Хроматография гидрофильного взаимодействия
 | Судя по всему, основной автор этой статьи тесно связан с ее предметом. ( Октябрь 2015 г. ) |
Хроматография гидрофильного взаимодействия (или жидкостная хроматография гидрофильного взаимодействия , HILIC ) [1] представляет собой вариант жидкостной хроматографии с нормальной фазой , который частично перекрывается с другими хроматографическими применениями, такими как ионная хроматография и жидкостная хроматография с обращенной фазой . В HILIC используются гидрофильные неподвижные фазы с элюентами обращенно-фазового типа . Название было предложено Эндрю Альпертом в его статье 1990 года на эту тему. [2] Он описал хроматографический механизм этого процесса как жидкостно-жидкостную распределительную хроматографию , при которой аналиты элюируются в порядке возрастания полярности, и этот вывод подтверждается обзором и переоценкой опубликованных данных. [3]
Поверхность
[ редактировать ]любую полярную Для разделения HILIC можно использовать хроматографическую поверхность. Даже неполярные связанные диоксиды кремния использовались с чрезвычайно высоким содержанием органических растворителей благодаря открытым участкам диоксида кремния между связанными лигандами на носителе, что может влиять на взаимодействие. [4] За этим исключением фазы HILIC можно разделить на пять категорий нейтральных полярных или ионных поверхностей: [5]
- простые несвязанные фазы диоксида кремния, связанные силанолом или диолом
- амино- или анионно- связанные фазы [6] [7]
- амидные связанные фазы [8]
- катионно- связанные фазы
- цвиттерионные связанные фазы [9] [10]
Подвижная фаза
[ редактировать ]Типичная подвижная фаза для хроматографии HILIC включает ацетонитрил («MeCN», также обозначаемый как «ACN») с небольшим количеством воды. Однако любой апротонный растворитель, смешивающийся с водой (например, ТГФ или диоксан можно использовать ). Также можно использовать спирты, однако их концентрация должна быть выше для достижения такой же степени удерживания аналита по сравнению с комбинацией апротонный растворитель-вода. См. также Водная нормально-фазовая хроматография .
Принято считать, что в HILIC подвижная фаза образует богатый водой слой на поверхности полярной неподвижной фазы с дефицитом воды по сравнению с подвижной фазой , создавая систему экстракции жидкость/жидкость. Аналит распределяется между этими двумя слоями. Однако HILIC — это больше, чем просто разделение, и включает в себя донорные взаимодействия водорода между нейтральными полярными частицами, а также слабые электростатические механизмы в условиях высокого содержания органических растворителей, используемых для удерживания. Это отличает HILIC как механизм, отличный от ионообменной хроматографии . Более полярные соединения будут иметь более сильное взаимодействие с неподвижным водным слоем, чем менее полярные соединения. Таким образом, происходит разделение на основе полярности соединения и степени сольватации.
Добавки
[ редактировать ]Ионные добавки, такие как ацетат аммония и формиат аммония, обычно используются для контроля подвижной фазы pH и ионной силы. В HILIC они также могут способствовать полярности аналита, что приводит к различным изменениям удерживания. Для чрезвычайно полярных аналитов (например, аминогликозидных антибиотиков ( гентамицина ) или аденозинтрифосфата ) требуются более высокие концентрации буфера (около 100 мМ), чтобы гарантировать, что аналит будет находиться в одной ионной форме. В противном случае будут наблюдаться асимметричная форма пика, хроматографическое размытие и/или плохое восстановление из стационарной фазы. Для разделения нейтральных полярных аналитов (например, углеводов) буфер не требуется.
Другие соли, такие как 100–300 мМ перхлорат натрия, растворимые в смесях растворителей с высоким содержанием органических веществ (около 70–90% ацетонитрила ), можно использовать для увеличения полярности подвижной фазы и влияния на элюирование. Эти соли нелетучие, поэтому этот метод менее полезен, если в качестве детектора используется масс-спектрометр. Обычно градиента (к увеличению количества воды) достаточно, чтобы способствовать элюированию.
Все ионы в той или иной степени переходят в неподвижную фазу, поэтому для обеспечения воспроизводимой стационарной фазы требуется периодическая «промывка» водой.
Приложения
[ редактировать ]Режим разделения HILIC широко используется для разделения некоторых биомолекул , органических и некоторых неорганических молекул. [11] из-за разницы в полярности. Его полезность возросла благодаря упрощенной подготовке биологических образцов при анализе метаболитов, поскольку метаболический процесс обычно приводит к добавлению полярных групп для усиления выведения из клеточной ткани. Этот метод разделения также особенно подходит для гликозилирования. анализа [12] и обеспечение качества гликопротеинов и гликоформ в биологических медицинских препаратах . [13] Для обнаружения полярных соединений с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением в качестве хроматографического детектора HILIC может предложить десятикратное увеличение чувствительности по сравнению с обращенно-фазовой хроматографией. [11] потому что органический растворитель гораздо более летуч.
Выбор pH
[ редактировать ]Поскольку химический состав поверхности является слабоионным, выбор pH может повлиять на ионную природу химического состава колонки. При правильной настройке pH можно установить так, чтобы снизить селективность по отношению к функциональным группам с тем же зарядом, что и колонка, или повысить ее для противоположно заряженных функциональных групп. Аналогичным образом выбор pH влияет на полярность растворенных веществ. Однако для колонок с химическим составом поверхности, которые являются сильно ионными и, следовательно, устойчивыми к значениям pH в среднем диапазоне шкалы pH (pH 3,5–8,5), такое разделение будет отражать только полярность аналитов и, таким образом, может быть легче понять при разработке методов.
ЭРЛИК
[ редактировать ]В 2008 году Альперт ввёл термин ERLIC. [14] (хроматография гидрофильного взаимодействия с электростатическим отталкиванием) для разделения HILIC, когда химия поверхности ионной колонки используется для отталкивания общей ионной полярной группы на аналите или в наборе аналитов, чтобы облегчить разделение оставшимися полярными группами. Электростатические эффекты имеют на порядок более сильный химический потенциал , чем нейтральные полярные эффекты. Это позволяет минимизировать влияние общей ионной группы внутри набора молекул аналита; или уменьшить степень удерживания этих более полярных функциональных групп, даже позволяя в некоторых ситуациях изократическое разделение вместо градиента. В его последующей публикации дополнительно описаны эффекты ориентации. [15] которую другие также называют нормальной фазой ионной пары. [16] или e-HILIC, отражающий механизмы удерживания, чувствительные к определенной ионной части аналита, притягивающей или отталкивающей. Разделение ERLIC (eHILIC) не обязательно должно быть изократическим, но конечным эффектом является уменьшение притяжения особенно сильной полярной группы, которая затем требует менее сильных условий элюирования, и усиление взаимодействия оставшейся полярной группы (противоположно заряженной ионной или неионной группы). -ионные) функциональные группы аналита(ов). На основе колонки ERLIC, изобретенной Эндрю Альпертом, была разработана новая методология пептидного картирования с уникальными свойствами разделения дезамидирования и изомеризации аспарагина. Эти уникальные свойства будут очень полезны для будущего многоатрибутного мониторинга на основе масс-спектрометрии при контроле качества биологических препаратов. [17]
Катионный eHILIC
[ редактировать ]Например, можно использовать катионообменную (отрицательно заряженную) химию поверхности для разделения ERLIC, чтобы уменьшить влияние на удержание анионных (отрицательно заряженных) групп (фосфатов нуклеотидов или смесей фосфонильных антибиотиков; или групп сиаловой кислоты модифицированных углеводов). чтобы теперь обеспечить разделение, основанное больше на основных и/или нейтральных функциональных группах этих молекул. Изменение полярности слабоионной группы (например, карбоксильной) на поверхности легко достигается путем регулирования pH так, чтобы он находился в пределах двух единиц pH от pKa этой группы. Для сильно ионных функциональных групп поверхности (т.е. сульфатов или фосфатов) вместо этого можно использовать меньшее количество буфера, чтобы остаточный заряд не был полностью спаренным ионами. Примером этого может быть использование подвижной фазы с концентрацией 12,5 мМ (вместо рекомендуемого буфера >20 мМ) с pH 9,2 на бетаин - цвиттерионной поверхности сульфонатной полимерной для разделения смесей фосфонильных антибиотиков (каждая из которых содержит фосфатную группу). Это усиливает влияние колонки функциональные группы сульфоновой кислоты в химии ее поверхности над слегка уменьшенным (по pH) четвертичным амином. Соразмерно этому, эти аналиты будут демонстрировать пониженное удерживание на колонке, элюируя раньше и в более высоких количествах органического растворителя, чем если бы использовалась нейтральная полярная поверхность HILIC. Это также увеличивает чувствительность их обнаружения с помощью масс-спектрометрии отрицательных ионов.
Анионный eHILIC
[ редактировать ]По аналогии с вышеизложенным можно использовать химию поверхности анионообменной (положительно заряженной) колонки, чтобы уменьшить влияние на удержание катионных (положительно заряженных) функциональных групп для набора аналитов, например, при селективном выделении фосфорилированных пептидов или молекул сульфатированных полисахаридов. . Использование pH от 1 до 2 единиц pH уменьшит полярность двух из трех ионизируемых атомов кислорода фосфатной группы и, таким образом, обеспечит легкую десорбцию с (противоположно заряженных) химических веществ поверхности. Это также уменьшит влияние отрицательно заряженных карбоксилов в аналитах, поскольку они будут протонироваться при таком низком значении pH и, таким образом, вносить меньшую общую полярность в молекулу. Любые общие положительно заряженные аминогруппы будут отталкиваться от химического состава поверхности колонки, и, таким образом, эти условия повышают роль полярности фосфата (а также других нейтральных полярных групп) в разделении.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Яндера, Павел (2011). «Неподвижные и подвижные фазы в хроматографии гидрофильного взаимодействия: обзор» . Аналитика Химика Акта . 692 (1): 1–25. Бибкод : 2011AcAC..692....1J . дои : 10.1016/j.aca.2011.02.047 . ISSN 0003-2670 . ПМИД 21501708 .
- ^ Альперт, Эндрю Дж. (1990). «Хроматография гидрофильного взаимодействия для разделения пептидов, нуклеиновых кислот и других полярных соединений» . Журнал хроматографии . 499 : 177–196. дои : 10.1016/S0021-9673(00)96972-3 . ПМИД 2324207 .
- ^ Петрус Хемстрем и Кнут Иргум (2006). «Обзор: хроматография гидрофильного взаимодействия». J. Сентябрь Sci . 29 (12): 1784–1821. дои : 10.1002/jssc.200600199 . ПМИД 16970185 .
- ^ Бидж, Клаас Э.; Хорват, Чаба; Меландер, Уэйн Р.; Нахум, Ави (9 января 1981 г.). «Поверхностные силанолы в углеводородных неподвижных фазах, связанных с кремнеземом: II. Неравномерное удерживание и эффект силанольной маскировки» . Журнал хроматографии А. 203 : 65–84. дои : 10.1016/S0021-9673(00)80282-4 . ISSN 0021-9673 .
- ^ Редон, Лидия; Субиратс, Ксавье; Росес, Марти (25 октября 2021 г.). «Объем и состав полуадсорбированных неподвижных фаз в жидкостной хроматографии с гидрофильным взаимодействием. Сравнение адсорбции воды в обычных неподвижных фазах и элюентах» . Журнал хроматографии А. 1656 : 462543. doi : 10.1016/j.chroma.2021.462543 . hdl : 2445/183349 . ISSN 0021-9673 . ПМИД 34571282 .
- ^ Шоу, ЧП; Уилсон, CW (1982). «Отделение сорбита и манногептулозы от фруктозы, глюкозы и сахарозы на колонках обращенно-фазовой и модифицированной амином ВЭЖХ» . Журнал хроматографической науки . 20 (5): 209–212. дои : 10.1093/chromsci/20.5.209 . ISSN 0021-9665 .
- ^ Баяд, Сунил У.; Лу, Вэньюнь; Кимбалл, Элизабет Х.; Юань, Цзе; Петерсон, Селеста; Рабиновиц, Джошуа Д. (август 2006 г.). «Разделение и количественное определение водорастворимых клеточных метаболитов методом гидрофильной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии» . Журнал хроматографии А. 1125 (1): 76–88. дои : 10.1016/j.chroma.2006.05.019 . ISSN 0021-9673 . ПМИД 16759663 .
- ^ Ко, Донг-Ван; Пак, Джэ Ун; Лим, Чон Хун; Да, Мён Джай; Банг, Дэ Ён (2018). «Быстрый метод одновременного количественного определения 13 сахаров и сахарных спиртов в пищевых продуктах с помощью UPLC-ELSD» . Пищевая химия . 240 : 694–700. doi : 10.1016/j.foodchem.2017.07.142 . ISSN 0308-8146 . ПМИД 28946331 .
- ^ Богуслав Бушевский и Сильвия Нога (2012). «Жидкостная хроматография гидрофильного взаимодействия (HILIC) — мощный метод разделения» . Анальный. Биоанал. Хим . 402 (1): 231–247. дои : 10.1007/s00216-011-5308-5 . ПМЦ 3249561 . ПМИД 21879300 .
- ^ Лардо, Онорина; Гийярме, Дэви; Д'Атри, Валентина (08 февраля 2023 г.). «Комплексная оценка стационарных фаз цвиттер-ионной гидрофильной жидкостной хроматографии для характеристики олигонуклеотидов» . Журнал хроматографии А. 1690 : 463785. doi : 10.1016/j.chroma.2023.463785 . ISSN 0021-9673 . ПМИД 36641941 .
- ^ Jump up to: а б Эрик С. Грумбах; и др. (октябрь 2004 г.). «Хроматография гидрофильного взаимодействия с использованием колонок с силикагелем для удержания полярных аналитов и повышения чувствительности ESI-MS» . Журнал LCGC . Архивировано из оригинала 6 августа 2007 г. Проверено 14 июля 2008 г.
- ^ Ан, Джуми; Боунс, Джонатан; Ю, Ин Цин; Радд, Полин М.; Гилар, Мартин (01 февраля 2010 г.). «Разделение меченных 2-аминобензамидом гликанов с использованием колонок для хроматографии гидрофильного взаимодействия, заполненных сорбентом 1,7 мкм». Журнал хроматографии Б. 878 (3–4): 403–408. дои : 10.1016/j.jchromb.2009.12.013 . ПМИД 20036624 .
- ^ Анализ гликозилирования с помощью хроматографии гидрофильного взаимодействия (HILIC) - картирование N-глико ZP-домена мышиного TGFR-3 (примечания по применению TOSOH Biosciences). Проверено 23 мая 2013 г.
- ^ Альперт, Эндрю Дж. (январь 2008 г.). «Электростатическая хроматография гидрофильного взаимодействия для изократического разделения заряженных растворенных веществ и селективного выделения фосфопептидов» . Анальный. Хим . 80 (1): 62–76. дои : 10.1021/ac070997p . ПМИД 18027909 .
- ^ Альперт, Эндрю Дж.; и др. (июнь 2010 г.). «Ориентация пептидов влияет на селективность в ионообменной хроматографии» . Анальный. Хим . 82 (12): 5253–5259. дои : 10.1021/ac100651k . ПМЦ 2884984 . ПМИД 20481592 .
- ^ Дин, В.; и др. (сентябрь 2009 г.). «Идентификация и количественная оценка гликопротеинов с использованием ионного спаривания в нормальной фазе ЖХ и МС» . Молекулярная и клеточная протеомика . 8 (9): 2170–2185. дои : 10.1074/mcp.M900088-MCP200 . ПМК 2742440 . ПМИД 19525481 .
- ^ Чжэнь Дж., Ким Дж., Чжоу Ю., Гайдамаускас Э., Субраманиан С. и Фэн П. (октябрь 2018 г.). Характеристика антител с использованием нового пептидного картирования на основе ERLIC-MS/MS. В MAbs (Том 10, №7, стр. 951-959). Тейлор и Фрэнсис.