Фрагментация (клеточная биология)
 | В этой статье есть несколько проблем. Пожалуйста, помогите улучшить его или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти шаблонные сообщения )
|
Фрагментация описывает процесс разделения на несколько частей или фрагментов. В клеточной биологии фрагментация полезна для клетки как во время клонирования ДНК, так и во время апоптоза. Клонирование ДНК важно для бесполого размножения или создания идентичных молекул ДНК и может выполняться клеткой спонтанно или намеренно лабораторными исследователями. Апоптоз — это запрограммированное разрушение клеток и молекул ДНК внутри них, и это строго регулируемый процесс. Эти два способа использования фрагментации в клеточных процессах описывают нормальные клеточные функции и обычные лабораторные процедуры, выполняемые с клетками. Однако проблемы внутри клетки могут иногда вызывать фрагментацию, которая приводит к нарушениям, таким как фрагментация эритроцитов и фрагментация ДНК сперматозоидов.
Клонирование ДНК
[ редактировать ]Клонирование ДНК может осуществляться клеткой спонтанно в репродуктивных целях. Это форма бесполого размножения, при которой организм распадается на фрагменты, а затем каждый из этих фрагментов развивается в зрелых, полностью выросших особей, которые являются клонами исходного организма (см. Репродуктивная фрагментация ). Клонирование ДНК также может намеренно выполняться лабораторными исследователями. Здесь фрагментация ДНК — это молекулярно-генетический метод, который позволяет исследователям использовать технологию рекомбинантной ДНК для получения большого количества идентичных молекул ДНК. Для завершения клонирования ДНК необходимо получить дискретные небольшие участки ДНК организма, составляющие определенные гены . Только относительно небольшие молекулы ДНК могут быть клонированы в любой доступный вектор . Поэтому длинные молекулы ДНК, составляющие геном организма, должны быть расщеплены на фрагменты, которые можно будет встроить в векторную ДНК. [ 1 ] Два фермента облегчают производство таких молекул рекомбинантной ДНК:
- 1. Ферменты рестрикции
- Ферменты рестрикции — это эндонуклеазы, продуцируемые бактериями, которые обычно распознают небольшие последовательности пар оснований (называемые сайтами рестрикции ), а затем расщепляют обе цепи ДНК в этом сайте. [ 2 ] Сайт рестрикции обычно представляет собой палиндромную последовательность , что означает, что последовательность сайта рестрикции одинакова на каждой цепи ДНК при чтении в направлении от 5’ к 3’.
- Для каждого фермента рестрикции бактерии также производят фермент модификации, так что собственная ДНК бактерии-хозяина защищена от расщепления. Это делается путем модификации ДНК хозяина в каждом потенциальном сайте расщепления или рядом с ним. Фермент модификации добавляет метильную группу к одному или двум основаниям, и присутствие этой метильной группы не позволяет эндонуклеазе рестрикции разрезать ДНК. [ 3 ]
- Ферменты рестрикции — это эндонуклеазы, продуцируемые бактериями, которые обычно распознают небольшие последовательности пар оснований (называемые сайтами рестрикции ), а затем расщепляют обе цепи ДНК в этом сайте. [ 2 ] Сайт рестрикции обычно представляет собой палиндромную последовательность , что означает, что последовательность сайта рестрикции одинакова на каждой цепи ДНК при чтении в направлении от 5’ к 3’.
- Многие ферменты рестрикции разрезают две цепи ДНК в месте узнавания в шахматном порядке, в результате чего образуются фрагменты с одноцепочечным «хвостом», выступающим на обоих концах, который называется липким концом. Ферменты рестрикции также могут делать прямые разрезы в двух цепях ДНК в месте их узнавания, в результате чего концы становятся тупыми. [ 4 ]
- 2. ДНК-лигаза
- Во время нормальной репликации ДНК ДНК-лигаза катализирует сквозное соединение (связывание) коротких фрагментов ДНК, называемых фрагментами Оказаки . В целях клонирования ДНК используется очищенная ДНК-лигаза для ковалентного соединения концов рестрикционного фрагмента и векторной ДНК, которые имеют комплементарные концы. Они ковалентно связаны между собой посредством стандартных 3'-5'- фосфодиэфирных связей ДНК. [ 5 ]
- ДНК-лигаза может сшивать комплементарные липкие и тупые концы , но лигирование тупых концов неэффективно и требует более высокой концентрации как ДНК, так и ДНК-лигазы, чем лигирование липких концов. [ 6 ] По этой причине большинство ферментов рестрикции, используемых при клонировании ДНК, разрезают цепи ДНК в шахматном порядке, образуя липкие концы.
- Во время нормальной репликации ДНК ДНК-лигаза катализирует сквозное соединение (связывание) коротких фрагментов ДНК, называемых фрагментами Оказаки . В целях клонирования ДНК используется очищенная ДНК-лигаза для ковалентного соединения концов рестрикционного фрагмента и векторной ДНК, которые имеют комплементарные концы. Они ковалентно связаны между собой посредством стандартных 3'-5'- фосфодиэфирных связей ДНК. [ 5 ]
Ключом к клонированию фрагмента ДНК является соединение его с векторной молекулой ДНК, которая может реплицироваться внутри клетки-хозяина. После того, как одна молекула рекомбинантной ДНК (состоящая из вектора и вставленного фрагмента ДНК) введена в клетку-хозяина, вставленная ДНК может реплицироваться вместе с вектором, создавая большое количество идентичных молекул ДНК. [ 7 ] Основную схему этого можно резюмировать следующим образом:
- Вектор + фрагмент ДНК
- ↓
- Рекомбинантная ДНК
- ↓
- Репликация рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине
- ↓
- Выделение, секвенирование и манипуляции с очищенным фрагментом ДНК
- Вектор + фрагмент ДНК
Существует множество экспериментальных вариаций этой схемы, но эти этапы необходимы для клонирования ДНК в лаборатории. [ 8 ]
Апоптоз
[ редактировать ]
Апоптоз означает гибель клеток в результате специфической формы запрограммированной гибели клеток , характеризующейся четко определенной последовательностью морфологических изменений. [ 10 ] Сморщивание клеток и ядер, конденсация и фрагментация хроматина, образование апоптотических телец и фагоцитоз соседними клетками характеризуют основные морфологические изменения в процессе апоптоза. [ 11 ] Обширные морфологические и биохимические изменения во время апоптоза гарантируют, что умирающие клетки оказывают минимальное воздействие на соседние клетки и/или ткани.
Гены, участвующие в контроле гибели клеток, кодируют белки с тремя различными функциями: [ 12 ]
- Белки-киллеры необходимы клетке для начала процесса апоптоза.
- Белки «разрушения» выполняют такие функции, как переваривание ДНК в умирающей клетке.
- Белки «поглощения» необходимы для фагоцитоза умирающей клетки другой клеткой.
Расщепление хромосомной ДНК на более мелкие фрагменты является неотъемлемой частью и биохимическим признаком апоптоза. Апоптоз включает активацию эндонуклеаз с последующим расщеплением ДНК хроматина на фрагменты из 180 пар оснований или кратные 180 парам оснований (например, 360, 540). Этот образец фрагментации можно использовать для обнаружения апоптоза в таких тестах, как анализ цепочки ДНК с гель-электрофорезом , анализ TUNEL или анализ Николетти . [ 13 ] Апоптозная фрагментация ДНК зависит от фермента, называемого каспазо-активируемой ДНКазой (CAD) . [ 14 ] CAD обычно ингибируется другим белком в клетке, называемым ингибитором ДНКазы, активируемой каспазой (ICAD) . [ 15 ] Чтобы начать апоптоз, фермент каспаза 3 расщепляет ICAD, в результате чего CAD активируется. Затем CAD расщепляет ДНК между нуклеосомами , которые встречаются в хроматине с интервалом в 180 пар оснований. Участки между нуклеосомами — единственные части ДНК, которые подвергаются воздействию ИБС и доступны для них. [ 16 ]
Неровности
[ редактировать ]Фрагментация ДНК может происходить при определенных условиях в нескольких различных типах клеток. Это может привести к проблемам для клетки или к тому, что клетка получит сигнал о апоптозе. Ниже приведены несколько примеров нерегулярной фрагментации, которая может возникнуть в клетках.
- 1. Фрагментация эритроцитов
- Фрагментированный эритроцит известен как шистоцит и обычно является результатом внутриклеточного механического повреждения эритроцита. [ 17 ] Можно наблюдать большое разнообразие шистоцитов. Шистоциты обычно встречаются в относительно небольшом количестве и связаны с состояниями, при которых обычно гладкая эндотелиальная выстилка или эндотелий становится шероховатой или неправильной формы и/или просвет сосуда пересекается нитями фибрина . [ 18 ] Шистоциты обычно наблюдаются у пациентов с гемолитической анемией . Они также являются признаком развитой железодефицитной анемии , но в этом случае наблюдаемая фрагментация, скорее всего, является результатом хрупкости клеток, образующихся в этих условиях.
- 2. Фрагментация ДНК сперматозоидов.
- У среднего мужчины менее 4% сперматозоидов содержат фрагментированную ДНК. Однако такое поведение, как курение, может значительно увеличить фрагментацию ДНК в сперматозоидах. Существует отрицательная корреляция между процентом фрагментации ДНК и подвижностью, морфологией и концентрацией сперматозоидов. Существует также отрицательная связь между процентом сперматозоидов, содержащих фрагментированную ДНК, и скоростью оплодотворения и скоростью дробления эмбриона. [ 19 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретшер, Хидде Пло, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярно-клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: WH Freeman and, 2013. Печать.
- ^ Рао, Десиразу Н., Свати Саха и Винита Кришнамурти. «АТФ-зависимые ферменты рестрикции». Прогресс в исследованиях нуклеиновых кислот и молекулярной биологии 64 (2000): 1-63. Распечатать.
- ^ Рао, Десиразу Н., Свати Саха и Винита Кришнамурти. «АТФ-зависимые ферменты рестрикции». Прогресс в исследованиях нуклеиновых кислот и молекулярной биологии 64 (2000): 1-63. Распечатать.
- ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретшер, Хидде Пло, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярно-клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: WH Freeman and, 2013. Печать.
- ^ Томкинсон, Алан Э. и Закари Б. Макки. «Структура и функция лигаз ДНК млекопитающих». Исследования мутаций/Репарация ДНК 407.1 (1998): 1-9. Распечатать.
- ^ Хунг, Миен-Чи и Питер К. Венсинк. «Различные липкие концы ДНК, генерируемые рестрикционными ферментами, можно соединить in vitro». Nucleic Acids Research 12.4 (1984): 1863-874. Распечатать.
- ^ "Глава 20." Авонабио/. Нп и Интернет. 20 ноября 2012 г. < http://avonapbio.pbworks.com/w/page/9429274/Ch%2020 >.
- ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретшер, Хидде Пло, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярно-клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: WH Freeman and, 2013. Печать.
- ^ Смит, Аарон; Паркс, Майкл А.Ф.; Аткин-Смит, Джорджия К; Тиксейра, Рошель; Пун, Иван Х. (2017). «Разборка клетки при апоптозе» . Викижурнал медицины . 4 (1). дои : 10.15347/wjm/2017.008 .
- ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретшер, Хидде Пло, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярно-клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: WH Freeman and, 2013. Печать.
- ^ Хуа, Ксан Дж. и Мин Сюй. «Фрагментация ДНК при апоптозе». Cell Research 10 (2000): 205-11. Природа. 17 июля 2000 г. Интернет. 19 ноября 2012 г.
- ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретшер, Хидде Пло, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярно-клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: WH Freeman and, 2013. Печать.
- ^ Бортнер, Карл Д., Никлас Б.Е. Ольденбург и Джон А. Цидловски. «Роль фрагментации ДНК в апоптозе». Тенденции в клеточной биологии 5.1 (1995): 21-26. Распечатать.
- ^ Джог, Нилакши Р., Лоренца Фрисони, Цинь Ши, Марк Монестье, Сайри Эрнандес, Джо Крафт, Элин Т. Лунинг Прак и Роберто Кариккио. «ДНКаза, активируемая каспазой, необходима для поддержания толерантности к ядерным аутоантигенам волчанки». Артрит и ревматизм 64.4 (2012): 1247-256. Распечатать.
- ^ Кучер, Даниэль, Альфред Пингуд, Альберт Елч и Грегор Мейсс. «Идентификация пептидов, полученных из ICAD, способных ингибировать ДНКазу, активируемую каспазой». Журнал ФЕБС 279.16 (2012): 2917-928. Распечатать.
- ^ Бортнер, Карл Д., Никлас Б.Е. Ольденбург и Джон А. Цидловски. «Роль фрагментации ДНК в апоптозе». Тенденции в клеточной биологии 5.1 (1995): 21-26. Распечатать.
- ^ Бессман, JD. «Фрагментация эритроцитов. Улучшенное обнаружение и идентификация причин». Американский журнал клинической патологии 90.3 (1988): 268-73. Распечатать.
- ^ «Шистоциты». Шистоциты. Нп и Интернет. 20 ноября 2012 г. < http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/rbcmorph/schisto.htm >.
- ^ Сан, Дж. Г., А. Юрисикова и РФ Каспер. «Обнаружение фрагментации дезоксирибонуклеиновой кислоты в сперме человека: корреляция с оплодотворением in vitro». Биология репродукции 56.3 (1997): 602-07. Распечатать.