Репортерская система ГУС
Репортерная система GUS ( GUS : β-глюкуронидаза ) представляет собой систему репортерных генов , особенно полезную в молекулярной биологии растений. [ 1 ] и микробиология. [ 2 ] Доступны несколько видов анализа репортерного гена GUS , в зависимости от используемого субстрата. Термин «окрашивание GUS» относится к наиболее распространенному из них — гистохимическому методу.
Цель
[ редактировать ]Целью этого метода является анализ активности промотора транскрипции гена (с точки зрения экспрессии так называемого репортерного гена под регуляторным контролем этого промотора) либо количественно, включая некоторую меру активности, либо качественно ( включено или выключено) посредством визуализации его активности в различных клетках, тканях или органах. В этом методе используется ген uidA Escherichia coli , который кодирует фермент β-глюкуронидазу ; [ 3 ] этот фермент при инкубации со специфическими бесцветными или нефлуоресцентными субстратами может превращать их в стабильно окрашенные или флуоресцентные продукты. [ 4 ] Наличие цвета, индуцированного GUS, указывает на то, где ген активно экспрессировался. Таким образом, сильная активность промотора приводит к сильному окрашиванию, а слабая активность промотора вызывает меньшее окрашивание.
Ген uidA также может быть слит с интересующим геном, создавая слияние генов . Вставка гена uidA приведет к образованию GUS, который затем можно будет обнаружить с использованием различных глюкуронидов в качестве субстратов. [ 4 ]
Субстраты
[ редактировать ]Существуют различные возможные глюкурониды , которые можно использовать в качестве субстратов для β-глюкуронидазы, в зависимости от необходимого типа обнаружения ( гистохимическое , спектрофотометрическое , флуориметрическое ). Наиболее распространенным субстратом для гистохимического окрашивания GUS является 5-бром-4-хлор-3-индолилглюкуронид ( X-Gluc ). X-Gluc гидролизуется GUS с образованием продукта 5,5'-дибром-4,4'-дихлориндиго (diX-индиго). DiX-индиго станет синим, и его можно будет увидеть с помощью световой микроскопии. [ 5 ] Этот процесс аналогичен гидролизу X-гал бета -галактозидазой. [ 5 ] для производства синих клеток, как это обычно практикуется в анализах бактериальных репортерных генов.
Для других типов обнаружения обычными субстратами являются п-нитрофенил-β-D-глюкуронид для спектрофотометрического анализа и 4-метилумбеллиферил-бета-D-глюкуронид (MUG) для флуориметрического анализа. [ 6 ]
История
[ редактировать ]Система была первоначально разработана Ричардом Энтони Джефферсоном во время работы над докторской диссертацией. в Университете Колорадо в Боулдере . [ 7 ] работая в институте селекции растений Кембриджском Он адаптировал эту технику для использования с растениями , с 1985 по 1987 год. [ 1 ] С тех пор эту систему использовали тысячи лабораторий, что сделало ее одним из наиболее широко используемых инструментов в молекулярной биологии растений, о чем свидетельствуют тысячи цитат в научной литературе. [ 7 ]
Целевые организмы
[ редактировать ]Организм подходит для анализа GUS, если у него отсутствует естественная активность β-глюкуронидазы или если активность очень низкая ( фоновая активность). По этой причине этот анализ бесполезен для большинства позвоночных и многих моллюсков . [ 6 ] Поскольку активность GUS не обнаруживается у высших растений , мхов , водорослей , папоротников , грибов и большинства бактерий , [ 6 ] Этот анализ идеально подходит для изучения экспрессии генов в этих организмах и считается предпочтительным геном-репортером для науки о растениях.
Преимущества и ограничения
[ редактировать ]Для функционирования анализа GUS не требуется присутствия каких-либо кофакторов или ионов. Бета-глюкуронидаза может функционировать в широком диапазоне значений pH и довольно устойчива к термической инактивации. [ 8 ] Однако GUS подвержен ингибированию со стороны некоторых ионов тяжелых металлов, таких как Cu. 2+ и цинк 2+ .
Кроме того, интерпретация анализа ограничена перемещением диХ-индиго по клетке. DiX-indigo может связываться с липидами и диффундировать далеко от места активности фермента, что свидетельствует об отсутствии цитозольной локализации и неравномерности проникновения субстрата. Потенциально это может привести к неправильной интерпретации локализации белка GUS. [ 9 ] Несмотря на отсутствие клеточной локализации, хорошо наблюдалась ядерная локализация GUS. [ 10 ] Анализы GUS можно проводить в присутствии феррицианида калия, чтобы предотвратить распространение пятна. [ 5 ]
Другие репортерские системы
[ редактировать ]Система GUS — не единственная доступная генно-репортерная система для анализа активности промотора. Другие конкурирующие системы основаны, например, на люциферазе , GFP , бета-галактозидазе , хлорамфениколацетилтрансферазе (CAT), щелочной фосфатазе . Использование той или иной системы в основном зависит от интересующего организма, а также технологий визуализации и микроскопии, доступных лабораториям, проводящим исследования.
Другое использование
[ редактировать ]
Анализ GUS, как и другие системы репортерных генов, можно использовать для других видов исследований, помимо классического анализа активности промотора. Репортерные системы использовались для определения эффективности систем доставки генов, внутриклеточной локализации генного продукта, обнаружения взаимодействий белок-белок или белок-ДНК, эффективности сигналов инициации трансляции и успеха усилий по молекулярному клонированию.
Источники
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Джефферсон, РА ; Кавана, штат Техас; Беван, М.В. (1987). «Слияния GUS: β -глюкуронидаза как чувствительный и универсальный маркер слияния генов у высших растений» . Журнал ЭМБО . 6 (13): 3901–7. дои : 10.1002/j.1460-2075.1987.tb02730.x . ПМК 553867 . ПМИД 3327686 .
- ^ Ванде Брук, Энн; Ламбрехт, Марк; Вандерлейден, Джос (1998). «Хемотаксическая подвижность бактерий важна для инициации колонизации корней пшеницы Azospirillum brasilense » . Микробиология . 144 (9): 2599–606. дои : 10.1099/00221287-144-9-2599 . ПМИД 9782509 .
- ^ Бланко, К; Ритценталер, П; Мата-Гилсингер, М (1982). «Клонирование и эндонуклеазный рестрикционный анализ генов uidA и uidR в Escherichia coli K-12: определение направления транскрипции гена uidA » . Журнал бактериологии . 149 (2): 587–94. дои : 10.1128/JB.149.2.587-594.1982 . ПМК 216546 . ПМИД 6276362 .
- ^ Jump up to: а б Джефферсон, РА; Берджесс, С.М.; Хирш, Д. (1986). « β -глюкуронидаза из Escherichia coli как маркер слияния генов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 83 (22): 8447–51. Бибкод : 1986PNAS...83.8447J . дои : 10.1073/pnas.83.22.8447 . ПМЦ 386947 . ПМИД 3534890 .
- ^ Jump up to: а б с Гиварк, А.; Кайссар, Дж. К.; Азми, А.; Эльмаян, Т.; Шрики, Д.; Тепфер, М. (1 сентября 1996 г.). «Обнаружение in situ экспрессии репортерного гена thegus в трансгенных растениях: десять лет синих генов» . Трансгенные исследования . 5 (5): 281–288. дои : 10.1007/BF01968938 . ISSN 1573-9368 . S2CID 21151079 .
- ^ Jump up to: а б с Патент США 5 268 463
- ^ Jump up to: а б Cambia Веб-сайт организации : биография Ричарда А. Джефферсона. Архивировано 19 августа 2006 г. в Wayback Machine.
- ^ Джефферсон, Ричард А. (1 декабря 1987 г.). «Анализ химерных генов в растениях: система слияния генов GUS» . Репортер по молекулярной биологии растений . 5 (4): 387–405. дои : 10.1007/BF02667740 . ISSN 1572-9818 . S2CID 5619830 .
- ^ Кайсар, Жан-Клод; Гиварк, Энн; Рембур, Джеймс; Азми, Абделькрием; Шрики, Доминик (1 мая 1994 г.). «Ложные локализации микрокристаллов диХ-индиго, полученные с помощью гистохимического анализа GUS» . Трансгенные исследования . 3 (3): 176–181. дои : 10.1007/BF01973985 . ISSN 1573-9368 . S2CID 797978 .
- ^ Цитовский В.; Зупан, Дж.; Варник, Д.; Замбриски, П. (26 июня 1992 г.). «Ядерная локализация белка Agrobacterium VirE2 в растительных клетках» . Наука . 256 (5065): 1802–1805. Бибкод : 1992Sci...256.1802C . дои : 10.1126/science.1615325 . ISSN 0036-8075 . ПМИД 1615325 .