Биочип
В молекулярной биологии биочипы представляют собой сконструированные субстраты («миниатюрные лаборатории»), на которых может проводиться большое количество одновременных биохимических реакций. Одной из целей технологии биочипов является эффективный скрининг большого количества биологических аналитов, потенциальные применения которых варьируются от диагностики заболеваний до обнаружения агентов биотерроризма . Например, цифровые микрофлюидные биочипы исследуются для применения в биомедицинских областях. В цифровом микрофлюидном биочипе группа (соседних) ячеек в микрофлюидном массиве может быть сконфигурирована для работы в качестве хранилища, функциональных операций, а также для динамической транспортировки капель жидкости. [1]
История [ править ]
Разработка началась с ранней работы над базовой сенсорной технологией. Одним из первых портативных химических датчиков был стеклянный pH-электрод , изобретенный в 1922 году Хьюзом. [2] Основная концепция использования обменных центров для создания селективных мембран в последующие годы была использована при разработке других ионных сенсоров. Например, К + Сенсор был изготовлен путем включения валиномицина в тонкую мембрану. [3]
В 1953 году Уотсон и Крик объявили об открытии теперь уже знакомой двойной спиральной структуры молекул ДНК и заложили основу для генетических исследований, которые продолжаются и по сей день. [4] Разработка методов секвенирования в 1977 году. Гилбертом [5] и Сэнгер [6] (работая отдельно) позволили исследователям напрямую читать генетические коды, которые предоставляют инструкции по синтезу белка . Это исследование показало, как гибридизацию комплементарных одиночных цепей олигонуклеотидов можно использовать в качестве основы для распознавания ДНК. Две дополнительные разработки позволили использовать технологию, используемую в современных технологиях на основе ДНК. Впервые в 1983 году Кэри Маллис изобрел метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). [4] метод амплификации концентрации ДНК. Это открытие сделало возможным обнаружение чрезвычайно малых количеств ДНК в образцах. Во-вторых, в 1986 году Худ и его коллеги разработали метод мечения молекул ДНК флуоресцентными метками вместо радиоактивных меток. [7] что позволяет наблюдать эксперименты по гибридизации оптически.
На рисунке 1 показано устройство типичной платформы биочипа. Фактический чувствительный компонент (или «чип») — это всего лишь часть законченной системы анализа. Трансдукция должна выполняться для перевода фактического события восприятия (связывание ДНК, окисление/восстановление и т. д. ) в формат, понятный компьютеру ( напряжение , интенсивность света, масса и т. д. ), что затем позволяет провести дополнительный анализ и обработку для получения окончательный, удобочитаемый результат. Множество технологий, необходимых для создания успешного биочипа — от химического зондирования до микрочипов и обработки сигналов — требуют настоящего междисциплинарного подхода, что делает барьер для входа очень высоким. Один из первых коммерческих биочипов был представлен компанией Affymetrix . Их продукты «GeneChip» содержат тысячи отдельных ДНК-сенсоров для использования в обнаружении дефектов или однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в таких генах, как p53 (супрессор опухоли) и BRCA1 и BRCA2 (связанные с раком молочной железы). [8] Чипы производятся с использованием методов микролитографии , традиционно используемых для изготовления интегральных схем (см. Ниже).
Изготовление микроматриц [ править ]
Микроматрица — плотная двумерная сетка биосенсоров — является важнейшим компонентом платформы биочипа. Обычно датчики наносятся на плоскую подложку, которая может быть либо пассивной ( например, кремниевая или стеклянная), либо активной, причем последняя состоящий из интегрированной электроники или микромеханических устройств, которые выполняют или помогают передавать сигнал. Химия поверхности используется для ковалентного связывания молекул сенсора со средой-подложкой. Изготовление микроматриц нетривиально и представляет собой серьезное экономическое и технологическое препятствие, которое в конечном итоге может решить успех будущих платформ биочипов. Основная производственная задача — это процесс размещения каждого датчика в определенном положении (обычно в декартовой сетке) на подложке. Существуют различные способы размещения, но обычно это роботизированное микропипетирование. [9] или микропечать [10] системы используются для размещения крошечных пятен сенсорного материала на поверхности чипа. Поскольку каждый датчик уникален, одновременно можно разместить только несколько точек. Низкая пропускная способность этого Процесс приводит к высоким производственным затратам.
Фодор и его коллеги разработали уникальный процесс изготовления (позже использованный Affymetrix ), в котором серия этапов микролитографии используется для комбинаторного синтеза сотен тысяч уникальных одноцепочечных сенсоров ДНК на подложке по одному нуклеотиду за раз. [11] [12] Для каждого базового типа требуется один этап литографии; таким образом, на каждый уровень нуклеотидов требуется всего четыре этапа. Хотя этот метод очень мощный, поскольку можно создавать одновременно множество сенсоров, в настоящее время он возможен только для создания коротких цепочек ДНК (15–25 нуклеотидов). Факторы надежности и стоимости ограничивают количество этапов фотолитографии, которые можно выполнить. Более того, методы светонаправленного комбинаторного синтеза в настоящее время невозможны для белков или других чувствительных молекул.
Как отмечалось выше, большинство микрочипов состоят из декартовой сетки датчиков. Этот подход используется в основном для сопоставления или «кодирования» координаты каждого датчика с его функцией. Датчики в этих массивах обычно используют универсальный метод передачи сигналов ( например, флуоресценцию), что делает координаты их единственным идентифицирующим признаком. Эти массивы должны быть изготовлены с использованием последовательного процесса ( т. е. требующего нескольких последовательных шагов), чтобы гарантировать, что каждый датчик размещен в правильном положении.
«Случайное» изготовление, при котором датчики размещаются в произвольных позициях на кристалле, является альтернативой последовательному методу. Утомительный и дорогостоящий процесс позиционирования не требуется, что позволяет использовать методы параллельной самосборки. При таком подходе можно производить большие партии одинаковых датчиков; датчики из каждой партии затем объединяются и собираются в массив. Для идентификации каждого датчика необходимо использовать некоординатную схему кодирования. Как показано на рисунке, такая конструкция была впервые продемонстрирована (а позже коммерциализирована компанией Illumina) с использованием функционализированных шариков, случайным образом размещенных в лунках протравленного оптоволоконного кабеля. [13] [14] Каждая бусина была уникально закодирована флуоресцентной подписью. Однако эта схема кодирования ограничена в количестве уникальных комбинаций красителей, которые можно использовать и успешно дифференцировать.
Массив белковых биочипов и другие технологии микрочипов
Микрочипы не ограничиваются анализом ДНК ; белковые микрочипы , микрочипы антител , микрочипы химических соединений также можно производить с использованием биочипов. В 2003 году компания Randox Laboratories Ltd. выпустила Evidence, первый анализатор с технологией белковых биочипов. В технологии белковых биочипов биочип заменяет для ИФА планшет или кювету в качестве реакционной платформы. Биочип используется для одновременного анализа панели связанных тестов в одном образце, создавая профиль пациента . Профиль пациента можно использовать при скрининге заболеваний, диагностике , мониторинге прогрессирования заболевания или мониторинге лечения. Одновременное выполнение нескольких анализов, называемое мультиплексированием, позволяет значительно сократить время обработки и количество требуемых образцов пациентов. Технология Biochip Array — это новое применение известной методологии с использованием сэндвич-анализа, конкурентного иммуноанализа и иммуноанализа с захватом антител . Отличие от обычных иммуноанализов заключается в том, что лиганды захвата ковалентно прикреплены к поверхности биочипа в упорядоченном виде, а не в растворе.
В сэндвич-анализах используются антитела, меченные ферментом; в конкурентных анализах используется антиген, меченный ферментом. При связывании антитело-антиген реакция хемилюминесценции дает свет. Обнаружение осуществляется камерой с зарядовой связью (CCD). ПЗС-камера представляет собой чувствительный датчик с высоким разрешением, способный точно обнаруживать и количественно определять очень низкие уровни света. Тестовые области располагаются с использованием сетки, затем сигналы хемилюминесценции анализируются с помощью программного обеспечения для визуализации для быстрого и одновременного количественного определения отдельных аналитов.
Биочипы также используются в области микрофизиометрии , например, в технологии «кожа на чипе». [15] Приложения.
Подробную информацию о других технологиях массивов см. в разделе «Микрочип антител» .
См. также [ править ]
Ссылки [ править ]
- ^ «Высокоуровневый синтез цифровых микрофлюидных биочипов» (PDF) . Университет Дьюка.
- ^ WS Хьюз, «Разница потенциалов между стеклом и электролитами при контакте с водой», J. Am. хим. Соц. 44, стр. 2860–2866, 1922 г.
- ^ Дж. С. Шульц и Р. Ф. Тейлор в Справочнике по химическим и биологическим сенсорам , Дж. С. Шульц и Р. Ф. Тейлор, ред., гл. Введение в химические и биологические датчики, стр. 1–10, Издательство Института физики, Филадельфия, 1996 г.
- ^ Перейти обратно: а б Д.Л. Нельсон и М.М. Кокс, Принципы биохимии Ленингера , Worth Publishers, Нью-Йорк, 2000 г.
- ^ AM Максам и В. Гилберт, «Новый метод секвенирования ДНК», Proc. Натл. акад. наук. 74, стр. 560–564, 1977 г.
- ^ Ф. Сэнгер, С. Никлен и А. Р. Коулсон, «Секвенирование ДНК с ингибиторами обрыва цепи», Proc. Натл. акад. наук. 74, стр. 5463–5467, 1977 г.
- ^ Л. М. Смит, Дж. З. Сандерс, Р. Дж. Кайзер, П. Хьюз, К. Додд, Ч. Р. Коннелл, К. Хайнер, С. Б. Х. Кент и Л. Е. Худ, «Обнаружение флуоресценции в автоматизированном анализе последовательностей ДНК», Nature 321, стр. 61–67. , 1986 г.
- ^ П. Фортина, Д. Грейвс, К. Стокерт-младший, С. Маккензи и С. Суррей в «Технологии биочипов» , Дж. Ченг и Л. Дж. Крика, ред., гл. Технологические варианты и применение ДНК-микрочипов, стр. 185–216, Harwood Academic Publishers, Филадельфия, 2001 г.
- ^ М. Шена, Д. Шалон, Р. В. Дэвис и П. О. Браун, «Количественный мониторинг закономерностей экспрессии генов с помощью комплементарного микрочипа ДНК», Science 270, стр. 467–470, 1995.
- ^ Г. Макбит, А. Н. Келер и С. Л. Шрайбер, «Печать малых молекул в виде микрочипов и массовое обнаружение взаимодействий белок-лиганд», J. Am. хим. Соц. 121, стр. 7967–7968, 1999 г.
- ^ С. П. Фодор, Дж. Л. Рид, М. К. Пиррунг, Л. Страйер, А. Т. Лу и Д. Солас, «Светонаправленный, пространственно адресуемый параллельный химический анализ», Science 251, стр. 767–773, 1991.
- ^ AC Pease, D. Solas, EJ Sullivan, MT Cronin, CP Holmes и SP Fodor, «Светогенерируемые массивы олигонуклеотидов для быстрого анализа последовательностей ДНК», Proc. Натл. акад. наук. 91, стр. 5022–5026, 1994 г.
- ^ Ф. Дж. Стимерс, Дж. А. Фергюсон и Д. Р. Уолт, «Скрининг немеченых мишеней ДНК с помощью случайно упорядоченных волоконно-оптических массивов генов», Nature Biotechnology 18, стр. 91–94, 2000 г.
- ^ К. Л. Майкл, Л. К. Тейлор, С. Л. Шульц и Д. Р. Уолт, «Случайно упорядоченные адресные массивы оптических датчиков высокой плотности», Analytical Chemistry 70, стр. 1242–1248, 1998.
- ^ Александр Ф., Эггерт С., Уист Дж.: Кожа на чипе: измерения трансэпителиального электрического сопротивления и внеклеточного подкисления с помощью автоматизированного интерфейса воздух-жидкость, Гены, 2018, 9/2, 114; дои : 10.3390/genes9020114
| Базы данных органов управления : Национальные |
|---|
