Бесклеточный синтез белка
Бесклеточный синтез белка , также известный как in vitro синтез белка или CFPS , представляет собой производство белка с использованием биологического оборудования в бесклеточной системе , то есть без использования живых клеток . Среда синтеза белка in vitro не ограничена клеточной стенкой или условиями гомеостаза, необходимыми для поддержания жизнеспособности клеток. [ 1 ] Таким образом, CFPS обеспечивает прямой доступ и контроль среды трансляции , что выгодно для ряда приложений, включая котрансляционную солюбилизацию мембранных белков, оптимизацию производства белков, включение неприродных аминокислот, селективное и сайт-специфическое мечение. [ 2 ] [ 3 ] Благодаря открытому характеру системы различные условия экспрессии, такие как pH, окислительно-восстановительный потенциал , температура и шапероны можно проверять . Поскольку нет необходимости поддерживать жизнеспособность клеток, могут вырабатываться токсичные белки.
Введение
[ редактировать ]Общие компоненты бесклеточной реакции включают клеточный экстракт, источник энергии, запас аминокислот , кофакторы, такие как магний , и ДНК с нужными генами . Клеточный экстракт получают путем лизиса интересующей клетки и центрифугирования клеточных стенок, генома ДНК и другого мусора. Остатки представляют собой необходимые клеточные механизмы, включая рибосомы , аминоацил-тРНК-синтетазы инициации трансляции и , факторы элонгации , нуклеазы и т. д.
В CFPS можно использовать два типа ДНК: плазмиды и матрицы линейной экспрессии (LET). Плазмиды имеют круглую форму и образуются только внутри клеток. LET можно создавать гораздо эффективнее с помощью ПЦР , которая реплицирует ДНК гораздо быстрее, чем выращивание клеток в инкубаторе . Хотя LET изготавливать проще и быстрее, выходы плазмид обычно намного выше в CFPS. По этой причине многие исследования сегодня сосредоточены на оптимизации выхода CFPS LET, чтобы приблизиться к выходу CFPS с плазмидами.
Источник энергии является важной частью бесклеточной реакции. Обычно для реакции в экстракт добавляют отдельную смесь, содержащую необходимый источник энергии, а также запас аминокислот. Обычными источниками являются фосфоенолпируват , ацетилфосфат и креатинфосфат .
Преимущества и приложения
[ редактировать ]CFPS имеет множество преимуществ перед традиционным in vivo синтезом белков . В частности, бесклеточная реакция, включая приготовление экстракта, обычно занимает 1–2 дня, тогда как экспрессия белка in vivo может занять 1–2 недели. [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]
CFPS – это открытая реакция. Отсутствие клеточной стенки позволяет напрямую манипулировать химической средой. Пробы легко отбираются, концентрации оптимизируются, а реакцию можно контролировать. Напротив, как только ДНК вставлена в живые клетки, реакция становится недоступной до тех пор, пока она не завершится и клетки не будут лизированы.
Еще одним преимуществом CFPS является отсутствие опасений по поводу токсичности. Некоторые желаемые белки и меченые белки при синтезе токсичны для клеток. [ 8 ] Поскольку живые клетки не используются, токсичность полученного белка не вызывает серьезного беспокойства.
Эти преимущества позволяют использовать множество приложений. [ 9 ] [ 1 ] Основным применением CFPS является включение неприродных аминокислот в белковые структуры (см. расширенный генетический код ). Открытость реакции идеальна для внедрения модифицированных тРНК и неприродных аминокислот, необходимых для такой реакции.
Синтетическая биология имеет множество других применений и имеет блестящее будущее в таких областях, как эволюция белков , наномашины , цепи нуклеиновых кислот и синтез вирусоподобных частиц для вакцин и лекарственной терапии . [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]
Ограничения
[ редактировать ]Одной из проблем, связанных с CFPS, является деградация ДНК эндогенными нуклеазами в клеточном экстракте. Это особенно проблематично для LET. В клетках есть эндонуклеазы , которые атакуют случайные участки цепей ДНК; однако гораздо более распространены экзонуклеазы , атакующие ДНК с концов. Поскольку плазмиды имеют круглую форму и не имеют конца, к которому могут прикрепляться экзонуклеазы, последние не влияют на них. LET, однако, подвержены обоим. Из-за уязвимости LET многие исследования сегодня сосредоточены на оптимизации выхода CFPS LET, чтобы приблизиться к выходам CFPS с использованием плазмид.
Одним из примеров улучшенной защиты с помощью плазмид является использование бактериофага лямбда белка гамма-гаммы . [ 13 ] Gam является ингибитором RecBCD , экзонуклеазы, обнаруженной в Escherichia coli ( E. coli ). [ 14 ] При использовании гаммы выходы CFPS с LET были значительно увеличены и были сопоставимы с выходами CFPS с плазмидами. [ 15 ] ЧИСТЫЕ экстракты также могут быть изготовлены, что исключает опасность экзонуклеаз. Производство этих экстрактов дорогое, и в настоящее время они не являются экономичным решением проблемы экзогенной деградации ДНК.
Типы бесклеточных систем
[ редактировать ]Обычные клеточные экстракты, используемые сегодня, производятся из E. coli (ECE), кролика ретикулоцитов (RRL), зародышей пшеницы (WGE), насекомых клеток (ICE) и дрожжевых Kluyveromyces ( система D2P ). [ 1 ] [ 5 ] Все эти экстракты коммерчески доступны.
ECE является наиболее популярным лизатом по нескольким причинам. Это самый недорогой экстракт, и его создание требует минимум времени. Кроме того, большие количества E. coli легко выращивать, а затем легко лизировать с помощью гомогенизатора или ультразвукового аппарата . [ 1 ] ECE также обеспечивает самый высокий выход белка. Однако производство с высоким выходом может ограничить сложность синтезируемого белка, особенно при посттрансляционной модификации . В этом отношении менее эффективные эукариотические системы могут иметь преимущество при условии, что модифицирующие ферментные в экстрактах сохраняются системы.
Каждая эукариотическая система имеет свои преимущества и недостатки. Например, экстракт WGE дает самые высокие выходы из трех экстрактов эукариот; однако он не так эффективен для некоторых посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование . [ 5 ] При выборе экстракта следует учитывать тип посттрансляционной модификации, желаемый выход и стоимость.
История
[ редактировать ]Бесклеточный синтез белка используется уже более 60 лет, и, в частности, первое объяснение кодона было сделано Маршаллом Ниренбергом и Генрихом Дж. Маттеи в 1961 году в Национальных институтах здравоохранения. [ 1 ] [ 16 ] Они использовали бесклеточную систему для трансляции полиурациловой последовательности РНК (или УУУУУ... в биохимических терминах) и обнаружили, что синтезированный ими полипептид состоит только из аминокислоты фенилаланина . Таким образом, на основе этого полифенилаланина они пришли к выводу, что кодон UUU определяет аминокислоту фенилаланин. Продолжая эту работу, Ниренберг и его коллеги смогли определить нуклеотидный состав каждого кодона.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и Грегорио, Николь Э.; Левин, Макс З.; Оза, Джавин П. (2019). «Руководство пользователя по бесклеточному синтезу белка» . Методы и протоколы . 2 (1): 24. дои : 10.3390/mps2010024 . ПМК 6481089 . ПМИД 31164605 .
- ^ Росс, К; Кай, Л; Хаберсток, С; Пословицы, Д; Гошдастидер, У; Может; Филипп, С; Ван, X; Дётч, В; Бернхард, Ф (2014). «Высокоуровневое бесклеточное производство мембранных белков с помощью нанодисков». Бесклеточный синтез белка . Методы молекулярной биологии. Том. 1118. стр. 1118-1. 109–30. дои : 10.1007/978-1-62703-782-2_7 . ISBN 978-1-62703-781-5 . ПМИД 24395412 .
- ^ Роос, С; Кай, Л; Провербио, Д; Гошдастидер, У; Филипек, С; Дётч, В; Бернхард, Ф (2013). «Котрансляционная ассоциация внеклеточных экспрессируемых мембранных белков с снабженными липидными бислоями». Молекулярная мембранная биология . 30 (1): 75–89. дои : 10.3109/09687688.2012.693212 . ПМИД 22716775 . S2CID 207503256 .
- ^ Ма Ю, Гошдастидер У, Ван Дж, Йе В, Дётч В, Филипек С, Бернхард Ф, Ван Х (2012). «Бесклеточная экспрессия человеческой глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы (HsGNA1) для скрининга ингибиторов». Экспр. белка Пуриф . 86 (2): 120–6. дои : 10.1016/j.pep.2012.09.011 . ПМИД 23036358 .
- ^ Jump up to: а б с Карлсон ЭД, Ган Р., Ходжман С.Э., Джуэтт MC (2012). «Бесклеточный синтез белка: приложения достигают совершеннолетия» . Биотехнология. Адв . 30 (5): 1185–94. doi : 10.1016/j.biotechadv.2011.09.016 . ПМК 4038126 . ПМИД 22008973 .
- ^ Левин, Макс З.; Грегорио, Николь Э.; Джуэтт, Майкл С.; Уоттс, Кэтрин Р.; Оза, Джавин П. (25 февраля 2019 г.). «Синтез бесклеточного белка на основе Escherichia coli: протоколы для надежной, гибкой и доступной платформенной технологии» . Журнал визуализированных экспериментов (144): e58882. дои : 10.3791/58882 . ISSN 1940-087X . ПМИД 30855561 . S2CID 73728157 .
- ^ Уильямс, Лэйн С.; Грегорио, Николь Э.; Итак, Бёнчхоль; Као, Уэсли Ю.; Кисте, Алан Л.; Патель, Пратиш А.; Уоттс, Кэтрин Р.; Оза, Джавин П. (2020). «Набор генетического кода: бесклеточная платформа с открытым исходным кодом для биохимического и биотехнологического образования» . Границы биоинженерии и биотехнологии . 8 : 941. дои : 10.3389/fbioe.2020.00941 . ПМЦ 7466673 . ПМИД 32974303 .
- ^ Джексон AM (2004). «Бесклеточный синтез белка для протеомики» . Брифинги по функциональной геномике и протеомике . 2 (4): 308–319. дои : 10.1093/bfgp/2.4.308 . ISSN 1473-9550 . ПМИД 15163366 .
- ^ «РУКОВОДСТВО ПО БЕСКЛЕТОЧНЫМ СИСТЕМАМ» . Архивировано из оригинала 31 декабря 2021 г.
- ^ Банди, Брэдли С.; Францишкович, Марк Дж.; Шварц, Джеймс Р. (2008). «Бесклеточный синтез вирусоподобных частиц на основе Escherichia coli». Биотехнология и биоинженерия . 100 (1): 28–37. дои : 10.1002/бит.21716 . ПМИД 18023052 . S2CID 11657929 .
- ^ Патриарх Т., Шен А., Хе В., Байкогли М., Ченг Р.Х., Сян Ю.К., Коулман М.А., Тянь Л. (2018). «Нанодоставка функционального мембранного рецептора для управления клеточным фенотипом» . наук. Представитель . 8 (1): 3556. Бибкод : 2018НатСР...8.3556П . дои : 10.1038/s41598-018-21863-3 . ПМЦ 5824837 . ПМИД 29476125 .
- ^ Тинафар, Эйдан; Йенес, Катарина; Парди, Кейт (8 августа 2019 г.). «Синтетическая биология становится бесклеточной» . БМК Биология . 17 (1): 64. дои : 10.1186/s12915-019-0685-x . ПМК 6688370 . ПМИД 31395057 .
- ^ «гам - белок-ингибитор нуклеазы-хозяина гам - фаг лямбда эшерихии - ген и белок gam» . www.uniprot.org . Проверено 20 октября 2017 г.
- ^ Мерфи, Кенан К. (2007). «Белок λ Gam ингибирует связывание RecBCD с концами дцДНК». Журнал молекулярной биологии . 371 (1): 19–24. дои : 10.1016/j.jmb.2007.05.085 . ПМИД 17583735 .
- ^ Ситараман, Калавати; Эспозито, Доминик; Кларманн, Джордж; Грайс, Стюарт Ф Ле; Хартли, Джеймс Л.; Чаттерджи, Деб К. (2004). «Новая система бесклеточного синтеза белка». Журнал биотехнологии . 110 (3): 257–263. doi : 10.1016/j.jbiotec.2004.02.014 . ПМИД 15163516 .
- ^ Ниренберг, М.В.; Маттеи, Дж. Х. (1961). «Зависимость синтеза внеклеточного белка в E. Coli от встречающихся в природе или синтетических полирибонуклеотидов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 47 (10): 1588–1602. Бибкод : 1961PNAS...47.1588N . дои : 10.1073/pnas.47.10.1588 . ПМК 223178 . ПМИД 14479932 .
- Спирин А.; Баранов В.; Рябова Л.; Оводов С.; Алахов Ю. (1988). «Система непрерывной бесклеточной трансляции, способная производить полипептиды с высоким выходом». Наука . 242 (4882): 1162–4. Бибкод : 1988Sci...242.1162S . дои : 10.1126/science.3055301 . ПМИД 3055301 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Хартсоф Э.М., Шах П., Ларсен А.С., Чапут Дж.К. (сентябрь 2015 г.). «Сравнительный анализ эукариотических бесклеточных систем экспрессии» . БиоТехники . 59 (3): 149–51. дои : 10.2144/000114327 . ПМИД 26345507 .
