Аллель-специфический олигонуклеотид
Аллель -специфический олигонуклеотид ( АСО ) представляет собой короткий участок синтетической ДНК, комплементарный последовательности вариабельной целевой ДНК. Он действует как зонд на наличие мишени в Саузерн-блот -анализе или, что чаще, в более простом дот-блот -анализе. Это распространенный инструмент, используемый в генетическом тестировании , судебно-медицинской экспертизе и исследованиях в области молекулярной биологии .
ASO обычно представляет собой олигонуклеотид 15–21 нуклеотидное основание длиной . Он разработан (и используется) таким образом, что делает его специфичным только для одной версии или аллели тестируемой ДНК. [1] Длина ASO, из какой цепи она выбрана, а также условия, при которых она связывается с целевой ДНК (и отмывается от нее) — все это играет роль в ее специфичности. Эти зонды обычно могут быть разработаны для обнаружения разницы всего в 1 основание в генетической последовательности мишени, что является базовой способностью в анализе однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), что важно для анализа генотипа и проекта «Геном человека» . Чтобы быть обнаруженным после того, как АСО связалась с мишенью, его необходимо пометить радиоактивной, ферментативной или флуоресцентной меткой. использует Технология анализа метилирования Illumina преимущества ASO для обнаружения разницы в одной паре оснований (цитозин и тимин) для измерения метилирования в определенном сайте CpG.
Пример
[ редактировать ]
Заболевание человека серповидноклеточной анемией вызвано генетической мутацией кодона гемоглобина шестой аминокислоты белка крови бета- . Нормальная последовательность ДНК GAG кодирует аминокислоту глутамат , тогда как мутация заменяет средний аденин на тимин , что приводит к последовательности GTG (GUG в мРНК ). Эта измененная последовательность заменяет валин в конечном белке, искажая его структуру.
Чтобы проверить наличие мутации в образце ДНК, будет синтезирован зонд ASO, комплементарный измененной последовательности. [2] здесь обозначено буквой «S». В качестве контроля будет синтезирован другой ASO для нормальной последовательности «А». Каждый ASO полностью комплементарен своей целевой последовательности (и будет прочно связываться), но имеет одно несовпадение с нецелевым аллелем (что приводит к более слабому взаимодействию). На первой диаграмме показано, как зонд «S» полностью дополняет цель «S» (вверху), но частично не соответствует цели «А» (внизу).
Сегмент генов бета-гемоглобина в образце ДНК будет амплифицироваться с помощью ПЦР, а полученные продукты наноситься на дублирование опорных мембран в виде дот-блоттинга . Нити ДНК образца разделяются щелочью, и каждый зонд ASO наносится на отдельный блот. После гибридизации используется протокол промывки, который позволяет различать полностью комплементарные и несовпадающие гибриды. Несовпадающие ASO смываются с блотов, а совпавшие ASO (и их метки) остаются.
На второй диаграмме на каждый из двух блотов нанесены шесть образцов амплифицированной ДНК. Обнаружение метки ASO, оставшейся после мытья, позволяет напрямую считывать генотип образцов , каждый из которых содержит две копии гена бета-гемоглобина. Образцы 1 и 4 имеют только нормальный аллель «А», тогда как образцы 3 и 5 имеют аллели «А» и «S» (и, следовательно, являются гетерозиготными носителями этой рецессивной мутации ). Образцы 2 и 6 имеют только аллель «S» и могут быть подвержены заболеванию. Небольшая степень «перекрестной гибридизации» является типичной и учитывается в процессе интерпретации окончательных результатов.
Альтернативы
[ редактировать ]ASO-анализ — лишь один из методов, используемых для выявления генетических полиморфизмов. Прямое секвенирование ДНК используется для первоначальной характеристики мутации, но оно слишком трудоемко для рутинного скрининга. Более ранний метод, полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (ПДРФ), не требовал предварительного знания изменения последовательности, но требовал, чтобы мутация повлияла на сайт расщепления рестрикционного фермента . RFLP-анализ был на короткое время адаптирован к использованию олигонуклеотидных зондов . [3] но этот метод был быстро вытеснен ASO-анализом амплифицированной ДНК полимеразной цепной реакции (ПЦР). Сама методика ПЦР была адаптирована для обнаружения полиморфизмов, например, аллель-специфическая ПЦР . Однако простота и универсальность комбинированного метода ПЦР/ASO привели к его дальнейшему использованию, в том числе с нерадиоактивными метками, а также в формате «обратного дот-блоттинга», когда зонды ASO связываются с мембраной и амплифицированным образцом ДНК. используется для гибридизации .
История
[ редактировать ]Впервые использование синтетических олигонуклеотидов в качестве специфических зондов для вариаций генетических последовательностей было предложено Р. Брюсом Уоллесом, работающим в Национальном медицинском центре «Город надежды» в Дуарте, Калифорния . В 1979 году Уоллес и его коллеги сообщили об использовании зондов ASO для обнаружения вариаций одноцепочечного бактериального вируса. [4] а позже применил эту технику к клонированным человеческим генам. В 1983 году [5] и 1985 г. [2] Лаборатория Уоллеса сообщила об обнаружении мутации серповидноклеточной анемии в образцах цельной геномной ДНК, хотя этому применению препятствовало небольшое количество метки, которую мог нести ASO. [2]
К счастью, в 1985 году также сообщалось о ПЦР — методе значительной амплификации определенного сегмента ДНК. [3] Менее чем за год ПЦР был совмещен с анализом ASO. [6] Эта комбинация решила проблему мечения ASO, поскольку количество целевой ДНК можно было амплифицировать более чем в миллион раз. Кроме того, специфичность самого процесса ПЦР может быть добавлена к специфичности зондов ASO, что значительно снижает проблему ложного связывания ASO с нецелевыми последовательностями. Комбинация была достаточно специфичной, чтобы ее можно было использовать в простом дот-блоттинге , избегая трудоемкого и неэффективного метода Саузерн-блоттинга .
Другое использование
[ редактировать ]ASO-PCR также может использоваться для выявления минимальной остаточной болезни при раке крови, например, при множественной миеломе . [7]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Монга, Иша; Куреши, Абид; Тхакур, Нишант; Гупта, Амит Кумар; Кумар, Манодж (сентябрь 2017 г.). «ASPsiRNA: ресурс ASP-siRNA, обладающий терапевтическим потенциалом в отношении генетических нарушений человека, и алгоритм прогнозирования их ингибирующей эффективности» . Г3 . 7 (9): 2931–2943. дои : 10.1534/g3.117.044024 . ПМК 5592921 . ПМИД 28696921 .
- ^ Jump up to: а б с Студенски А.Б., Коннер Б.Дж., Импрайм К.С., Теплиц Р.Л. и Уоллес Р.Б. «Дискриминация генов бета-А, бета-S и бета-С-глобина человека с использованием аллель-специфичных олигонуклеотидных гибридизационных зондов». Am J Hum Genet vol. 37 (1), стр. 42–51 (1985).
- ^ Jump up to: а б Сайки, РК; Шарф С; Фалуна Ф; Муллис КБ; Рог GT; Эрлих Х.А.; Арнгейм Н. (20 декабря 1985 г.). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии» . Наука . 230 (4732): 1350–4. Бибкод : 1985Sci...230.1350S . дои : 10.1126/science.2999980 . ПМИД 2999980 . Архивировано из оригинала 19 декабря 2008 года.
- ^ Уоллес, РБ; Шаффер, Дж; Мерфи, РФ; Боннер, Дж; Хиросе, Т; Итакура, К. (1979). «Гибридизация синтетических олигодезоксирибонуклеотидов с ДНК Phi-X 174: эффект несоответствия одной пары оснований» . Исследования нуклеиновых кислот . 6 (11): 3543–3558. дои : 10.1093/нар/6.11.3543 . ПМК 327955 . ПМИД 158748 .
- ^ Коннер Б.Дж., Рейес А.А., Морин С., Итакура К., Теплиц Р.Л. и Уоллес Р.Б. «Обнаружение аллели бета S-глобина серповидноклеточных клеток путем гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами». Proc Natl Acad Sci США. том. 80 (1), стр. 278–282 (1983).
- ^ Сайки Р.К., Бугаван Т.Л., Хорн Г.Т., Муллис К.Б. и Эрлих Х.Э. «Анализ ферментативно амплифицированного бета-глобина и ДНК HLA-DQ с помощью аллель-специфичных олигонуклеотидных зондов» Nature vol. 324 (6093), стр. 163–166 (1986).
- ^ Каерс, Джо; Гардере, Лоран; Кортюм, К. Мартин; О'Дуайер, Майкл Э.; ван де Донк, Нильс WCJ; Биндер, Маша; Долд, Сандра Мария; Гей, Франческа; Корр, Джилл; Беген, Ив; Людвиг, Хайнц (ноябрь 2018 г.). «Рекомендации Европейской сети миеломы по инструментам диагностики и мониторинга множественной миеломы: что использовать и когда» . Гематологическая . 103 (11): 1772–1784. дои : 10.3324/haematol.2018.189159 . ISSN 0390-6078 . ПМК 6278986 . ПМИД 30171031 .