Флоу-ФИШ
Flow-FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) представляет собой цитогенетический метод количественного определения количества копий РНК или конкретных повторяющихся элементов в геномной ДНК популяций целых клеток посредством сочетания проточной цитометрии с протоколами цитогенетического флуоресцентного гибридизационного окрашивания in situ. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]
Flow-FISH чаще всего используется для количественной оценки длины теломер , которые представляют собой участки повторяющейся ДНК (гексамерные повторы TTAGGG) на дистальных концах хромосом. [ 4 ] в человеческих лейкоцитах , а полуавтоматический метод для этого был опубликован в журнале Nature Protocols . [ 1 ] теломер Длина в лейкоцитах является предметом интереса, поскольку длина теломер в этих типах клеток (а также в других соматических тканях) постепенно уменьшается в течение жизни человека, что приводит к старению клеток , апоптозу , [ 5 ] или трансформация . [ 6 ] Было показано, что это снижение является суррогатным маркером сопутствующего снижения длины теломер пула гемопоэтических стволовых клеток , при этом линия гранулоцитов дает лучший показатель, предположительно из-за отсутствия подтипа долгоживущей памяти и сравнительно быстрого оборота клеток. эти клетки. [ 7 ]
Flow-FISH также подходит для одновременного обнаружения РНК и белка . [ 2 ] Это позволяет идентифицировать клетки, которые не только экспрессируют ген , но и транслируют его в белок . Этот тип Flow-FISH использовался для изучения латентной инфекции таких вирусов, как ВИЧ -1 и EBV . [ 8 ] [ 9 ] но также отслеживать генов экспрессию и трансляцию в отдельных клетках в белок. [ 2 ] [ 10 ]
Q-FISH для потока-FISH
[ редактировать ]Flow-FISH был впервые опубликован в 1998 году Руфером и др. [ 11 ] как модификация другого метода анализа длины теломер, Q-FISH , в котором используются пептидных нуклеиновых кислот. зонды [ 12 ] 3'-CCCTAACCCTAACCCTAA-5' последовательность, меченная флуорофором для флуоресцина, окрашивания теломерных повторов на подготовленных метафазных участках клеток, обработанных колцемидом , гипотоническим шоком и фиксации на предметных стеклах посредством метанолом / уксусной кислотой обработки [ 13 ] Изображения полученных флуоресцентных пятен можно затем проанализировать с помощью специализированной компьютерной программы, чтобы получить количественные значения флуоресценции, которые затем можно использовать для оценки фактической длины теломер. Флуоресценция, возникающая при окрашивании зонда, считается количественной, поскольку ПНК преимущественно связывается с ДНК при низких концентрациях ионных солей и в присутствии формамида , поэтому дуплекс ДНК может не реформироваться после того, как он был расплавлен и отожжен с зондом ПНА , что позволяет зонду насытить свою целевую повторную последовательность (поскольку она не вытесняется из целевой ДНК конкурирующей антисмысловой ДНК на комплементарной цепи), что дает надежное и поддающееся количественной оценке значение частоты мишени зонда ПНА в данном хромосомном участке после отмывания несвязанный зонд. [ 13 ]
Инновации
[ редактировать ]В отличие от Q-FISH, Flow-FISH использует количественные свойства удержания теломер-специфичных зондов PNA для количественной оценки средней флуоресценции в популяции клеток с помощью проточного цитометра вместо флуоресцентного микроскопа. [ 14 ] Основное преимущество этого метода заключается в том, что он исключает время, необходимое в Q-FISH для подготовки метафазных спредов интересующих клеток, и что проточный цитометрический анализ также выполняется значительно быстрее, чем методы, необходимые для получения и анализа подготовленных слайдов Q-FISH. Таким образом, Flow-FISH позволяет проводить более высокопроизводительный анализ длины теломер в лейкоцитах крови, которые являются легкодоступной формой образцов тканей человека. Самые последние версии метода FISH-FISH включают внутреннюю контрольную популяцию тимоцитов коров с известной длиной теломер, обнаруженной с помощью TRF или анализа фрагментов рестрикции теломер, с которой можно сравнить флуоресценцию данного неизвестного образца. Поскольку тимоциты коровы поглощают краситель LDS751 в меньшей степени, чем их человеческие аналоги, их можно надежно дифференцировать с помощью построения графиков и выбора желаемых популяций. Другие типы клеток, которые в прошлом не зарекомендовали себя как хорошие кандидаты для FISH-потока, могут быть проанализированы путем выделения ядер и непосредственного применения метода к ним. [ 15 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Баерлохер ГМ, Вулто И, де Йонг Г, Лансдорп ПМ. Проточная цитометрия и FISH для измерения средней длины теломер (проточная FISH). Нат Проток 2006; 1:2365–2376.
- ^ Jump up to: а б с Поричис, Филиппос; Харт, Меган Г.; Грисбек, Морган; Эверетт, Холли Л.; Хасан, Мушка; Бакстер, Эми Э.; Линдквист, Мадлен; Миллер, Сара М.; Согоян, Дэмиен З.; Кавана, Дэниел Г.; Рейнольдс, Сьюзен (декабрь 2014 г.). «Высокопроизводительное обнаружение микроРНК и ген-специфической мРНК на уровне отдельных клеток методом проточной цитометрии» . Природные коммуникации . 5 (1): 5641. Бибкод : 2014NatCo...5.5641P . дои : 10.1038/ncomms6641 . ISSN 2041-1723 . ПМК 4256720 . ПМИД 25472703 .
- ^ Бакстер, Эми Э.; Ниссль, Юлия; Фромантен, Реми; Ричард, Джонатан; Поричис, Филиппос; Массанелла, Марта; Брассар, Натали; Альсахафи, Нирмин; Рути, Жан-Пьер; Финци, Андрес; Чомон, Николас (октябрь 2017 г.). «Многопараметрическая характеристика редких ВИЧ-инфицированных клеток с использованием метода FISH с потоком РНК» . Протоколы природы . 12 (10): 2029–2049. дои : 10.1038/nprot.2017.079 . ISSN 1750-2799 . ПМК 5697908 . ПМИД 28880280 .
- ^ Мойзис, Р.К. и др. Высококонсервативная повторяющаяся последовательность ДНК (TTAGGG)n присутствует в теломерах хромосом человека. Учеб. Натл. акад. наук. США 85, 6622–6626 (1988).
- ^ Харли, CB, Футчер, AB и Грейдер, CW Теломеры укорачиваются во время старения фибробластов человека. Природа 345, 458–460 (1990).
- ^ Чанг, С., Ху, К.М., Нейлор, М.Л., Мазер, Р.С. и ДеПиньо, Р.А. Кризис на основе теломер: функциональные различия между активацией теломеразы и АЛТ в прогрессировании опухоли. Генс Дев. 17, 88–100 (2003).
- ^ Руфер Н., Бруммендорф Т.Х., Колвраа С. и др. Измерения флуоресценции теломер в гранулоцитах и субпопуляциях Т-лимфоцитов указывают на высокий оборот гемопоэтических стволовых клеток и Т-клеток памяти в раннем детстве. J Exp Med 1999; 190:157–167.
- ^ Грау-Экспозито, Джудит; Луке-Баллестерос, Лаура; Наварро, Хорди; Карран, Адриан; Бургос, Хоакин; Рибера, Эстебан; Торрелла, Ариадна; Планас, Вивиана; Бадия, Роза; Мартин-Кастильо, Марио; Фернандес-Сохо, Хесус (19 августа 2019 г.). Суонстром, Рональд (ред.). «Агенты, обращающие латентный период, по-разному влияют на латентный резервуар, присутствующий в различных субпопуляциях CD4+ T» . ПЛОС Патогены . 15 (8): e1007991. дои : 10.1371/journal.ppat.1007991 . ISSN 1553-7374 . ПМК 6715238 . ПМИД 31425551 .
- ^ Фурнье, Бенджамин; Бутбул, Дэвид; Брюно, Джули; Миот, Шарлин; Буланже, Сесиль; Мальфеттс, Мэрион; Пелье, Изабель; Дюноге, Бертран; Терьер, Бенджамин; Суарес, Фелипе; Бланш, Стефан (2 ноября 2020 г.). «Быстрая идентификация и характеристика инфицированных клеток в крови при хронической активной инфекции вируса Эпштейна-Барр» . Журнал экспериментальной медицины . 217 (11): e20192262. дои : 10.1084/jem.20192262 . ISSN 0022-1007 . ПМЦ 7596820 . ПМИД 32812031 .
- ^ Николе, Бенуа П.; Гислен, Орели; Уолкерс, Моника К. (15 января 2017 г.). «Комбинированное измерение цитокиновой мРНК и белка в отдельных клетках идентифицирует Т-клетки с постоянной эффекторной функцией» . Журнал иммунологии . 198 (2): 962–970. doi : 10.4049/jimmunol.1601531 . ISSN 0022-1767 . ПМИД 27927969 .
- ^ Руфер Н., Драговска В., Торнбери Г., Роснек Э. и Лансдорп П.М. Динамика длины теломер в субпопуляциях лимфоцитов человека, измеренная с помощью проточной цитометрии. Природные биотехнологии. 16, 743–747 (1998).
- ^ Эгхольм, М. и др. ПНК гибридизуется с комплементарными олигонуклеотидами, подчиняющимися правилам образования водородных связей Уотсона-Крика. Природа 365, 566–568 (1993).
- ^ Jump up to: а б Лансдорп, П.М. и др. Гетерогенность длины теломер хромосом человека. Хм. Мол. Жене. 5, 685–691 (1996).
- ^ Баерлохер, Г.М. и Лансдорп, П.М. Измерение длины теломер в подмножествах лейкоцитов с помощью автоматизированного многоцветного потока FISH. Цитометрия А 55, 1–6 (2003).
- ^ Визер, М. и др. Ядерный поток FISH: изоляция ядер клеток улучшает определение длины теломер. Эксп. Геронтол. 41, 230–235 (2006).