Блеб (клеточная биология)

В клеточной биологии пузырь ) представляет собой (или морда выпуклость плазматической мембраны клетки, характеризующуюся сферической, «блистерообразной», объемной морфологией. ^[2]^[3]^[4] Он характеризуется отделением цитоскелета от плазматической мембраны, разрушая внутреннюю структуру клетки, обеспечивая гибкость, необходимую клетке для разделения на отдельные выпуклости или карманы межклеточного матрикса. ^[4] Чаще всего пузырьки наблюдаются при апоптозе (запрограммированной гибели клеток), но они также наблюдаются при других неапоптозных функциях, включая апокринную секрецию (секрецию клеток путем распада части клетки). Блеббинг , или зейоз , — это образование пузырьков.

Формирование

Инициирование и расширение

Рост пузырей обусловлен внутриклеточным давлением (аномальный рост), создаваемым в цитоплазме , когда актиновая кора подвергается сокращениям актомиозина. ^[5] Нарушение взаимодействия мембраны-актина коры головного мозга ^[4] зависят от активности миозин-АТФазы ^[6] На инициацию пузырей влияют три основных фактора: высокое внутриклеточное давление, снижение количества линкерных белков кора-мембрана и разрушение актиновой коры. ^[7]^[8] Целостность связи между актиновой корой и мембраной зависит от того, насколько неповреждена кора и сколько белков связывают две структуры. ^[7]^[8] Когда эта целостность нарушена, дополнительное давление может привести к выпиранию мембраны из остальной части клетки. ^[7]^[8] Присутствия только одного или двух из этих факторов часто недостаточно для образования пузырей. ^[8] Образование пузырей также связано с увеличением сократимости миозина и локальным увеличением активности миозина. ^[7]^[8]

Образование пузырей может быть инициировано двумя путями: 1) через локальный разрыв коры или 2) через локальную отслойку коры от плазматической мембраны . ^[9] Это создает слабое место, через которое течет цитоплазма , что приводит к расширению выпуклости мембраны за счет увеличения площади поверхности за счет отрыва мембраны от коры, в течение которого уровень актина снижается. ^[5] Цитоплазматический поток обусловлен гидростатическим давлением внутри клетки. ^[10]^[3] Прежде чем пузырь сможет расшириться, давление должно вырасти настолько, чтобы достичь порога. ^[8] Этот порог представляет собой величину давления, необходимую для преодоления сопротивления плазматической мембраны деформации. ^[8]

Искусственная индукция

Образование пузырей было искусственно вызвано на нескольких лабораторных моделях клеток с использованием различных методов. ^[11] Вставив микропипетку клетку в клетку, можно быстро аспирировать до тех пор, пока разрушение связей кора-мембрана не приведет к образованию пузырей. ^[11] Разрыв связей кора-мембрана также был вызван лазерной абляцией и инъекцией препарата, деполимеризующего актин , что в обоих случаях в конечном итоге привело к образованию пузырей клеточной мембраны. ^[11] Было также показано, что искусственно повышенный уровень сократимости миозина вызывает образование пузырей в клетках. ^[11] некоторые вирусы, такие как поксвирус коровьей оспы , вызывают образование пузырьков в клетках, когда они связываются с поверхностными белками. Было показано, что ^[12] Хотя точный механизм еще не до конца понятен, этот процесс имеет решающее значение для эндоцитоза вириона и последующей инфекции. ^[12]

Клеточная функция

Апоптотическая функция

Блеббинг является одним из определенных признаков апоптоза . ^[6] Во время апоптоза (запрограммированной гибели клеток) цитоскелет клетки разрушается и мембрана выпячивается наружу. ^[13] Эти выпуклости могут отделиться от клетки, унося с собой часть цитоплазмы и стать известными как апоптотические пузырьки. ^[14]Фагоцитирующие клетки в конечном итоге потребляют эти фрагменты, и компоненты перерабатываются.

При апоптозе выделяют два типа пузырей. Первоначально образуются небольшие поверхностные пузырьки. На более поздних стадиях могут появиться более крупные, так называемые динамические пузырьки, которые могут нести более крупные фрагменты органелл, такие как более крупные части фрагментированного ядра апоптотической клетки . ^[15]

Функция миграции клеток

Наряду с ламеллиподиями важную роль в миграции клеток играют пузыри . ^[7]^[11] Мигрирующие клетки способны поляризовать образование пузырей, поэтому пузыри возникают только на переднем крае клетки. ^[7]^[11] Двумерная движущаяся клетка способна использовать адгезивные молекулы для усиления сцепления с окружающей средой, в то время как на переднем крае образуются пузырьки. ^[7]^[11] При формировании пузыря центр масс клетки смещается вперед и осуществляется общее движение цитоплазмы. ^[7] Также известно, что клетки совершают трехмерное движение на основе пузырьков посредством процесса, называемого «дымоходом». ^[7]^[11] В этом процессе клетки оказывают давление на верхний и нижний субстраты, сжимая себя, вызывая рост пузырька на переднем крае и движение клетки вперед. ^[7]^[11]

Апокринная секреция

Апокринная секреция — это способ секреции экзокринных желез , при котором секреторные клетки накапливают материал на своих апикальных концах, а затем этот материал отпочковывается от клеток. Во многих аспектах это можно рассматривать как апоптоз части клетки. Процесс секреции обычно начинается с накопления секреторных гранул в апикальном пузырьке (также называемом « апикальным рылом ») клетки, который впоследствии распадается с высвобождением секреторных гранул в просвет.

Апокринная секреция
Гистология апокринных клеток, окраска H&E.

Разные функции

Блеббинг также выполняет важные функции в других клеточных процессах, включая передвижение клеток, деление клеток и физические или химические стрессы. Пузыри наблюдались в культивируемых клетках на определенных стадиях клеточного цикла. Эти пузырьки используются для передвижения клеток в эмбриогенезе . ^[16] Типы пузырей сильно различаются, включая различия в скорости роста, размере, содержимом и содержании актина . Он также играет важную роль во всех пяти разновидностях некроза , как правило, вредного процесса. Однако клеточные органеллы не распространяются в некротические пузыри.

Торможение

Химическая структура блеббистатина ^[17]

В 2004 году было показано, что химическое вещество, известное как блеббистатин, ингибирует образование пузырей. ^[18] Этот агент был обнаружен при скрининге низкомолекулярных ингибиторов немышечного миозина IIA . ^[18]Блеббистатин аллостерически ингибирует миозин II путем связывания вблизи сайта связывания актина и сайта связывания АТФ. ^[19] Это взаимодействие стабилизирует форму миозина II, которая не связана с актином, тем самым снижая сродство миозина к актину . ^[18]^[19]^[20]^[21] Влияя на функцию миозина, блеббистатин изменяет сократительные силы, которые воздействуют на границу раздела цитоскелет -мембрана, и предотвращает нарастание внутриклеточного давления, необходимого для образования пузырей. ^[8]^[18]^[19]^[20]^[21] Блеббистатин исследовался на предмет его потенциального медицинского применения для лечения фиброза , рака и повреждений нервов . ^[19] Однако известно, что блеббистатин цитотоксичен , светочувствителен и флуоресцентен , что приводит к разработке новых производных для решения этих проблем. ^[19] Некоторые известные производные включают азидоблеббистатин, пара -нитроблеббистатин и пара -аминоблеббистатин. ^[19]

Ссылки

^ Смит А., Паркс М.А., Аткин-Смит Г.К., Тиксейра Р., Пун И.К. (2017). «Разборка клетки при апоптозе» . Викижурнал медицины . 4 (1). дои : 10.15347/wjm/2017.008 .
^ Понувей Г.А., Dash PR (01 декабря 2016 г.). «Формирование пузырей в линии раковых клеток фибросаркомы человека HT1080 положительно регулируется липидной сигнальной фосфолипазой D2 (PLD2)» . Достижения в области наук о жизни . 10 (2): 125–135. дои : 10.1016/j.als.2016.11.001 . ISSN 2078-1520 .
^ Jump up to: ^а ^б Тиневес Дж. Ю., Шульце Ю., Сальбре Г., Рёнш Дж., Джоанни Дж. Ф., Палух Э. (ноябрь 2009 г.). «Роль коркового напряжения в росте пузырьков» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 106 (44): 18581–18586. Бибкод : 2009PNAS..10618581T . дои : 10.1073/pnas.0903353106 . ПМЦ 2765453 . ПМИД 19846787 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Факлер О.Т., Гросс Р. (июнь 2008 г.). «Подвижность клеток посредством пузырей плазматической мембраны» . Журнал клеточной биологии . 181 (6): 879–884. дои : 10.1083/jcb.200802081 . ПМЦ 2426937 . ПМИД 18541702 .
^ Jump up to: ^а ^б Чаррас GT (сентябрь 2008 г.). «Краткая история блефа». Журнал микроскопии . 231 (3): 466–478. дои : 10.1111/j.1365-2818.2008.02059.x . ПМИД 18755002 . S2CID 205341971 .
^ Jump up to: ^а ^б Викман Г.Р., Джулиан Л., Мардилович К., Шумахер С., Манро Дж., Рат Н. и др. (октябрь 2013 г.). «Пузыри, образующиеся в результате актин-миозинового сокращения во время апоптоза, высвобождают белки молекулярной структуры, связанные с повреждением, до того, как произойдет вторичный некроз» . Смерть клеток и дифференцировка . 20 (10): 1293–1305. дои : 10.1038/cdd.2013.69 . ПМЦ 3770329 . ПМИД 23787996 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж Чаррас Г., Палух Э. (сентябрь 2008 г.). «Пузыри прокладывают путь: как мигрировать без ламеллиподий». Обзоры природы. Молекулярно-клеточная биология . 9 (9): 730–736. дои : 10.1038/nrm2453 . ПМИД 18628785 . S2CID 36022784 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час Палух Е.К., Раз Э (октябрь 2013 г.). «Роль и регуляция пузырей в миграции клеток» . Современное мнение в области клеточной биологии . Клеточная адгезия и миграция. 25 (5): 582–590. дои : 10.1016/j.ceb.2013.05.005 . ПМК 3989058 . ПМИД 23786923 .
^ Чаррас Г., Палух Э. (сентябрь 2008 г.). «Пузыри прокладывают путь: как мигрировать без ламеллиподий». Обзоры природы. Молекулярно-клеточная биология . 9 (9): 730–736. дои : 10.1038/nrm2453 . ПМИД 18628785 . S2CID 36022784 .
^ Чаррас Г.Т., Ярроу Дж.К., Хортон М.А., Махадеван Л., Митчисон Т.Дж. (май 2005 г.). «Неуравновешенность гидростатического давления в блеббирующих клетках» . Природа . 435 (7040): 365–369. Бибкод : 2005Natur.435..365C . дои : 10.1038/nature03550 . ПМЦ 1564437 . ПМИД 15902261 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Палух Е.К., Раз Э (октябрь 2013 г.). «Роль и регуляция пузырей в миграции клеток» . Современное мнение в области клеточной биологии . Клеточная адгезия и миграция. 25 (5): 582–590. дои : 10.1016/j.ceb.2013.05.005 . ПМК 3989058 . ПМИД 23786923 .
^ Jump up to: ^а ^б Мерсер Дж., Хелениус А. (апрель 2008 г.). «Вирус осповакцины использует макропиноцитоз и апоптотическую мимикрию для проникновения в клетки-хозяева». Наука . 320 (5875): 531–535. Бибкод : 2008Sci...320..531M . дои : 10.1126/science.1155164 . ПМИД 18436786 . S2CID 41898225 .
^ Вермюлен К., Ван Бокстале Д.Р., Бернеман З.Н. (октябрь 2005 г.). «Апоптоз: механизмы и значимость при раке». Анналы гематологии . 84 (10): 627–639. дои : 10.1007/s00277-005-1065-x . ПМИД 16041532 . S2CID 26936920 .
^ ван дер Пол Э., Бёинг А.Н., Гул Э.Л., Ньюланд Р. (январь 2016 г.). «Последние разработки в номенклатуре, наличии, изоляции, обнаружении и клиническом влиянии внеклеточных везикул» . Журнал тромбозов и гемостаза . 14 (1): 48–56. дои : 10.1111/jth.13190 . ПМИД 26564379 .
^ Тиксейра Р., Карузо С., Паоне С., Бакстер А.А., Аткин-Смит Г.К., Хьюлетт М.Д., Пун И.К. (март 2017 г.). «Определение морфологических особенностей и продуктов разборки клеток при апоптозе». Апоптоз . 22 (3): 475–477. дои : 10.1007/s10495-017-1345-7 . ПМИД 28102458 . S2CID 34648758 .
^ Баррос Л.Ф., Канасеки Т., Сабиров Р., Моришима С., Кастро Дж., Биттнер С.Х. и др. (июнь 2003 г.). «Апоптотические и некротические пузырьки в эпителиальных клетках имеют одинаковый диаметр шейки, но разную зависимость от киназы» . Смерть клеток и дифференцировка . 10 (6): 687–697. дои : 10.1038/sj.cdd.4401236 . ПМИД 12761577 .
^ Optopharma (03 июля 2017 г.), английский: 2D-структура блеббистатина , получено 23 ноября 2021 г.
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Лимуз Дж., Стрейт А.Ф., Митчисон Т., Селлерс-младший (2004). «Специфика блеббистатина, ингибитора миозина II». Журнал исследований мышц и подвижности клеток . 25 (4–5): 337–341. дои : 10.1007/s10974-004-6060-7 . ПМИД 15548862 . S2CID 22355306 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Раушер АА, Гимеси М, Ковач М, Малнаси-Чизмадиа А (сентябрь 2018 г.). «Нацеливание на миозин производными блеббистатина: оптимизация и фармакологический потенциал». Тенденции биохимических наук . 43 (9): 700–713. дои : 10.1016/j.tibs.2018.06.006 . ПМИД 30057142 . S2CID 51864413 .
^ Jump up to: ^а ^б Стрейт А.Ф., Чунг А., Лимуз Дж., Чен И., Вествуд, Нью-Джерси, Селлерс-младший, Митчисон Т.Дж. (март 2003 г.). «Анализ временного и пространственного контроля цитокинеза с помощью ингибитора миозина II». Наука . 299 (5613): 1743–1747. Бибкод : 2003Sci...299.1743S . дои : 10.1126/science.1081412 . ПМИД 12637748 . S2CID 38625401 .
^ Jump up to: ^а ^б Ковач М., Тот Дж., Хетеньи К., Малнаси-Чизмадиа А., Селлерс-младший (август 2004 г.). «Механизм ингибирования блеббистатином миозина II» . Журнал биологической химии . 279 (34): 35557–35563. дои : 10.1074/jbc.M405319200 . hdl : 10831/92817 . ПМИД 15205456 .

Дальнейшее чтение

Чаррас Г.Т., Кофлин М., Митчисон Т.Дж., Махадеван Л. (март 2008 г.). «Жизнь и времена клеточного пузыря» . Биофизический журнал . 94 (5): 1836–1853. Бибкод : 2008BpJ....94.1836C . дои : 10.1529/biophysj.107.113605 . ПМК 2242777 . ПМИД 17921219 .
Чаррас Г.Т., Ху С.К., Кофлин М., Митчисон Т.Дж. (ноябрь 2006 г.). «Повторная сборка сократительной актиновой коры в клеточных пузырях» . Журнал клеточной биологии . 175 (3): 477–490. дои : 10.1083/jcb.200602085 . ПМК 2064524 . ПМИД 17088428 .
Дай Дж., член парламента Шитца (декабрь 1999 г.). «Формирование мембранных связок из блеббирующих клеток» . Биофизический журнал . 77 (6): 3363–3370. Бибкод : 1999BpJ....77.3363D . дои : 10.1016/S0006-3495(99)77168-7 . ПМК 1300608 . ПМИД 10585959 .
Препарат останавливает моторный белок и проливает свет на деление клеток - ФОКУС 21 марта 2003 г. Проверено 8 апреля 2008 г.
Хагманн Дж., Бургер М.М., Даган Д. (июнь 1999 г.). «Регуляция пузырения плазматической мембраны цитоскелетом». Журнал клеточной биохимии . 73 (4): 488–499. doi : 10.1002/(SICI)1097-4644(19990615)73:4<488::AID-JCB7>3.0.CO;2-P . ПМИД 10733343 . S2CID 24190801 .

Внешние ссылки

[1] Смит А., Паркс М.А., Аткин-Смит Г.К., Тиксейра Р., Пун И.К. (2017). «Разборка клетки при апоптозе» . Викижурнал медицины . 4 (1). дои : 10.15347/wjm/2017.008 .

[2] Понувей Г.А., Dash PR (01 декабря 2016 г.). «Формирование пузырей в линии раковых клеток фибросаркомы человека HT1080 положительно регулируется липидной сигнальной фосфолипазой D2 (PLD2)» . Достижения в области наук о жизни . 10 (2): 125–135. дои : 10.1016/j.als.2016.11.001 . ISSN 2078-1520 .

[:7-3] Jump up to: ^а ^б Тиневес Дж. Ю., Шульце Ю., Сальбре Г., Рёнш Дж., Джоанни Дж. Ф., Палух Э. (ноябрь 2009 г.). «Роль коркового напряжения в росте пузырьков» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 106 (44): 18581–18586. Бибкод : 2009PNAS..10618581T . дои : 10.1073/pnas.0903353106 . ПМЦ 2765453 . ПМИД 19846787 .

[:0-4] Jump up to: ^а ^б ^с Факлер О.Т., Гросс Р. (июнь 2008 г.). «Подвижность клеток посредством пузырей плазматической мембраны» . Журнал клеточной биологии . 181 (6): 879–884. дои : 10.1083/jcb.200802081 . ПМЦ 2426937 . ПМИД 18541702 .

[A_short_history_of_blebbing-5] Jump up to: ^а ^б Чаррас GT (сентябрь 2008 г.). «Краткая история блефа». Журнал микроскопии . 231 (3): 466–478. дои : 10.1111/j.1365-2818.2008.02059.x . ПМИД 18755002 . S2CID 205341971 .

[:1-6] Jump up to: ^а ^б Викман Г.Р., Джулиан Л., Мардилович К., Шумахер С., Манро Дж., Рат Н. и др. (октябрь 2013 г.). «Пузыри, образующиеся в результате актин-миозинового сокращения во время апоптоза, высвобождают белки молекулярной структуры, связанные с повреждением, до того, как произойдет вторичный некроз» . Смерть клеток и дифференцировка . 20 (10): 1293–1305. дои : 10.1038/cdd.2013.69 . ПМЦ 3770329 . ПМИД 23787996 .

[:02-7] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж Чаррас Г., Палух Э. (сентябрь 2008 г.). «Пузыри прокладывают путь: как мигрировать без ламеллиподий». Обзоры природы. Молекулярно-клеточная биология . 9 (9): 730–736. дои : 10.1038/nrm2453 . ПМИД 18628785 . S2CID 36022784 .

[:12-8] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час Палух Е.К., Раз Э (октябрь 2013 г.). «Роль и регуляция пузырей в миграции клеток» . Современное мнение в области клеточной биологии . Клеточная адгезия и миграция. 25 (5): 582–590. дои : 10.1016/j.ceb.2013.05.005 . ПМК 3989058 . ПМИД 23786923 .

[9] Чаррас Г., Палух Э. (сентябрь 2008 г.). «Пузыри прокладывают путь: как мигрировать без ламеллиподий». Обзоры природы. Молекулярно-клеточная биология . 9 (9): 730–736. дои : 10.1038/nrm2453 . ПМИД 18628785 . S2CID 36022784 .

[10] Чаррас Г.Т., Ярроу Дж.К., Хортон М.А., Махадеван Л., Митчисон Т.Дж. (май 2005 г.). «Неуравновешенность гидростатического давления в блеббирующих клетках» . Природа . 435 (7040): 365–369. Бибкод : 2005Natur.435..365C . дои : 10.1038/nature03550 . ПМЦ 1564437 . ПМИД 15902261 .

[:14-11] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Палух Е.К., Раз Э (октябрь 2013 г.). «Роль и регуляция пузырей в миграции клеток» . Современное мнение в области клеточной биологии . Клеточная адгезия и миграция. 25 (5): 582–590. дои : 10.1016/j.ceb.2013.05.005 . ПМК 3989058 . ПМИД 23786923 .

[:2-12] Jump up to: ^а ^б Мерсер Дж., Хелениус А. (апрель 2008 г.). «Вирус осповакцины использует макропиноцитоз и апоптотическую мимикрию для проникновения в клетки-хозяева». Наука . 320 (5875): 531–535. Бибкод : 2008Sci...320..531M . дои : 10.1126/science.1155164 . ПМИД 18436786 . S2CID 41898225 .

[13] Вермюлен К., Ван Бокстале Д.Р., Бернеман З.Н. (октябрь 2005 г.). «Апоптоз: механизмы и значимость при раке». Анналы гематологии . 84 (10): 627–639. дои : 10.1007/s00277-005-1065-x . ПМИД 16041532 . S2CID 26936920 .

[J_of_T-14] ван дер Пол Э., Бёинг А.Н., Гул Э.Л., Ньюланд Р. (январь 2016 г.). «Последние разработки в номенклатуре, наличии, изоляции, обнаружении и клиническом влиянии внеклеточных везикул» . Журнал тромбозов и гемостаза . 14 (1): 48–56. дои : 10.1111/jth.13190 . ПМИД 26564379 .

[pmid28102458-15] Тиксейра Р., Карузо С., Паоне С., Бакстер А.А., Аткин-Смит Г.К., Хьюлетт М.Д., Пун И.К. (март 2017 г.). «Определение морфологических особенностей и продуктов разборки клеток при апоптозе». Апоптоз . 22 (3): 475–477. дои : 10.1007/s10495-017-1345-7 . ПМИД 28102458 . S2CID 34648758 .

[16] Баррос Л.Ф., Канасеки Т., Сабиров Р., Моришима С., Кастро Дж., Биттнер С.Х. и др. (июнь 2003 г.). «Апоптотические и некротические пузырьки в эпителиальных клетках имеют одинаковый диаметр шейки, но разную зависимость от киназы» . Смерть клеток и дифференцировка . 10 (6): 687–697. дои : 10.1038/sj.cdd.4401236 . ПМИД 12761577 .

[17] Optopharma (03 июля 2017 г.), английский: 2D-структура блеббистатина , получено 23 ноября 2021 г.

[:3-18] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Лимуз Дж., Стрейт А.Ф., Митчисон Т., Селлерс-младший (2004). «Специфика блеббистатина, ингибитора миозина II». Журнал исследований мышц и подвижности клеток . 25 (4–5): 337–341. дои : 10.1007/s10974-004-6060-7 . ПМИД 15548862 . S2CID 22355306 .

[:4-19] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Раушер АА, Гимеси М, Ковач М, Малнаси-Чизмадиа А (сентябрь 2018 г.). «Нацеливание на миозин производными блеббистатина: оптимизация и фармакологический потенциал». Тенденции биохимических наук . 43 (9): 700–713. дои : 10.1016/j.tibs.2018.06.006 . ПМИД 30057142 . S2CID 51864413 .

[:5-20] Jump up to: ^а ^б Стрейт А.Ф., Чунг А., Лимуз Дж., Чен И., Вествуд, Нью-Джерси, Селлерс-младший, Митчисон Т.Дж. (март 2003 г.). «Анализ временного и пространственного контроля цитокинеза с помощью ингибитора миозина II». Наука . 299 (5613): 1743–1747. Бибкод : 2003Sci...299.1743S . дои : 10.1126/science.1081412 . ПМИД 12637748 . S2CID 38625401 .

[:6-21] Jump up to: ^а ^б Ковач М., Тот Дж., Хетеньи К., Малнаси-Чизмадиа А., Селлерс-младший (август 2004 г.). «Механизм ингибирования блеббистатином миозина II» . Журнал биологической химии . 279 (34): 35557–35563. дои : 10.1074/jbc.M405319200 . hdl : 10831/92817 . ПМИД 15205456 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]

[21]