Секвенирование ДНК наношариками
Секвенирование ДНК наношариками — это высокопроизводительная технология секвенирования, которая используется для определения всей геномной последовательности организма. Этот метод использует репликацию по катящемуся кругу для амплификации небольших фрагментов геномной ДНК в наношарики ДНК . Флуоресцентные нуклеотиды связываются с комплементарными нуклеотидами, а затем полимеризуются с образованием якорных последовательностей, связанных с известными последовательностями на матрице ДНК. Порядок оснований определяется флуоресценцией связанных нуклеотидов. [2] Этот метод секвенирования ДНК позволяет секвенировать большое количество наношариков ДНК за один цикл при меньших затратах на реагенты по сравнению с другими платформами секвенирования следующего поколения . [3] Однако ограничением этого метода является то, что он генерирует только короткие последовательности ДНК, что затрудняет сопоставление его прочтений с эталонным геномом . [2] После приобретения компании Complete Genomics Пекинский институт геномики (BGI) усовершенствовал секвенирование ДНК наношариками для секвенирования образцов нуклеотидов на своей собственной платформе. [4] [5]
Процедура
[ редактировать ]Секвенирование ДНК наношариками включает в себя выделение ДНК , подлежащей секвенированию, ее разрезание на небольшие фрагменты размером 100–350 пар оснований (п.н.), лигирование адаптерных последовательностей с фрагментами и циркуляризацию фрагментов. Кольцевые фрагменты копируются путем репликации по катящемуся кругу, в результате чего образуется множество одноцепочечных копий каждого фрагмента. Копии ДНК соединяются голова к хвосту в длинную цепь и уплотняются в наношар ДНК. Затем наношарики адсорбируются на проточной ячейке секвенирования. Цвет флуоресценции в каждой опрашиваемой позиции регистрируется камерой высокого разрешения. Биоинформатика используется для анализа данных флуоресценции и определения оснований, а также для картирования или количественной оценки одно- или парных считываний размером 50, 100 или 150 пар оснований. [6] [2]
Выделение ДНК, фрагментация и захват размера
[ редактировать ]Клетки лизируют и выделяют из клеточного лизата ДНК . ДНК с высокой молекулярной массой, часто длиной в несколько пар мегаоснований, фрагментируется физическими или ферментативными методами, чтобы разорвать двойные цепи ДНК через случайные интервалы. Биоинформатическое картирование считываний секвенирования наиболее эффективно, когда образец ДНК содержит узкий диапазон длин. [7] Для секвенирования малых РНК выбор идеальной длины фрагментов для секвенирования осуществляется с помощью гель-электрофореза ; [8] для секвенирования более крупных фрагментов фрагменты ДНК разделяются путем выбора размера на основе гранул. [9]
Прикрепление последовательностей адаптеров
[ редактировать ]Последовательности адаптерной ДНК должны быть прикреплены к неизвестному фрагменту ДНК так, чтобы сегменты ДНК с известными последовательностями фланкировали неизвестную ДНК. В первом раунде лигирования адаптера правый (Ad153_right) и левый (Ad153_left) адаптеры прикрепляются к правому и левому флангам фрагментированной ДНК, и ДНК амплифицируется с помощью ПЦР . Затем олигонуклеотидная шина гибридизуется с концами фрагментов, которые лигируются с образованием круга. Добавляется экзонуклеаза для удаления всех оставшихся линейных одноцепочечных и двухцепочечных продуктов ДНК. В результате получается законченная кольцевая матрица ДНК. [2]
Репликация по катящемуся кругу
[ редактировать ]После создания одноцепочечной кольцевой ДНК-матрицы, содержащей образец ДНК, который лигирован с двумя уникальными адаптерными последовательностями, полная последовательность амплифицируется в длинную цепочку ДНК. Это достигается путем репликации по катящемуся кругу с помощью ДНК-полимеразы Phi 29, которая связывает и реплицирует матрицу ДНК. Вновь синтезированная цепь высвобождается из кольцевой матрицы, в результате чего образуется длинная одноцепочечная ДНК, содержащая несколько копий кольцевой матрицы от головы до хвоста. [10] Полученная наночастица самособирается в плотный клубок ДНК диаметром примерно 300 нанометров (нм). Наношарики остаются отделенными друг от друга, поскольку они отрицательно заряжены, естественным образом отталкиваются друг от друга, уменьшая любое запутывание между разными длинами одноцепочечных ДНК. [2]
ДНК-матрица с наношариками
[ редактировать ]Чтобы получить последовательность ДНК, наношарики ДНК прикрепляют к проточной ячейке с узорчатым массивом. Проточная ячейка представляет собой кремниевую пластину, покрытую диоксидом кремния , титаном , гексаметилдисилазаном (ГМДС) и фоторезистом . Наношарики ДНК добавляются в проточную ячейку и избирательно связываются с положительно заряженным аминосиланом по высокоупорядоченной схеме, что позволяет секвенировать очень высокую плотность наношариков ДНК. [2] [11]
Визуализация
[ редактировать ]После каждого этапа включения нуклеотидов ДНК проточную ячейку визуализируют, чтобы определить, какое нуклеотидное основание связано с наношариком ДНК. Флуорофор возбуждается лазером , определенной длины волны который возбуждает свет . Излучение флуоресценции каждого наношарика ДНК фиксируется ПЗС-камерой высокого разрешения . Затем изображение обрабатывается для удаления фонового шума и оценки интенсивности каждой точки. Цвет каждого наношарика ДНК соответствует основанию в вопросительной позиции, и компьютер записывает информацию о положении основания. [2]
Формат данных секвенирования
[ редактировать ]Данные, полученные из наношариков ДНК, форматируются как стандартные файлы в формате FASTQ со смежными основаниями (без пробелов). Эти файлы можно использовать в любом конвейере анализа данных, который настроен для чтения файлов FASTQ с одним или парным концом.
Например:
Прочтите 1, из парного конечного прогона на 100 б.п. [12]
@CL100011513L1C001R013_126365/1 CTAGGCAACTATAGGTCTCAGTTAAGTCAAATAAAATTCACATCAAATTTTTACTCCCACCATCCCAACACTTTCCTGCCTGGCATATGCCGTGTCTGCC + FFFFFFFFFFFGFGFFFFFF;FFFFFFFGFGFGFFFFFF;FFFFGFGFGFFEFFFFFEDGFDFF@FCFGFGCFFFFFEFFEGDFDFFFFFGDAFFEFGFF
Соответствующее чтение 2:
@CL100011513L1C001R013_126365/2 TGTCTACCATATTCTACATTCCACACTCGGTGAGGGAAGGTAGGCACATAAAGCAATGGCAGTACGGTGTAATACATGCTAATGTAGAGTAAGCACTCAG + 3E9E<ADEBB:D>E?FD<<@EFE>>ECEF5CE:B6E:CEE?6B>B+@??31/FD:0?@:E9<3FE2/A:/8>9CB&=E<7:-+>;29:7+/5D9)?5F/:
Советы по информатике
[ редактировать ]Выравнивание эталонного генома
[ редактировать ]Параметры по умолчанию для популярных элайнеров вполне достаточны.
Чтение имен
[ редактировать ]В файле FASTQ, созданном секвенаторами BGI/MGI с использованием наношариков ДНК в проточной ячейке с узорчатым массивом, имена считываний выглядят следующим образом:
БГИСЭК-500: CL100025298L1C002R050_244547
МГИСЭК-2000: V100006430L1C001R018613883
Имена чтения можно проанализировать для извлечения трех переменных, описывающих физическое расположение чтения в шаблонном массиве: (1) плитка/регион, (2) координата x и (3) координата y. Обратите внимание, что из-за порядка этих переменных эти прочитанные имена не могут быть проанализированы с помощью Picard MarkDuulates в целях идентификации оптических дубликатов. Однако, поскольку на этой платформе их нет, это не представляет проблемы для анализа данных на основе Пикарда.
Дубликаты
[ редактировать ]Поскольку наношарики ДНК остаются в своих местах на структурированном массиве, нет оптических дубликатов, с которыми можно было бы бороться во время биоинформатического анализа считываний секвенирования. Предлагается запускать Picard MarkDuulates следующим образом:
java -jar picard.jar MarkDuplicates I=input.bam O=marked_duplicates.bam M=marked_dup_metrics.txt READ_NAME_REGEX=null
Тест с переформатированными именами чтения, удобными для Пикарда, демонстрирует отсутствие этого класса повторяющегося чтения:
Единственное чтение, помеченное как оптический дубликат, наверняка является артефактом. В любом случае влияние на предполагаемый размер библиотеки незначительно.
Преимущества
[ редактировать ]Технология секвенирования ДНК наношариками предлагает некоторые преимущества по сравнению с другими платформами секвенирования. Одним из преимуществ является устранение оптических дубликатов. Наношарики ДНК остаются на месте на узорчатом массиве и не мешают соседним наношарикам.
Еще одним преимуществом секвенирования ДНК наношариками является использование высокоточной ДНК-полимеразы Phi 29. [10] Чтобы обеспечить точную амплификацию круглого шаблона, несколько сотен копий круглого шаблона уплотняются на небольшой площади, что приводит к интенсивному сигналу, а прикрепление флуорофора к зонду на большом расстоянии от точки лигирования приводит к улучшению лигирования. [2]
Недостатки
[ редактировать ]Основным недостатком секвенирования ДНК наношариками является короткая длина считывания последовательностей ДНК, полученных с помощью этого метода. [2] Короткие чтения, особенно для ДНК с высоким содержанием повторов ДНК , могут соответствовать двум или более областям эталонного генома. Вторым недостатком этого метода является необходимость использования нескольких раундов ПЦР. Это может привести к систематической ошибке ПЦР и, возможно, к увеличению количества примесей на этапе создания матрицы. [2] Однако эти недостатки являются общими для всех платформ секвенирования короткого считывания и не являются специфичными для наношариков ДНК.
Приложения
[ редактировать ]В недавних исследованиях использовалось секвенирование ДНК наношариками. Ли и др. использовали эту технологию, чтобы найти мутации, присутствующие при раке легких, и сравнили их с нормальной легочной тканью. [13] Им удалось идентифицировать более 50 000 однонуклеотидных вариантов . Роуч и др. использовали секвенирование ДНК наношариками для секвенирования геномов семьи из четырех родственников и смогли идентифицировать SNP, которые могут быть ответственны за менделевское расстройство , [14] и смогли оценить частоту мутаций между поколениями. [14] Институт системной биологии использовал эту технологию для секвенирования 615 полных образцов человеческого генома в рамках исследования нейродегенеративных заболеваний, а Национальный институт рака использует секвенирование наношариков ДНК для секвенирования 50 опухолей и соответствующих нормальных тканей от детского рака . [ нужна ссылка ]
Значение
[ редактировать ]Массово параллельные платформы секвенирования следующего поколения, такие как секвенирование ДНК наношариками, могут способствовать диагностике и лечению многих генетических заболеваний. Благодаря технологии наношаров ДНК стоимость секвенирования всего человеческого генома упала с примерно одного миллиона долларов в 2008 году до 4400 долларов в 2010 году. [15] При секвенировании полных геномов пациентов с заболеваниями или раком наследственными мутации были выявлены , связанные с этими заболеваниями, что открывает новые стратегии, такие как таргетная терапия для людей из группы риска и генетическое консультирование . [15] Поскольку цена секвенирования всего человеческого генома приближается к отметке в 1000 долларов , секвенирование генома каждого человека может стать возможным в рамках обычной профилактической медицины . [15]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Хуан, Цзе, Синьмин; Гэн, Чуньюй; Лу, Хаорун; Мэй, Сянлинь; Чэнь, Вэньвэй; Цзян, Хуэй; Ян, Чжаопэн; Му, Фэн; Шансянь (2017). Эталонный набор данных генома человека, полученный с помощью секвенатора BGISEQ-500» 5 ( . ) : 1–9. « 6 10.1093 gix024 ISSN 2047-217X . PMC 5467036 / gigascience /
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж Дрманац, Р.; Спаркс, АБ; Кэллоу, MJ; Халперн, Алабама; Бернс, Нидерланды; Кермани, Б.Г.; Карневали, П.; Назаренко И.; и др. (2009). «Секвенирование генома человека с использованием считываний несцепленных оснований на самособирающихся наноматрицах ДНК» . Наука . 327 (5961): 78–81. Бибкод : 2010Sci...327...78D . дои : 10.1126/science.1181498 . ПМИД 19892942 . S2CID 17309571 .
- ^ Поррека, Грегори Дж (2010). «Секвенирование генома на наношариках». Природная биотехнология . 28 (1): 43–4. дои : 10.1038/nbt0110-43 . ПМИД 20062041 . S2CID 54557996 .
- ^ «BGI-Shenzhen завершает приобретение компании Complete Genomics» (пресс-релиз). Новостная лента по связям с общественностью.
- ^ «Обзор технологии полногеномного секвенирования Revolocity™» (PDF) . Полная геномика . Проверено 18 ноября 2017 г.
- ^ Хуанг, Дж. (2017). «Эталонный набор данных генома человека секвенатора BGISEQ-500» . ГигаСайенс . 6 (5): 1–9. doi : 10.1093/gigascience/gix024 . ПМК 5467036 . ПМИД 28379488 .
- ^ Фуллвуд, MJ; Вэй, К.-Л.; Лю, ET; Руан, Ю. (2009). «Секвенирование ДНК следующего поколения парных концевых меток (ПЭТ) для анализа транскриптома и генома» . Геномные исследования . 19 (4): 521–32. дои : 10.1101/гр.074906.107 . ПМЦ 3807531 . ПМИД 19339662 .
- ^ Фельманн, Т. (2016). «Секвенирование на основе cPAS на BGISEQ-500 для исследования малых некодирующих РНК» . Клин Эпигенетика . 8 : 123. дои : 10.1186/s13148-016-0287-1 . ПМЦ 5117531 . ПМИД 27895807 .
- ^ Мюллер, В. (1982). «Фракционирование фрагментов ДНК по размеру от 20 до 30 000 пар оснований методом жидкостной/жидкостной хроматографии» . Eur J Biochem . 128 (1): 231–238. дои : 10.1111/j.1432-1033.1982.tb06956.x . ПМИД 7173204 .
- ^ Jump up to: а б Бланко, Луис; Бернад, Антонио; Лазаро, Хосе М.; Мартин, Гил; Гармендия, Кристина; Маргарита, М; Салас (1989). «Высокоэффективный синтез ДНК ДНК-полимеразой фага фи 29. Симметричный способ репликации ДНК» . Журнал биологической химии . 264 (15): 8935–40. дои : 10.1016/S0021-9258(18)81883-X . ПМИД 2498321 .
- ^ Криси, Л.; Ли, Гу; О'Ферролл, CE (1996). «Ковалентное прикрепление синтетической ДНК к самоорганизующимся монослойным пленкам» . Исследования нуклеиновых кислот . 24 (15): 3031–9. дои : 10.1093/нар/24.15.3031 . ПМК 146042 . ПМИД 8760890 .
- ^ «Обновленный эталонный набор данных генома человека секвенатора BGISEQ-500» . ГигаДБ . Проверено 22 марта 2017 г.
- ^ Ли, Уильям; Цзян, Чжаоши; Лю, Цзиньфэн; Хаверти, Питер М.; Гуань, Инхуэй; Стинсон, Джереми; Юэ, Пэн; Чжан, Ян; и др. (2010). «Спектр мутаций, выявленный парными последовательностями генома больного раком легких». Природа . 465 (7297): 473–7. Бибкод : 2010Natur.465..473L . дои : 10.1038/nature09004 . ПМИД 20505728 . S2CID 4354035 .
- ^ Jump up to: а б Роуч, Джей Си; Глусман, Г.; Смит, AFA; Хафф, CD; Хабли, Р.; Шеннон, ПТ; Роуэн, Л.; Пант, КП; и др. (2010). «Анализ генетической наследственности в семейном квартете методом полногеномного секвенирования» . Наука . 328 (5978): 636–9. Бибкод : 2010Sci...328..636R . дои : 10.1126/science.1186802 . ПМК 3037280 . ПМИД 20220176 .
- ^ Jump up to: а б с Спайчер, Майкл Р.; Гейгль, Йохен Б; Томлинсон, Ян П. (2010). «Влияние полногеномных ассоциативных исследований, генетического тестирования непосредственно к потребителю и технологий высокоскоростного секвенирования на прогнозное генетическое консультирование по поводу риска рака». Ланцет онкологии . 11 (9): 890–8. дои : 10.1016/S1470-2045(09)70359-6 . ПМИД 20537948 .