Белковый микрочип
Белковый микрочип (или белковый чип ) — это высокопроизводительный метод, используемый для отслеживания взаимодействий и активности белков, а также для определения их функций и определения функций в больших масштабах. [1] Его главное преимущество заключается в том, что можно отслеживать большое количество белков параллельно. Чип состоит из опорной поверхности, такой как предметное стекло, нитроцеллюлозная мембрана, шарик или микротитровальный планшет , к которому прикреплен массив захватывающих белков. [2] К массиву добавляются молекулы- зонды , обычно помеченные флуоресцентным красителем. Любая реакция между зондом и иммобилизованным белком излучает флуоресцентный сигнал, который считывается лазерным сканером . [3] Белковые микрочипы являются быстрыми, автоматизированными, экономичными и высокочувствительными, требующими небольших количеств образцов и реагентов. [4] Концепция и методология белковых микрочипов были впервые представлены и проиллюстрированы на микрочипах антител (также называемых матрицей антител ) в 1983 году в научной публикации. [5] и ряд патентов. [6] Высокопроизводительную технологию, лежащую в основе белковых микрочипов, было относительно легко разработать, поскольку она основана на технологии, разработанной для ДНК-микрочипов . [7] которые стали наиболее широко используемыми микрочипами .
Мотивация к развитию
[ редактировать ]Белковые микрочипы были разработаны из-за ограничений использования ДНК-микрочипов для определения уровней экспрессии генов в протеомике . Количество мРНК в клетке часто не отражает уровень экспрессии белков, которым они соответствуют. Поскольку функциональную роль в клеточном ответе обычно играет белок, а не мРНК, потребовался новый подход. Кроме того, посттрансляционные модификации , которые часто имеют решающее значение для определения функции белка, не видны на микрочипах ДНК. [8] Белковые микроматрицы заменяют традиционные методы протеомики, такие как 2D-гель-электрофорез или хроматография , которые были трудоемкими, трудоемкими и плохо подходили для анализа белков с низким содержанием.
Создание массива
[ редактировать ]Белки наносят на твердую поверхность, такую как предметные стекла, мембраны, шарики или планшеты для микротитрования. Функция этой поверхности — обеспечить опору, на которой могут быть иммобилизованы белки. Он должен демонстрировать максимальные связывающие свойства, сохраняя при этом белок в его нативной конформации, чтобы сохранить его связывающую способность. Предметные стекла для микроскопов, изготовленные из стекла или кремния, являются популярным выбором, поскольку они совместимы с легкодоступными роботизированными устройствами и лазерными сканерами, разработанными для технологии микрочипов ДНК. Слайды из нитроцеллюлозной пленки широко признаны в качестве субстрата с самым высоким связыванием белка для приложений белковых микрочипов.
Затем выбранную твердую поверхность покрывают покрытием, которое должно выполнять одновременные функции иммобилизации белка, предотвращения его денатурации , ориентации его в соответствующем направлении, чтобы его сайты связывания были доступны, и обеспечения гидрофильной среды, в которой может происходить реакция связывания. происходить. Он также должен отображать минимальную неспецифическую привязку, чтобы минимизировать фоновый шум в системах обнаружения. Кроме того, он должен быть совместим с различными системами обнаружения. Иммобилизирующие агенты включают слои алюминия или золота, гидрофильные полимеры и полиакриламидные гели или обработку аминами , альдегидом или эпоксидной смолой . тонкопленочные технологии, такие как физическое осаждение из паровой фазы (PVD) и химическое осаждение из паровой фазы Для нанесения покрытия на поверхность основы используются (CVD).
Водная среда необходима на всех этапах изготовления и эксплуатации массивов для предотвращения денатурации белков. Поэтому буферы для проб содержат высокий процент глицерина (для понижения температуры замерзания), а влажность производственной среды тщательно регулируется. Микролунки имеют двойное преимущество: они обеспечивают водную среду и предотвращают перекрестное загрязнение между образцами.
В наиболее распространенном типе белковых массивов роботы помещают большое количество белков или их лигандов на твердую основу с покрытием по заранее заданному шаблону. Это известно как роботизированная контактная печать или роботизированное споттинг. Другим методом изготовления является струйная печать , бесконтактный метод диспергирования белковых полимеров на твердой поверхности с желаемым рисунком. [9] Пьезоэлектрическое пятно — это метод, аналогичный струйной печати. Печатающая головка перемещается по массиву и в каждом месте использует электрическую стимуляцию, чтобы доставить молекулы белка на поверхность с помощью крошечных струй. Это также бесконтактный процесс. [10] Фотолитография — это четвертый метод нанесения белков на поверхность. Свет используется в сочетании с фотомасками , непрозрачными пластинами с отверстиями или прозрачными пленками, которые позволяют свету проходить через определенный узор. Затем серия химических обработок позволяет нанести белок желаемого рисунка на материал под фотомаской. [11]
Молекулы захвата, расположенные на твердой поверхности, могут представлять собой антитела , антигены , аптамеры (лиганды на основе нуклеиновых кислот), аффитела (маленькие молекулы, созданные для имитации моноклональных антител) или полноразмерные белки. Источники таких белков включают клеточные системы экспрессии рекомбинантных белков , очистку из природных источников, производство in vitro с помощью бесклеточных систем трансляции и методы синтеза пептидов . Многие из этих методов могут быть автоматизированы для производства с высокой производительностью, но необходимо проявлять осторожность, чтобы избежать условий синтеза или экстракции, которые приводят к образованию денатурированного белка, который, поскольку он больше не распознает своего партнера по связыванию, делает массив бесполезным.
Белки очень чувствительны к изменениям своего микроокружения. Это представляет собой проблему поддержания белковых массивов в стабильном состоянии в течение длительных периодов времени. Методы in situ — изобретены и опубликованы Мингю Хэ и Майклом Тауссигом в 2001 году. [12] [13] — включать синтез белков на чипе по мере необходимости, непосредственно из ДНК с использованием бесклеточных систем экспрессии белков. Поскольку ДНК является очень стабильной молекулой, она не разрушается с течением времени и поэтому пригодна для длительного хранения. Преимущество этого подхода также состоит в том, что он позволяет избежать трудоемких и зачастую дорогостоящих процессов раздельной очистки белков и клонирования ДНК , поскольку белки создаются и иммобилизуются одновременно за один этап на поверхности чипа. Примерами методов in situ являются PISA (матрица белков in situ), NAPPA (матрица программируемых нуклеиновыми кислотами белков) и DAPA (матрица ДНК к матрице белков).
Типы массивов
[ редактировать ]
Существует три типа белковых микрочипов, которые в настоящее время используются для изучения биохимической активности белков.
Аналитические микрочипы также известны как массивы захвата. В этом методе на поверхности носителя размещается библиотека антител, аптамеров или аффител. Они используются в качестве молекул захвата, поскольку каждая из них специфически связывается с определенным белком. Массив исследуется с помощью сложного белкового раствора, такого как клеточный лизат . Анализ полученных реакций связывания с использованием различных систем обнаружения может предоставить информацию об уровнях экспрессии конкретных белков в образце, а также измерить аффинность и специфичность связывания. Этот тип микрочипов особенно полезен при сравнении экспрессии белков в различных растворах. Например, реакцию клеток на тот или иной фактор можно определить путем сравнения лизатов клеток, обработанных конкретными веществами или выращенных в определенных условиях, с лизатами контрольных клеток. Другое применение — идентификация и профилирование больных тканей.
Белковые микроматрицы обращенной фазы (RPPA) включают сложные образцы, такие как лизаты тканей. Клетки выделяют из различных представляющих интерес тканей и лизируют. Лизат наносят на микроматрицу и исследуют антителами против интересующего белка-мишени. Эти антитела обычно выявляются с помощью хемилюминесцентных , флуоресцентных или колориметрических анализов. Эталонные пептиды напечатаны на предметных стеклах для количественного определения белка в лизатах образцов. RPA позволяют определить наличие измененных белков или других агентов, которые могут быть результатом заболевания. В частности, посттрансляционные модификации, которые обычно изменяются в результате заболевания, можно обнаружить с помощью RPA. [14]
Функциональные белковые микрочипы
[ редактировать ]Функциональные белковые микрочипы (также известные как целевые белковые массивы) создаются путем иммобилизации большого количества очищенных белков и используются для идентификации взаимодействий белок-белок, белок-ДНК, белок- РНК , белок- фосфолипид и белок-малые молекулы, чтобы анализ ферментативной активности, а также обнаружение антител и демонстрация их специфичности. Они отличаются от аналитических массивов тем, что функциональные белковые массивы состоят из массивов, содержащих полноразмерные функциональные белки или белковые домены. Эти белковые чипы используются для изучения биохимической активности всего протеома в одном эксперименте.
Ключевым элементом любого анализа на основе функционального белкового микрочипа является то, что построенные белки должны сохранять свою нативную структуру, чтобы на поверхности массива могли происходить значимые функциональные взаимодействия. Преимущества контроля точного способа прикрепления к поверхности посредством использования соответствующей аффинной метки заключаются в том, что иммобилизованные белки будут иметь гомогенную ориентацию, что приводит к более высокой удельной активности и более высокому соотношению сигнал/шум в анализах с меньшим вмешательством со стороны не- специфические взаимодействия. [15] [16]
Обнаружение
[ редактировать ]Методы обнаружения белковых массивов должны давать высокий сигнал и низкий фон. Наиболее распространенным и широко используемым методом обнаружения является флуоресцентное мечение, которое является высокочувствительным, безопасным и совместимым с легкодоступными лазерными сканерами на микрочипах. Могут использоваться и другие метки, такие как аффинные, фотохимические или радиоизотопные метки. Эти метки прикреплены к самому зонду и могут мешать реакции зонда с белком-мишенью. Таким образом, доступен ряд методов обнаружения без меток, таких как поверхностный плазмонный резонанс (ППР), углеродные нанотрубки, датчики из углеродных нанопроволок (где обнаружение происходит через изменения проводимости) и кантилеверы микроэлектромеханической системы (МЭМС). [17] Все эти методы обнаружения без меток относительно новы и еще не подходят для высокопроизводительного обнаружения взаимодействий белков; однако они открывают большие перспективы на будущее. Иммуноанализы на микропиллярных каркасах из тиол-еновой «синтетической бумаги» показали, что они генерируют превосходный сигнал флуоресценции. [18]
Для количественного определения белка на предметных стеклах, покрытых нитроцеллюлозой, можно использовать флуоресцентное обнаружение в ближнем ИК-диапазоне. Это ограничивает помехи из-за автофлуоресценции нитроцеллюлозы на длинах волн УФ, используемых для стандартных флуоресцентных датчиков обнаружения. [19]
Приложения
[ редактировать ]Существует пять основных областей применения белковых массивов: диагностика, протеомика, функциональный анализ белков, характеристика антител и разработка методов лечения.
Диагностика предполагает обнаружение антигенов и антител в образцах крови; профилирование сывороток для обнаружения новых биомаркеров заболеваний ; мониторинг болезненных состояний и реакции на терапию в персонализированной медицине; мониторинг окружающей среды и продуктов питания. Цифровой биоанализ является примером использования белкового микрочипа в диагностических целях. В этой технологии массив микролунок на стеклянно-полимерном чипе засеивается магнитными шариками (покрытыми антителами с флуоресцентной меткой), подвергается воздействию целевых антигенов, а затем анализируется под микроскопом путем подсчета флуоресцентных лунок. Недавно была продемонстрирована экономически эффективная платформа изготовления (с использованием полимеров OSTE ) для таких массивов микролунок, и модельная система биоанализа была успешно охарактеризована. [20]
Протеомика относится к профилированию экспрессии белков, т.е. к определению того, какие белки экспрессируются в лизате конкретной клетки.
Функциональный анализ белка — это идентификация белок-белковых взаимодействий (например, идентификация членов белкового комплекса), белок-фосфолипидных взаимодействий, малых молекул-мишеней, ферментативных субстратов (особенно субстратов киназ ) и лигандов рецепторов.
Характеристика антител – это определение перекрестной реактивности , специфичности и картирование эпитопов .
Разработка методов лечения включает разработку антигенспецифической терапии аутоиммунитета , рака и аллергии; идентификация малых молекул-мишеней, которые потенциально могут быть использованы в качестве новых лекарств.
Проблемы
[ редактировать ]Несмотря на значительные инвестиции, сделанные несколькими компаниями, белковые чипы еще не наводнили рынок. Производители обнаружили, что с белками на самом деле довольно сложно обращаться. Производство надежных, последовательных, высокопроизводительных, правильно свернутых и функциональных белков сопряжено с трудностями, поскольку часто приводит к низкому выходу белков из-за снижения растворимости и образования телец включения. [ нужна ссылка ] Создание белкового чипа требует гораздо большего количества шагов, чем создание ДНК-чипа .
Существует ряд подходов к этой проблеме, которые фундаментально различаются в зависимости от того, иммобилизуются ли белки посредством неспецифических, плохо определенных взаимодействий или посредством специфического набора известных взаимодействий. Первый подход привлекателен своей простотой и совместим с очищенными белками, полученными из нативных или рекомбинантных источников. [21] [22] но страдает от ряда рисков. Наиболее примечательные из них связаны с неконтролируемым характером взаимодействий между каждым белком и поверхностью; в лучшем случае это может привести к появлению гетерогенной популяции белков, в которой активные центры иногда закрыты поверхностью; в худшем случае это может полностью разрушить активность из-за частичного или полного поверхностно-опосредованного разворачивания иммобилизованного белка.
Задачи включают в себя: 1) поиск поверхности и метода прикрепления, которые позволят белкам сохранять свою вторичную или третичную структуру и, следовательно, их биологическую активность и взаимодействие с другими молекулами, 2) создание массива с длительным сроком хранения, чтобы белки на чипе не денатурируют в течение короткого времени, 3) идентификация и выделение антител или других улавливающих молекул против каждого белка в геноме человека, 4) количественное определение уровней связанного белка, обеспечивая при этом чувствительность и избегая фонового шума, 5) извлечение обнаруженных белок из чипа для его дальнейшего анализа, 6) снижение неспецифического связывания агентами захвата, 7) емкость чипа должна быть достаточной, чтобы обеспечить максимально полное представление протеома, подлежащего визуализации; Обильные белки подавляют обнаружение менее распространенных белков, таких как сигнальные молекулы и рецепторы, которые обычно представляют больший терапевтический интерес. [23]
См. также
[ редактировать ]- Импринтинг микроматриц и формирование рисунка поверхностной энергии
- Методы обнаружения без меток для белковых микрочипов
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Мелтон, Лиза (2004). «Белковые массивы: протеомика в мультиплексе» . Природа . 429 (6987): 101–107. Бибкод : 2004Natur.429..101M . дои : 10.1038/429101a . ISSN 0028-0836 . ПМИД 15129287 . S2CID 62775434 .
- ^ Марк Шена (2005). Белковые микрочипы . Джонс и Бартлетт Обучение. стр. 47–. ISBN 978-0-7637-3127-4 .
- ^ Марк Шена (2005). Белковые микрочипы . Джонс и Бартлетт Обучение. стр. 322–. ISBN 978-0-7637-3127-4 .
- ^ Митчелл, Питер (2002). «Взгляд на белковые микрочипы». Природная биотехнология . 20 (3): 225–229. дои : 10.1038/nbt0302-225 . ISSN 1087-0156 . ПМИД 11875416 . S2CID 5603911 .
- ^ Чанг Т.В. (декабрь 1983 г.). «Связывание клеток с матрицами различных антител, нанесенными на твердую поверхность». Дж. Иммунол. Методы . 65 (1–2): 217–23. дои : 10.1016/0022-1759(83)90318-6 . ПМИД 6606681 .
- ^ США 4591570 ; США 4829010 ; США 5100777 .
- ^ Холл, округ Колумбия; Птачек, Дж; Снайдер, М. (12 декабря 2012 г.). «Технология белковых микрочипов» . Мех. Стареющий Дев . 128 (1): 161–7. дои : 10.1016/j.mad.2006.11.021 . ПМК 1828913 . ПМИД 17126887 .
- ^ Талапатра, Анупам; Роуз, Ричард; Хардиман, Гэри (2002). «Белковые микрочипы: проблемы и перспективы». Фармакогеномика . 3 (4): 527–536. дои : 10.1517/14622416.3.4.527 . ISSN 1462-2416 . ПМИД 12164775 .
- ^ Калверт, Пол (2001). «Струйная печать материалов и устройств». Химия материалов . 13 (10): 3299–3305. дои : 10.1021/cm0101632 . ISSN 0897-4756 .
- ^ «ДНК-микрочипы: методы» . Arabidopsis.info. Архивировано из оригинала 28 августа 2008 года . Проверено 19 января 2013 г.
- ^ Шин, Д.С.; Ким, Д.Х.; Чанг, WJ; Ли, Ю.С. (30 сентября 2005 г.). «Комбинаторный твердофазный синтез пептидов и биоанализы» . Журнал биохимии и молекулярной биологии . 38 (5): 517–25. дои : 10.5483/bmbrep.2005.38.5.517 . ПМИД 16202229 .
- ^ Патент США 7674752 , Мингюэ Хэ и Майкл Джон Тауссиг, «Функциональные белковые массивы», опубликован 15 августа 2004 г., выдан 10 марта 2010 г., передан компании Discema Limited.
- ^ Он, М; Тауссиг, MJ (июнь 2001 г.). «Одноэтапное создание белковых массивов из ДНК путем бесклеточной экспрессии и иммобилизации in situ (метод PISA)» . Исследования нуклеиновых кислот . 29 (15): Е73–3. дои : 10.1093/нар/29.15.e73 . ПМЦ 55838 . ПМИД 11470888 .
- ^ Холл, округ Колумбия; Птачек, Дж; Снайдер, М. (2007). «Технология белковых микрочипов» . Мех. Стареющий Дев . 128 (1): 161–7. дои : 10.1016/j.mad.2006.11.021 . ПМЦ 1828913 . ПМИД 17126887 .
- ^ Купманн, Дж. О.; Блэкберн, Дж (2003). «Поверхность захвата с высоким сродством для белковых микрочипов, совместимых с матричной лазерной десорбцией / ионизацией». Быстрая связь в масс-спектрометрии . 17 (5): 455–62. Бибкод : 2003RCMS...17..455K . дои : 10.1002/rcm.928 . ПМИД 12590394 .
- ^ Блэкберн, Дж. М.; Шоко, А; Битон-Кемпен, Н. (2012). Миниатюрные анализы на основе микрочипов для химических протеомных исследований функции белков . Методы молекулярной биологии. Том. 800. стр. 133–62. дои : 10.1007/978-1-61779-349-3_10 . ISBN 978-1-61779-348-6 . ПМИД 21964787 .
- ^ Рэй, Сандипан; Мехта, Гунджан; Шривастава, Санджива (2010). «Методы обнаружения без меток для белковых микроматриц: перспективы, преимущества и проблемы» . Протеомика . 10 (4): 731–748. дои : 10.1002/pmic.200900458 . ISSN 1615-9861 . ПМК 7167936 . ПМИД 19953541 .
- ^ Го, В; Вилаплана, Л; Ханссон, Дж; Марко, П; ван дер Вейнгаарт, W (2020). «Иммуноанализы на тиол-еновой синтетической бумаге дают превосходный сигнал флуоресценции». Биосенсоры и биоэлектроника . 163 : 112279. doi : 10.1016/j.bios.2020.112279 . hdl : 10261/211201 . ПМИД 32421629 . S2CID 218688183 .
- ^ Уильямс, Ричард Дж.; Нарайанан, Нарасимхачари.; Касай, Гильермо А.; Липовска, Малгожата.; Перальта, Хосе Мауро; Цанг, Виктор CW; Стрековски, Лючан.; Патонай, Габор. (1994). «Прибор для обнаружения флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне в твердофазном иммуноанализе». Аналитическая химия . 66 (19): 3102–3107. дои : 10.1021/ac00091a018 . ISSN 0003-2700 . ПМИД 7978305 .
- ^ Декроп, Дебора (2017). «Одноэтапное импринтирование массивов фемтолитровых микролунок позволяет проводить цифровые биоанализы с аттомолярным пределом обнаружения». Прикладные материалы и интерфейсы ACS . 9 (12): 10418–10426. дои : 10.1021/acsami.6b15415 . ПМИД 28266828 .
- ^ Макбит, Дж; Шрайбер, С.Л. (8 сентября 2000 г.). «Печать белков в виде микрочипов для высокопроизводительного определения функций». Наука . 289 (5485): 1760–3. Бибкод : 2000Sci...289.1760M . дои : 10.1126/science.289.5485.1760 . ПМИД 10976071 . S2CID 27553611 .
- ^ Ангенендт, П; Глеклер, Дж; Собек, Дж; Лерах, Х; Кэхилл, ди-джей (15 августа 2003 г.). «Следующее поколение вспомогательных материалов для белковых микрочипов: оценка возможностей применения микрочипов с белками и антителами». Журнал хроматографии А. 1009 (1–2): 97–104. дои : 10.1016/s0021-9673(03)00769-6 . ПМИД 13677649 .
- ^ Фунг, Эрик Т; Туласираман, Ванита; Вайнбергер, Скот Р.; Далмассо, Энрике А. (2001). «Белковые биочипы для дифференциального профилирования». Современное мнение в области биотехнологии . 12 (1): 65–69. дои : 10.1016/S0958-1669(00)00167-1 . ISSN 0958-1669 . ПМИД 11167075 .