Бесклеточная система
Бесклеточная система — это инструмент in vitro, широко используемый для изучения биологических реакций , происходящих внутри клеток, помимо полноклеточной системы, что позволяет уменьшить сложные взаимодействия, обычно обнаруживаемые при работе в целой клетке. [ 1 ] Субклеточные фракции можно выделить с помощью ультрацентрифугирования, чтобы получить молекулярный механизм, который можно использовать в реакциях в отсутствие многих других клеточных компонентов. [ 2 ] Внутренние части эукариотических и прокариотических клеток использовались для создания этих упрощенных сред. [ 3 ] [ 4 ] Эти системы позволили появиться бесклеточной синтетической биологии , обеспечивая контроль над тем, какая реакция исследуется, а также ее выход, и уменьшая соображения, которые в противном случае возникали бы при работе с более чувствительными живыми клетками. [ 5 ]
Типы
[ редактировать ]Бесклеточные системы можно разделить на две основные категории: на основе клеточных экстрактов, которые удаляют компоненты из целой клетки для наружного использования, и на основе очищенных ферментов, в которых используются очищенные компоненты молекул, которые, как известно, участвуют в данном процессе. . [ 6 ] [ 7 ] Тип, основанный на клеточном экстракте, подвержен таким проблемам, как быстрая деградация компонентов за пределами хозяина, как показано в исследовании Kitaoka et al. где бесклеточная система трансляции, основанная на Escherichia coli ( E. coli ) типа, основанная на клеточном экстракте, приводила к очень быстрой деградации матрицы мРНК и приводила к остановке синтеза белка . [ 8 ]
Подготовка
[ редактировать ]Методы приготовления различаются в зависимости от ситуации обоих типов бесклеточных систем.
На основе клеточного экстракта
[ редактировать ]Нобелевской премии Лауреат Эдуард Бюхнер, возможно, был первым, кто представил бесклеточную систему с использованием дрожжевых экстрактов, но с тех пор были найдены альтернативные источники. [ 9 ] [ 10 ] E. coli , зародыши пшеницы и кролика ретикулоциты оказались полезными для создания бесклеточных систем путем экстракции их внутренних компонентов. [ 3 ] [ 11 ] Экстракты E. coli 30S были получены, например, путем измельчения бактерий с оксидом алюминия с последующей очисткой. [ 12 ] Точно так же зародыши пшеницы измельчали с промытым кислотой песком или стеклянной пудрой, чтобы открыть клеточные мембраны . [ 13 ] [ 14 ] Ретикулоциты кролика лизировали в растворе MgCl 2 и экстракт отфильтровывали от мембран центрифугированием. [ 15 ]
Использование
[ редактировать ]Бесклеточные биосистемы биотрансформации синтетического пути предлагаются в качестве новой недорогой платформы биопроизводства по сравнению с микробной ферментацией , используемой на протяжении тысячелетий. [ 3 ] [ 16 ] Бесклеточные биосистемы имеют ряд преимуществ, подходящих для промышленного применения: [ 6 ]
- Очень высокие выходы продукта обычно достигаются без образования побочных продуктов или синтеза клеточной массы. Например, при синтетическом ферментативном пути, в результате реакции с крахмалом и водой.
- C 6 H 10 O 5 (ж) + 7 H 2 O (ж) → 12 H 2 (г) + 6 CO 2 (г),
- почти 12 H 2 было произведено глюкозы на единицу полисахаридов и воды , что в три раза превышает теоретический выход лучших анаэробных продуцирующих водород микроорганизмов, . [ 17 ]
- Биосистемы in vitro могут осуществлять некоторые биологические реакции, которые раньше не могли реализовать живые микробы или химические катализаторы . Например, целлюлоза, связанная бета-1,4-глюкозидной связью, может быть преобразована в крахмал, связанный альфа-1,4-глюкозидной связью, с помощью смеси внутриклеточных и внеклеточных ферментов в одном реакционном контейнере. [ 18 ]
- Ферментативные системы без барьера клеточной мембраны обычно имеют более высокую скорость реакции , чем микробные системы. Например, ферментативные топливные элементы обычно имеют гораздо более высокую выходную мощность, чем микробные топливные элементы. [ 19 ]
- Ферментные коктейли лучше переносят токсичные соединения, чем микроорганизмы. [ 20 ]
- Смеси ферментов обычно работают в широких условиях реакции, таких как высокая температура, низкий pH , присутствие органических растворителей или ионных жидкостей . [ 16 ]
Синтез белка
[ редактировать ]Биосистемы in vitro можно легко контролировать и получать к ним доступ без мембран. [ 16 ] Примечательно, что в работе, приведшей к Нобелевской премии, в эксперименте Ниренберга и Маттеи использовалась бесклеточная система на основе клеточного экстракта для включения выбранных аминокислот , помеченных радиоактивно, в синтезированные белки с 30S, экстрагированные из E. coli . [ 12 ] [ 21 ] Более поздние исследования, такие как исследование, проведенное Спирином и соавт. с прокариотической и эукариотической версией своей бесклеточной системы трансляции, также синтезировали белки с увеличенным производством, используя такие методы, как непрерывный поток, для добавления материалов и удаления продуктов. [ 22 ] Благодаря таким достижениям в области урожайности были расширены области применения, такие как синтез слитых белков, которые потенциально могут служить вакцинами против В-клеточных лимфом . [ 23 ] Кроме того, бесклеточный синтез белка становится новой альтернативой быстрому синтезу белка. [ 6 ]
Метаболические манипуляции
[ редактировать ]Инженерия метаболических процессов была достигнута с помощью бесклеточных систем. [ 24 ] [ 10 ] [ 3 ] Бухара и др. , например, смогли использовать экстракты гликолитической сети, состоящие из ферментов E. coli , которые продуцируют дигидроксиацетонфосфат , для анализа в реальном времени концентраций метаболитов при изменении уровней ферментов, что привело к оптимальному производству дигидроксиацетонфосфата . [ 25 ] Кроме того, Кэлхун и Шварц смогли использовать промежуточный гликолитический продукт в качестве топлива для бесклеточной системы, что позволило получить относительно недорогое производство АТФ по сравнению с использованием реагентов в реакциях фосфоенолпирувата . [ 26 ]
Включение неестественных аминокислот
[ редактировать ]Бесклеточные системы также использовались для включения неприродных аминокислот . [ 26 ] [ 27 ] Симидзу и др. смогли заменить стоп-кодон на смысловой, исключив фактор высвобождения RF1 , что указывает на способность вставлять нужные аминокислоты в неестественных ситуациях. Это полезно в системах, где работа внутри клетки проблематична, например, в процессе метаболизма аминокислот, препятствующем специфической маркировке аминокислот, которая была бы полезна в многомерной ЯМР-спектроскопии . [ 28 ] Кигава и др. смогли успешно маркировать аминокислоты в бесклеточной системе, где метаболизм аминокислот больше не присутствовал, что сделало такие системы полезными для исследований ЯМР. [ 28 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Шварц, Джим (1 июля 2006 г.). «Разработка бесклеточной биологии для промышленного применения» . Журнал промышленной микробиологии и биотехнологии . 33 (7): 476–485. дои : 10.1007/s10295-006-0127-y . ISSN 1367-5435 . ПМИД 16761165 . S2CID 12374464 .
- ^ «MeSH-браузер» . meshb.nlm.nih.gov . Проверено 18 октября 2017 г.
- ^ Jump up to: а б с д Грегорио, Николь Э.; Левин, Макс З.; Оза, Джавин П. (2019). «Руководство пользователя по синтезу бесклеточного белка» . Методы и протоколы . 2 (1): 24. дои : 10.3390/mps2010024 . ПМК 6481089 . ПМИД 31164605 .
- ^ Земелла, Энн; Торинг, Лена; Хоффмайстер, Кристиан; Кубик, Стефан (01 ноября 2015 г.). «Бесклеточный синтез белка: плюсы и минусы прокариотических и эукариотических систем» . ХимБиоХим . 16 (17): 2420–2431. дои : 10.1002/cbic.201500340 . ISSN 1439-7633 . ПМЦ 4676933 . ПМИД 26478227 .
- ^ Лу, Юань (2017). «Бесклеточная синтетическая биология: инженерия в открытом мире» . Синтетическая и системная биотехнология . 2 (1): 23–27. дои : 10.1016/j.synbio.2017.02.003 . ПМЦ 5625795 . ПМИД 29062958 .
- ^ Jump up to: а б с Роллин, Джозеф А.; Там, Цз Кин; Чжан, Ю.-Х. Персиваль (21 июня 2013 г.). «Новая биотехнологическая парадигма: бесклеточные биосистемы для биопроизводства». Зеленая химия . 15 (7): 1708. doi : 10.1039/c3gc40625c . ISSN 1463-9270 .
- ^ г.), «Бесклеточный перевод, восстановленный с помощью очищенных компонентов». Симидзу, Ёсихиро; Иноуэ, Томари, Юкихидэ; Ёкогава, Такаши; Уэда, Такуя (23 мая 2001 . 19 8): 751–755. doi : 10.1038/90802 . PMID 11479568. ( S2CID 22554704 .
- ^ Китаока, Ёсихиса; Нисимура, Норихиро; Нивано, Мицуру (1996). «Кооперативность стабилизированной мРНК и усиленная трансляционная активность в бесклеточной системе». Журнал биотехнологии . 48 (1–2): 1–8. дои : 10.1016/0168-1656(96)01389-2 . ПМИД 8818268 .
- ^ Барнетт, Джеймс А.; Лихтенталер, Фридер В. (15 марта 2001 г.). «История исследования дрожжей 3: Эмиль Фишер, Эдуард Бюхнер и их современники, 1880-1900» . Дрожжи . 18 (4): 363–388. doi : 10.1002/1097-0061(20010315)18:4<363::AID-YEA677>3.0.CO;2-R . ISSN 1097-0061 . ПМИД 11223946 . S2CID 2349735 .
- ^ Jump up to: а б Шварц, Джеймс Р. (1 января 2012 г.). «Трансформация биохимической инженерии с помощью бесклеточной биологии». Журнал Айше . 58 (1): 5–13. дои : 10.1002/aic.13701 . ISSN 1547-5905 .
- ^ Стиге, Вольфганг; Эрдманн, Волкер А. (1995). «Потенциал системы биосинтеза белка in vitro». Журнал биотехнологии . 41 (2–3): 81–90. дои : 10.1016/0168-1656(95)00005-б . ПМИД 7654353 .
- ^ Jump up to: а б Маттеи Х.; Ниренберг (1962). «Характеристики и стабилизация синтеза ДНКазо-чувствительных белков в E. coli экстрактах » . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 47 (10): 1580–1588. Бибкод : 1961ПНАС...47.1580М . дои : 10.1073/pnas.47.10.1580 . ПМК 223177 . ПМИД 14471391 .
- ^ Андерсон, Карл В.; Штраус, Дж. Уильям; Дадок, Бернард С. (1983). «[41] Получение бесклеточной белоксинтезирующей системы из зародышей пшеницы» . Рекомбинантная ДНК, часть C. Методы энзимологии. Том. 101. С. 635–644 . дои : 10.1016/0076-6879(83)01044-7 . ISBN 9780121820015 . ПМИД 6888279 .
- ^ Мадин, Кайрат; Савасаки, Тацуя; Огасавара, Томио; Эндо, Яэта (18 января 2000 г.). «Высокоэффективная и надежная система бесклеточного синтеза белка, полученная из зародышей пшеницы: растения, по-видимому, содержат систему самоубийства, направленную на рибосомы» . Труды Национальной академии наук . 97 (2): 559–564. Бибкод : 2000ПНАС...97..559М . дои : 10.1073/pnas.97.2.559 . ISSN 0027-8424 . ПМЦ 15369 . ПМИД 10639118 .
- ^ Вудворд, Уильям Р.; Айви, Джоэл Л.; Герберт, Эдвард (1974). «[67a] Синтез белка с препаратами ретикулоцитов кролика» . Нуклеиновые кислоты и синтез белка . Часть F. Методы энзимологии. Том. 30. стр. 724–731 . дои : 10.1016/0076-6879(74)30069-9 . ISBN 9780121818937 . ПМИД 4853925 .
- ^ Jump up to: а б с YH Персиваль Чжан (март 2010 г.). «Производство биотоваров и биоэлектричества путем бесклеточных синтетических ферментативных биотрансформаций: проблемы и возможности» . Биотехнология и биоинженерия . 105 (4): 663–677. дои : 10.1002/бит.22630 . ПМИД 19998281 .
- ^ Чжан Ю.Х., Эванс Б.Р., Миленц-младший, Хопкинс Р.К., Адамс М.В. (2007). «Высокопроизводительное производство водорода из крахмала и воды синтетическим ферментативным путем» . ПЛОС ОДИН . 2 (5): е456. Бибкод : 2007PLoSO...2..456Z . дои : 10.1371/journal.pone.0000456 . ПМК 1866174 . ПМИД 17520015 .
- ^ Ю С, Чен Х, Мён С, Сатитсуксано Н, Ма Х, Чжан XZ, Ли Дж, Чжан Ю (2013). «Ферментативное преобразование непищевой биомассы в крахмал» . Труды Национальной академии наук . 110 (18): 7182–7187. Бибкод : 2013PNAS..110.7182Y . дои : 10.1073/pnas.1302420110 . ПМЦ 3645547 . ПМИД 23589840 .
- ^ Чжу З, Кин Там Т, Сунь Ф, Ю С, Персиваль Чжан Ю (2014). «Сахарная биобатарея с высокой энергетической плотностью, основанная на синтетическом ферментативном пути» . Природные коммуникации . 5 : 3026. Бибкод : 2014NatCo...5.3026Z . дои : 10.1038/ncomms4026 . hdl : 10919/87717 . ПМИД 24445859 .
- ^ Ван, Иран; Хуан, Вэйдун; Сатицуксано, Ноппадон; Чжу, Чжигуан; Чжан, Ю.-Х. Персиваль (2011). «Биогидрирование из сахара биомассы, опосредованное синтетическими ферментативными путями in vitro» . Химия и биология . 18 (3): 372–380. doi : 10.1016/j.chembiol.2010.12.019 . ПМИД 21439482 .
- ^ Ниренберг, М.В. и Маттеи, Х.Дж. (1961). «Зависимость бесклеточного синтеза белка в E. coli от встречающихся в природе или синтетических полирибонуклеотидов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 47 (10): 1588–1602. Бибкод : 1961PNAS...47.1588N . дои : 10.1073/pnas.47.10.1588 . ПМК 223178 . ПМИД 14479932 .
- ^ Спирин А.С.; Баранов В.И.; Рябова Л.А.; Оводов С.Ю.; Алахов Ю.Б. (1988-11-25). «Непрерывная бесклеточная система трансляции, способная производить полипептиды с высоким выходом». Наука . 242 (4882): 1162–1164. Бибкод : 1988Sci...242.1162S . дои : 10.1126/science.3055301 . ISSN 0036-8075 . ПМИД 3055301 .
- ^ Ян, Цзюньхао; Кантер, Грегори; Волошин, Алексей; Мишель-Рейделле, Натали; Велкин, Хендрик; Леви, Рональд; Шварц, Джеймс Р. (5 марта 2005 г.). «Быстрая экспрессия вакцинных белков против В-клеточной лимфомы в бесклеточной системе». Биотехнология и биоинженерия . 89 (5): 503–511. дои : 10.1002/бит.20283 . ISSN 1097-0290 . ПМИД 15669088 .
- ^ Тинафар, Эйдан; Йенес, Катарина; Парди, Кейт (8 августа 2019 г.). «Синтетическая биология становится бесклеточной» . БМК Биология . 17 (1): 64. дои : 10.1186/s12915-019-0685-x . ПМК 6688370 . ПМИД 31395057 .
- ^ Бухара, Матиас; Шумперли, Майкл; Пелло, Рене; Хайнеманн, Матиас ; Панке, Свен (2011). «Оптимизация схемы гликолиза in vitro с помощью метаболического анализа в реальном времени» (PDF) . Химическая биология природы . 7 (5): 271–277. дои : 10.1038/nchembio.541 . ПМИД 21423171 . S2CID 6613252 .
- ^ Jump up to: а б Калхун, Кара А.; Шварц, Джеймс Р. (5 июня 2005 г.). «Усиление бесклеточного синтеза белка за счет метаболизма глюкозы» . Биотехнология и биоинженерия . 90 (5): 606–613. дои : 10.1002/бит.20449 . ISSN 1097-0290 . ПМИД 15830344 .
- ^ Норен, CJ; Энтони-Кэхилл, SJ; Гриффит, MC; Шульц, П.Г. (14 апреля 1989 г.). «Общий метод сайт-специфического включения неприродных аминокислот в белки». Наука . 244 (4901): 182–188. Бибкод : 1989Sci...244..182N . дои : 10.1126/science.2649980 . ISSN 0036-8075 . ПМИД 2649980 .
- ^ Jump up to: а б Кигава, Таканори; Муто, Ютака; Ёкояма, Сигэюки (1 сентября 1995 г.). «Бесклеточный синтез и селективное аминокислотное мечение стабильных изотопов белков для ЯМР-анализа». Журнал биомолекулярного ЯМР . 6 (2): 129–134. дои : 10.1007/bf00211776 . ISSN 0925-2738 . ПМИД 8589601 . S2CID 19080000 .