to: а б с д Гоббини, Элиза; Тровеси, Камилла; Кассани, Коринн; Лонгезе, Мария Пиа (28 июля 2014 г.). «Раскрытие теломер на перекрестке между остановкой клеточного цикла и канцерогенезом» . Молекулярная и клеточная онкология . 1 (1): e29901. дои : 10.4161/mco.29901 . ПМЦ   4905175 . ПМИД   27308311 .
  6. ^ Бирма, Сандип; Чен, Бенджамин ПК; Чен, Дэвид Дж. (сентябрь 2006 г.). «Роль негомологичного соединения концов (NHEJ) в поддержании целостности генома». Восстановление ДНК . 5 (9–10): 1042–1048. дои : 10.1016/j.dnarep.2006.05.026 . ISSN   1568-7864 . ПМИД   16822724 .
  7. ^ Чичча, Альберто; Элледж, Стивен Дж. (октябрь 2010 г.). «Реакция на повреждение ДНК: как сделать игру с ножами безопасной» . Молекулярная клетка . 40 (2): 179–204. doi : 10.1016/j.molcel.2010.09.019 . ISSN   1097-2765 . ПМЦ   2988877 . ПМИД   20965415 .
  8. ^ Мюррей, Эндрю В.; Киршнер, Марк В. (май 1989 г.). «Синтез циклина управляет ранним эмбриональным клеточным циклом». Природа . 339 (6222): 275–280. Бибкод : 1989Natur.339..275M . дои : 10.1038/339275a0 . ISSN   0028-0836 . ПМИД   2566917 . S2CID   4352582 .
  9. ^ Ира, Гжегож; Пелличоли, Ахилл; Балиджа, Алитукириза; Ван, Сюань; Фиорани, Симона; Каротенуто, Уолтер; Либери, Джордано; Брессан, Дебра; Ван, Лихун; Холлингсворт, Нэнси М.; Хабер, Джеймс Э. (октябрь 2004 г.). «Резекция концов ДНК, гомологичная рекомбинация и активация контрольной точки повреждения ДНК требуют CDK1» . Природа . 431 (7011): 1011–1017. Бибкод : 2004Natur.431.1011I . дои : 10.1038/nature02964 . ISSN   0028-0836 . ПМЦ   4493751 . ПМИД   15496928 .
  10. ^ Рибейр, Сирил; Шор, Дэвид (12 февраля 2012 г.). «Пути антиконтрольных точек на теломерах дрожжей». Структурная и молекулярная биология природы . 19 (3): 307–313. дои : 10.1038/nsmb.2225 . ISSN   1545-9993 . ПМИД   22343724 . S2CID   10636976 .
  11. ^ Марканд, С.; Пардо, Б.; Гратиас, А.; Кахун, С.; Каллебо, И. (1 мая 2008 г.). «Множество путей ингибируют NHEJ в теломерах» . Гены и развитие . 22 (9): 1153–1158. дои : 10.1101/gad.455108 . ISSN   0890-9369 . ПМЦ   2335312 . ПМИД   18451106 .
  12. ^ Бонетти, Диего; Клеричи, Микела; Анбалаган, Савани; Мартина, Марина; Луккини, Джованна; Лонгезе, Мария Пиа (27 мая 2010 г.). «Подобные шелтерину белки и Yku ингибируют нуклеолитический процессинг теломер Saccharomyces cerevisiae» . ПЛОС Генетика . 6 (5): e1000966. дои : 10.1371/journal.pgen.1000966 . ISSN   1553-7404 . ПМЦ   2877729 . ПМИД   20523746 .
  13. ^ Хоккемейер, Дирк; Сфейр, Агнель Дж; Шэй, Джерри В.; Райт, Вудринг Э; де Ланге, Титиа (23 июня 2005 г.). «POT1 защищает теломеры от временной реакции на повреждение ДНК и определяет, как заканчиваются хромосомы человека» . Журнал ЭМБО . 24 (14): 2667–2678. дои : 10.1038/sj.emboj.7600733 . ISSN   0261-4189 . ПМК   1176460 . ПМИД   15973431 .
  14. ^ Ву, Линг; Мултани, Аша С.; Он, Хуа; Косме-Бланко, Вильфредо; Дэн, Ю; Дэн, Цзянь Мин; Бачило, Ольга; Патхак, Сен; Тахара, Хидетоши; Бейли, Сьюзен М.; Дэн, Ибинь (июль 2006 г.). «Дефицит Pot1 инициирует активацию контрольной точки повреждения ДНК и аберрантную гомологичную рекомбинацию теломер» . Клетка . 126 (1): 49–62. дои : 10.1016/j.cell.2006.05.037 . ISSN   0092-8674 . ПМИД   16839876 .
  15. ^ Сфейр, А.; Кабир, С.; ван Овербек, М.; Челли, Великобритания; де Ланге, Т. (25 марта 2010 г.). «Потеря Rap1 вызывает рекомбинацию теломер в отсутствие NHEJ или сигнала повреждения ДНК» . Наука . 327 (5973): 1657–1661. Бибкод : 2010Sci...327.1657S . дои : 10.1126/science.1185100 . ISSN   0036-8075 . ПМК   2864730 . ПМИД   20339076 .
  16. ^ Карлседер, Дж. (26 февраля 1999 г.). «p53- и ATM-зависимый апоптоз, индуцированный теломерами, лишенными TRF2». Наука . 283 (5406): 1321–1325. дои : 10.1126/science.283.5406.1321 . ISSN   0036-8075 . ПМИД   10037601 .
  17. ^ Челли, Джулия Б.; де Ланге, Титиа (19 июня 2005 г.). «Обработка ДНК не требуется для реакции на повреждение теломер, опосредованной АТМ, после делеции TRF2». Природная клеточная биология . 7 (7): 712–718. дои : 10.1038/ncb1275 . ISSN   1465-7392 . ПМИД   15968270 . S2CID   38625185 .
  18. ^ Доксани, Юлли; Ву, Джон Ю.; де Ланге, Тития; Чжуан, Сяовэй (октябрь 2013 г.). «Флуоресцентная визуализация теломер со сверхразрешением выявляет TRF2-зависимое образование Т-петли» . Клетка . 155 (2): 345–356. дои : 10.1016/j.cell.2013.09.048 . ISSN   0092-8674 . ПМК   4062873 . ПМИД   24120135 .
  19. ^ фон Зглиницкий, Томас (июль 2002 г.). «Окислительный стресс укорачивает теломеры». Тенденции биохимических наук . 27 (7): 339–344. дои : 10.1016/s0968-0004(02)02110-2 . ISSN   0968-0004 . ПМИД   12114022 .
  20. ^ Шей, Джерри В.; Райт, Вудринг Э. (декабрь 2011 г.). «Роль теломер и теломеразы при раке» . Семинары по биологии рака . 21 (6): 349–353. дои : 10.1016/j.semcancer.2011.10.001 . ISSN   1044-579X . ПМК   3370415 . ПМИД   22015685 .
  21. ^ Ван, Хайюн; Чжан, Сяошань; Тэн, Лисонг; Легерски, Рэнди Дж. (июнь 2015 г.). «Восстановление контрольных точек повреждения ДНК и развитие рака». Экспериментальные исследования клеток . 334 (2): 350–358. дои : 10.1016/j.yexcr.2015.03.011 . ISSN   0014-4827 . ПМИД   25842165 .
  22. ^ Jump up to: а б Чин, Линда; Артанди, Стивен Э; Шен, Цюн; Тэм, Элис; Ли, Шву-Луан; Готлиб, Джеффри Дж; Грейдер, Кэрол В.; ДеПиньо, Рональд А. (май 1999 г.). «Дефицит p53 спасает неблагоприятные последствия потери теломер и взаимодействует с дисфункцией теломер, ускоряя канцерогенез» . Клетка . 97 (4): 527–538. дои : 10.1016/s0092-8674(00)80762-x . ISSN   0092-8674 . ПМИД   10338216 .
  23. ^ Jump up to: а б Рудольф, Карл Ленхард; Миллард, Мелисса; Бозенберг, Маркус В.; ДеПиньо, Рональд А. (июнь 2001 г.). «Дисфункция теломер и эволюция рака кишечника у мышей и людей». Природная генетика . 28 (2): 155–159. дои : 10.1038/88871 . ISSN   1061-4036 . ПМИД   11381263 . S2CID   8957081 .
  24. ^ Счетчик, СМ; Авилион, А.А.; ЛеФёвр, CE; Стюарт, штат Нью-Йорк; Грейдер, CW; Харли, CB; Баккетти, С. (май 1992 г.). «Укорочение теломер, связанное с нестабильностью хромосом, останавливается в иммортализованных клетках, которые экспрессируют теломеразную активность» . Журнал ЭМБО . 11 (5): 1921–1929. дои : 10.1002/j.1460-2075.1992.tb05245.x . ISSN   0261-4189 . ПМК   556651 . ПМИД   1582420 .
  25. ^ Лундблад, Виктория; Блэкберн, Элизабет Х. (апрель 1993 г.). «Альтернативный путь поддержания теломер дрожжей спасает старение est1». Клетка . 73 (2): 347–360. дои : 10.1016/0092-8674(93)90234-h . ISSN   0092-8674 . ПМИД   8477448 . S2CID   43731893 .
  26. ^ Сарецки, Габриэле (май 2003 г.). «Ингибирование теломеразы как терапия рака». Раковые письма . 194 (2): 209–219. дои : 10.1016/s0304-3835(02)00708-5 . ISSN   0304-3835 . ПМИД   12757979 .
  27. ^ Ким, Северо-Запад (апрель 1997 г.). «Клинические последствия теломеразы при раке». Европейский журнал рака . 33 (5): 781–786. дои : 10.1016/s0959-8049(97)00057-9 . ISSN   0959-8049 . ПМИД   9282117 .
  28. ^ Отексье, Шанталь; Грейдер, Кэрол (октябрь 1996 г.). «Теломераза и рак: пересмотр гипотезы теломер». Тенденции биохимических наук . 21 (10): 387–391. дои : 10.1016/s0968-0004(96)10042-6 . ISSN   0968-0004 . ПМИД   8918193 .
  29. ^ Иванчич, Марко; Шранк, Закари; Войдила, Люк; Левискас, Брэндон; Кукович, Адижан; Санджали, Анкита; Пури, Нилу (19 февраля 2017 г.). «Лечение рака путем воздействия на теломеры и теломеразу» . Антиоксиданты . 6 (1): 15. дои : 10.3390/antiox6010015 . ISSN   2076-3921 . ПМК   5384178 . ПМИД   28218725 .
  30. ^ Jump up to: а б Джафри, Мохаммед А.; Ансари, Шакил А.; Алькахтани, Мохаммед Х.; Шэй, Джерри В. (20 июня 2016 г.). «Роль теломер и теломеразы при раке, а также достижения в терапии, нацеленной на теломеразу» . Геномная медицина . 8 (1): 69. дои : 10.1186/s13073-016-0324-x . ISSN   1756-994Х . ПМЦ   4915101 . ПМИД   27323951 .
  31. ^ Грязнов Сергей; Асайя, Акира; Осима, Юко; Ямамото, Ёсихиро; Понграч, Кристина; Прузан, Рональд; Вундер, Эллен; Пятишек, Мечислав; Ли, Шихун; Чин, Эллисон; Харли, Кэлвин; Акинага, Сиро; Ямасита, Ёсинори (октябрь 2003 г.). «Олигонуклеотидные N3'→P5' антагонисты тиофосфорамидат-теломеразной матрицы как потенциальные противораковые агенты». Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты . 22 (5–8): 577–581. дои : 10.1081/NCN-120021958 . ПМИД   14565232 . S2CID   13199258 .
  32. ^ Рёт, Александр; Харли, Кэлвин Б.; Баерлохер, Габриэла М. (2010). «Иметелстат (GRN163L) - терапия рака на основе теломеразы». Малые молекулы в онкологии . Последние результаты исследований рака. Том. 184. стр. 221–234. дои : 10.1007/978-3-642-01222-8_16 . ISBN  978-3-642-01221-1 . ПМИД   20072842 .
  33. ^ Jump up to: а б Марканд, С.; Бревет, В; Гилсон, Э. (15 июня 1999 г.). «Прогрессивное цис-ингибирование теломеразы при удлинении теломер» . Журнал ЭМБО . 18 (12): 3509–3519. дои : 10.1093/emboj/18.12.3509 . ПМК   1171430 . ПМИД   10369690 .
  34. ^ Jump up to: а б с Марканд, Стефан; Бревет, Ванесса; Манн, Карл; Гилсон, Эрик (апрель 2000 г.). «Ограничение клеточного цикла удлинения теломер» . Современная биология . 10 (8): 487–490. дои : 10.1016/s0960-9822(00)00450-4 . ПМИД   10801419 .
[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Telomeres_in_the_cell_cycle&oldid=1187735684"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: d8369091d5a87acdfac75932825ad900__1701387900
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/d8/00/d8369091d5a87acdfac75932825ad900.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Telomeres in the cell cycle - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)