мЧерри
mCherry является членом семейства мономерных красных флуоресцентных белков mFruits (mRFP). В качестве RFP mCherry был получен из DsRed морских Discosoma анемонов , в отличие от зеленых флуоресцентных белков (GFP), которые часто получают из Aequorea victoria медузы . [1] Флуоресцентные белки используются для маркировки компонентов в клетках, чтобы их можно было изучать с помощью флуоресцентной спектроскопии и флуоресцентной микроскопии . mCherry поглощает свет с длиной волны от 540 до 590 нм и излучает свет в диапазоне 550-650 нм. [2] mCherry принадлежит к группе флуоресцентных белковых хромофоров, используемых в качестве инструментов для визуализации генов и анализа их функций в экспериментах. Редактирование генома значительно улучшилось благодаря точному внедрению этих флуоресцентных белковых меток в генетический материал многих разнообразных организмов. Большинство сравнений яркости и фотостабильности различных флуоресцентных белков было проведено in vitro , без учета биологических переменных, которые влияют на работу белков в клетках или организмах. [3] Трудно идеально смоделировать клеточную среду in vitro, и разница в окружающей среде может повлиять на яркость и фотостабильность.
mRFP, такие как mCherry, полезны, поскольку они имеют меньшую молекулярную массу и сворачиваются быстрее, чем тетрамеры , что приводит к уменьшению нарушений в целевой системе.
Разработка
[ редактировать ]DsRed выделен из морских анемонов Discosoma и представляет собой тетрамерный белок . [1] Большинство красных флуоресцентных белков происходит от DsRed. DsRed имеет низкую фотостабильность (устойчивость к изменению под воздействием света) и медленную скорость созревания (время до сворачивания половины белка). mRFP1 происходит от DsRed и является мономером , поэтому он меньше по размеру, но его квантовый выход и фотостабильность меньше, чем у DsRed. [1] mCherry и другие mFruits имеют улучшенную яркость и фотостабильность по сравнению с DsRed и mRFP1. mCherry был разработан Робертом Э. Кэмпбеллом путем направленной эволюции mRFP1. [1] В целом mFruits были разработаны потому, что, хотя у других антозоа можно найти белки разного цвета , эти белки в основном будут тетрамерами, которые, скорее всего, будут иметь те же проблемы, что и DsRed. Эти тетрамеры потребуют производных, подобных тем, что были сделаны с DsRed, чтобы сделать их полезными партнерами для слияния. [1] В результате mFruits были получены из mRFP1 путем корректировки ключевых аминокислот с целью регулировки длин волн возбуждения и излучения. Различные цвета позволяют отслеживать различные типы клеток, транскрипционную активность и слияние белков. mCherry из всех разработанных настоящих мономеров обладает самой длинной длиной волны, самой высокой фотостабильностью, самым быстрым созреванием, превосходной устойчивостью к pH и наиболее близок к mRFP1 по максимумам возбуждения и эмиссии. [1] Однако mCherry имеет меньший квантовый выход , чем mRFP1. [1]
Структура
[ редактировать ]Ген mCherry имеет длину 711 пар оснований . [4] а белок состоит из 236 остатков массой 26,722 кДа . [5] Кристаллическая структура mCherry была определена в 2006 году. [6] Он содержит 3 альфа-спирали и 13 бета-листов , которые составляют бета-цилиндр . Хромофор метионина mCherry состоит из трех аминокислот: , тирозина и глицина , которые посттрансляционно модифицируются в имидазолинон . [1] Число этих остатков в последовательности составляет 71, 72 и 73 соответственно. Расширенное пи-электронное сопряжение придает mCherry поглощение и излучение с красным смещением. [7] Хромофор формируется из центральной спирали, защищенной от растворителя в 11-нитевом бета-цилиндре. [7] Эта структура почти идентична третичной структуре DsRed, которая также имеет 11-нитевой бета-цилиндр, и аналогична третичной структуре GFP. [8] Это делает среду вокруг хромофора mCherry более гидрофобной , чем среда вокруг хромофора DsRed. [9] Концевые концы mCherry подобны GFP, что позволяет включать его в системы, где можно использовать GFP, а mRFP1 использовать нельзя. [1]
Использование
[ редактировать ]mCherry используется во флуоресцентной микроскопии в качестве внутриклеточного зонда. [10] Однако когда белок помечается путем слияния с флуоресцентным белком, взаимодействия между ними могут нежелательно нарушать нацеливание или функцию. [11]
mCherry ценится там, где желательна конститутивная экспрессия генов, а другие экспериментальные подходы требуют скоординированного контроля нескольких генов. и других моделях было разработано множество площадок Хотя для использования на E. coli , полезность и функциональность таких методов не всегда применимы к другим видам. Например, для грамотрицательного патогена Legionella pneumophila , переносчика болезни легионеров , система P tac представляет собой единственную хорошо зарекомендовавшую себя систему контроля экспрессии. Чтобы улучшить инструменты, доступные для изучения экспрессии бактериальных генов у L. pneumophila , был разработан mCherry, который обеспечивает конститутивную экспрессию генов из мутагенизированного сайта связывания LacI . mCherry не влияет на другие плазмиды, содержащие интактную систему экспрессии LacI-P tac , и не изменяет рост видов Legionella во время внутриклеточного роста. Плазмидный остов mCherry с широким спектром хозяев позволил конститутивную экспрессию генов у широкого спектра видов грамотрицательных бактерий, что сделало mCherry полезным инструментом для широкого исследовательского сообщества. [12]
Его можно использовать для маркировки бактерий для их визуализации без применения антибиотиков. [13] а также использоваться в качестве длинноволнового акцептора гетеро-FRET (резонансная флуоресцентная передача энергии) и зонда для экспериментов с гомо-FRET. [14] FRET — это тип передачи энергии флуоресценции, при котором нет промежуточного фотона и энергия передается от донора к акцептору.
Другие запросы предложений и mFruits
[ редактировать ]Исходный запрос предложения: DsRed
Запрос предложений первого поколения: mRFP1
Запросы предложений второго поколения: mStrawberry, mOrange, dTomato.
mFruits — это мономерные красные флуоресцентные белки второго поколения (mRFP), которые обладают улучшенной яркостью и фотостабильностью по сравнению с mRFP1 первого поколения. Длины волн их излучения и возбуждения распределены в диапазоне примерно 550–650 и 540–590 нм соответственно. Однако различия в их спектрах можно отнести к нескольким ключевым аминокислотам. Кристаллографический анализ со спектроскопией и атомным разрешением трех представителей, mOrange, mStrawberry и mCherry, показывает, что для установления максимумов возбуждения и излучения действуют разные механизмы. Проходя второй этап окисления, каждый mFruit образует ацилиминовую связь в основной цепи полипептида. По сравнению с предшественником DsRed, прямая ковалентная модификация этой связи (mOrange) и непрямая модификация хромофорного окружения (mStrawberry и mCherry) дают варианты с сильным синим и красным смещением. Синий сдвиг mOrange вызван ковалентной модификацией его белкового остова.
Карта электронной плотности указывает на образование третьего гетероцикла , 2-гидроксидигидрооксазола, при реакции Thr 66 Oγ с основной цепью полипептида, что, в свою очередь, снижает конъюгацию карбонила в положении 65 с остальной частью хромофора. в mStrawberry и mCherry движение заряженного Lys 70 и протонирование Glu 215 изменяют распределение электронной плотности хромофора, вызывая их характерное красное смещение. Предполагается, что [2]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я Шанер, Натан С; Кэмпбелл, Роберт Э; Штайнбах, Пол А; Гипманс, Бен Н.Г.; Палмер, Эми Э; Цянь, Роджер Ю (21 ноября 2004 г.). «Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из красного флуоресцентного белка Discosoma sp.». Природная биотехнология . 22 (12): 1567–1572. дои : 10.1038/nbt1037 . ISSN 1087-0156 . ПМИД 15558047 . S2CID 205272166 .
- ^ Jump up to: а б Шу, Сяокунь; Шанер, Натан С.; Ярбро, Корин А.; Цянь, Роджер Ю.; Ремингтон, С. Джеймс (август 2006 г.). «Новые хромофоры и скрытые заряды контролируют цвет mFruits». Биохимия . 45 (32): 9639–9647. дои : 10.1021/bi060773l . ISSN 0006-2960 . ПМИД 16893165 .
- ^ Хепперт, Дженнифер К.; Дикинсон, Дэниел Дж.; Пани, Ариэль М.; Хиггинс, Кристофер Д.; Стюард, Аннетт; Арингер, Джули; Кун, Джеффри Р.; Гольдштейн, Боб (07 ноября 2016 г.). «Сравнительная оценка флуоресцентных белков для визуализации in vivo в модельной системе животных» . Молекулярная биология клетки . 27 (22): 3385–3394. дои : 10.1091/mbc.e16-01-0063 . ISSN 1059-1524 . ПМК 5221575 . ПМИД 27385332 .
- ^ «Аддген — анализ последовательности» . www.addgene.org . Проверено 11 ноября 2018 г.
- ^ «mCherry - флуоресцентный белок MCherry - Anaplasma Marginale - ген и белок mCherry» . Унипрот . Проверено 11 ноября 2018 г.
- ^ Шу, Х.; Ремингтон, SJ (22 августа 2006 г.). «Кристаллическая структура mCherry» . РЦСБ . дои : 10.2210/pdb2h5q/pdb . Проверено 11 ноября 2018 г.
- ^ Jump up to: а б Мияваки, Ацуши; Щербакова Дарья М; Верхуша, Владислав В. (октябрь 2012 г.). «Красные флуоресцентные белки: образование хромофора и клеточное применение» . Современное мнение в области структурной биологии . 22 (5): 679–688. дои : 10.1016/j.sbi.2012.09.002 . ISSN 0959-440X . ПМЦ 3737244 . ПМИД 23000031 .
- ^ «Интернет-кампус микроскопии ZEISS | Флуоресцентные белки Anthozoa» . zeiss-campus.magnet.fsu.edu . Проверено 15 ноября 2018 г.
- ^ Субач, Федор Владимирович; Верхуша, Владислав В. (11 июля 2012 г.). «Преобразования хромофора в красных флуоресцентных белках» . Химические обзоры . 112 (7): 4308–4327. дои : 10.1021/cr2001965 . ISSN 0009-2665 . ПМК 3394910 . ПМИД 22559232 .
- ^ Субач, Федор В.; Паттерсон, Джордж Х; Мэнли, Сулиана ; Джилетт, Дженнифер М; Липпинкотт-Шварц, Дженнифер; Верхуша, Владислав В (25 января 2009 г.). «Фотоактивируемый mCherry для двухцветной флуоресцентной микроскопии высокого разрешения» . Природные методы . 6 (2): 153–159. дои : 10.1038/nmeth.1298 . ISSN 1548-7091 . ПМК 2901231 . ПМИД 19169259 .
- ^ Шанер, Натан С; Кэмпбелл, Роберт Э; Штайнбах, Пол А; Гипманс, Бен Н.Г.; Палмер, Эми Э; Цянь, Роджер Ю (21 ноября 2004 г.). «Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из красного флуоресцентного белка Discosoma sp.». Природная биотехнология . 22 (12): 1567–1572. дои : 10.1038/nbt1037 . ISSN 1087-0156 . ПМИД 15558047 . S2CID 205272166 .
- ^ Гебхардт, Майкл Дж.; Джейкобсон, Рэйчел К.; Шуман, Ховард А. (3 марта 2017 г.). «Видеть красный цвет; разработка pON.mCherry, конститутивной экспрессионной плазмиды широкого спектра хозяев для грамотрицательных бактерий» . ПЛОС ОДИН . 12 (3): e0173116. Бибкод : 2017PLoSO..1273116G . дои : 10.1371/journal.pone.0173116 . ISSN 1932-6203 . ПМК 5336243 . ПМИД 28257493 .
- ^ Лагендейк, Эллен Л.; Валидов, Шамиль; Ламерс, Герда Э.М.; Де Верт, Сандра; Блумберг, Гвидо В. (4 марта 2010 г.). «Генетические инструменты для мечения грамотрицательных бактерий с помощью mCherry для визуализации in vitro и в естественной среде обитания, исследования биопленок и патогенности» . Письма FEMS по микробиологии . 305 (1): 81–90. дои : 10.1111/j.1574-6968.2010.01916.x . hdl : 1887/3664941 . ISSN 0378-1097 . ПМИД 20180857 .
- ^ Акрап, Нина; Зайдель, Торстен; Барисас, Б. Джордж (июль 2010 г.). «Расстояния Фёрстера для резонансной передачи энергии флуоресценции между mCherry и другими видимыми флуоресцентными белками» . Аналитическая биохимия . 402 (1): 105–106. дои : 10.1016/j.ab.2010.03.026 . ISSN 0003-2697 . ПМЦ 2885848 . ПМИД 20347671 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- mCherry на FPbase, базе данных флуоресцентных белков