Одноклеточная изменчивость
В клеточной биологии изменчивость отдельных клеток возникает, когда отдельные клетки в сходной в остальном популяции различаются по форме, размеру, положению в клеточном цикле или характеристикам на молекулярном уровне. Такие различия можно обнаружить с помощью современных методов анализа отдельных клеток . [ 1 ] Исследование изменчивости внутри популяции клеток способствует пониманию процессов развития и патологических процессов.
Одноклеточный анализ
[ редактировать ]Образцы клеток могут выглядеть похожими, но клетки могут различаться по своим индивидуальным характеристикам, таким как форма и размер, экспрессии мРНК уровни , геном или индивидуальное количество метаболитов . В прошлом единственные методы, доступные для исследования таких свойств, требовали популяции клеток и давали оценку интересующей характеристики, усредненную по популяции, что могло скрыть важные различия между клетками. Анализ отдельных клеток позволяет ученым изучать свойства одной интересующей клетки с высокой точностью, выявляя индивидуальные различия между популяциями и предлагая новые идеи в молекулярной биологии. Эти индивидуальные различия важны в таких областях, как биология развития, где отдельные клетки могут принимать разные « судьбы » — становиться специализированными клетками, такими как нейроны или ткани органов — во время роста эмбриона; в исследованиях рака , где отдельные злокачественные клетки могут по-разному реагировать на терапию; или при инфекционном заболевании , при котором только часть клеток в популяции заражается патогеном .
Представления ячеек на уровне совокупности могут давать искаженное представление данных за счет усреднения свойств отдельных подмножеств ячеек. [ 3 ] Например, если половина клеток определенной группы экспрессируют высокий уровень данного гена, а остальные — низкий уровень, результаты популяционного анализа могут выглядеть так, как будто все клетки экспрессируют средний уровень данного гена. . Таким образом, анализ отдельных клеток позволяет исследователям более детально изучать биологические процессы и отвечать на вопросы, которые иначе невозможно было бы решить.
Типы вариаций
[ редактировать ]Изменение экспрессии генов
[ редактировать ]Клетки с идентичными геномами могут различаться по экспрессии своих генов из-за различий в их специализированных функциях в организме, моментах клеточного цикла , окружающей среде, а также шуме и стохастических факторах. Таким образом, точное измерение экспрессии генов в отдельных клетках позволяет исследователям лучше понять эти важные аспекты клеточной биологии. Например, раннее изучение экспрессии генов в отдельных клетках эмбрионов плодовых мух позволило ученым обнаружить регулярные закономерности или градиенты транскрипции конкретных генов на разных стадиях роста, что позволило более детально понять развитие на уровне местоположения и времени. Еще одним явлением в экспрессии генов, которое можно идентифицировать только на уровне отдельных клеток, является колебательная экспрессия генов, при которой ген периодически включается и выключается.
Экспрессию генов в отдельных клетках обычно анализируют с помощью RNA-seq . После выделения клетки протокол секвенирования РНК обычно состоит из трех этапов: [ 4 ] РНК подвергается обратной транскрипции в кДНК , кДНК амплифицируется, чтобы сделать больше материала доступным для секвенатора, и кДНК секвенируется .
Изменение последовательности ДНК
[ редактировать ]Популяции одноклеточных организмов, таких как бактерии, обычно слегка различаются по последовательности ДНК из-за мутаций, приобретенных во время размножения. В одном человеке отдельные клетки обычно имеют идентичные геномы, хотя есть интересные исключения, такие как B-клетки , ДНК которых различается, что позволяет им генерировать разные антитела для связывания с различными патогенами, которые могут атаковать организм. Измерение различий и скорости изменения содержания ДНК на уровне отдельных клеток может помочь ученым лучше понять, как у патогенов развивается устойчивость к антибиотикам, почему иммунная система часто не может вырабатывать антитела к быстро мутирующим вирусам, таким как ВИЧ, и другие важные явления.
Существует множество технологий секвенирования геномов, но они предназначены для использования ДНК из популяции клеток, а не из одной клетки. Основная задача секвенирования генома одной клетки — сделать несколько копий (амплифицировать) ДНК, чтобы было достаточно материала для секвенатора. Этот процесс называется амплификацией всего генома (WGA). Типичные методы WGA включают: [ 5 ] (1) амплификация с множественным смещением (MDA), при которой несколько праймеров отжигаются с ДНК, полимеразы копируют ДНК и удаляют другие полимеразы, освобождая цепи, которые могут быть обработаны секвенатором, (2) методы на основе ПЦР или (3) ) некоторая комбинация того и другого.
Изменение метаболомных свойств
[ редактировать ]Клетки различаются по содержащимся в них метаболитам , которые являются промежуточными соединениями и конечными продуктами сложных биохимических реакций, поддерживающих клетку. Генетически идентичные клетки в разных условиях и средах могут использовать разные метаболические пути для поддержания своего существования. Измеряя присутствующие метаболиты, ученые могут сделать вывод об используемых метаболических путях и получить полезную информацию о состоянии клетки. Примером этого является иммунная система, где клетки CD4+ могут дифференцироваться в клетки Th17 или TReg (среди других возможностей), оба из которых по-разному направляют реакцию иммунной системы. Клетки Th17 стимулируют сильную воспалительную реакцию, тогда как клетки TReg стимулируют противоположный эффект. Первые склонны гораздо больше полагаться на гликолиз , [ 6 ] из-за их повышенных энергетических потребностей.
Чтобы составить профиль метаболического содержимого клетки, исследователи должны идентифицировать интересующую клетку в более крупной популяции, изолировать ее для анализа, быстро ингибировать ферменты и остановить метаболические процессы в клетке, а затем использовать такие методы, как ЯМР , масс-спектрометрический анализ . спецификация , микрофлюидика и другие методы анализа содержимого клетки. [ 7 ]
Изменение протеома
[ редактировать ]Подобно вариациям в метаболоме, белки, присутствующие в клетке, и их содержание могут варьироваться от клетки к клетке в сходной в остальном популяции. Хотя транскрипция и трансляция определяют количество и разнообразие продуцируемых белков, эти процессы неточны, и клетки обладают рядом механизмов, которые могут изменять или разрушать белки, допуская изменения в протеоме, которые не могут быть объяснены различиями в экспрессии генов. Кроме того, белки имеют множество других важных особенностей, помимо простого присутствия или отсутствия, например, претерпели ли они посттрансляционные модификации , такие как фосфорилирование , или связаны ли они с интересующими молекулами. Изменение количества и характеристик белков имеет значение для таких областей, как исследования рака и терапия рака, где лекарство, нацеленное на конкретный белок, может различаться по своему воздействию из-за изменчивости протеома. [ 8 ] или различаться по эффективности из-за более широкого биологического явления гетерогенности опухоли .
Цитометрия, поверхностные методы и технологии микрофлюидики — это три класса инструментов, обычно используемых для профилирования протеомов отдельных клеток. [ 9 ] Цитометрия позволяет исследователям изолировать интересующие клетки и окрашивать 15–30 белков, чтобы измерить их местоположение и/или относительную численность. [ 9 ] Методы циклического изображения были разработаны для измерения количества и распределения нескольких мишеней в образцах биопсии и тканях. В этих методах 3–4 мишени окрашиваются флуоресцентно меченными антителами, визуализируются , а затем удаляются их флуорофоры различными способами, включая химические методы, основанные на окислении. [ 10 ] или, в последнее время, методы конъюгации антитело-ДНК, [ 11 ] возможность окрашивания дополнительных мишеней в последующих циклах; в некоторых методах визуализировалось до 60 отдельных мишеней. [ 12 ] Что касается поверхностных методов, исследователи помещают одну клетку на поверхность, покрытую антителами, которые затем связываются с белками, секретируемыми клеткой, и позволяют их измерить. [ 9 ] Методы микрофлюидики для анализа протеома иммобилизуют отдельные клетки на микрочипе и используют окрашивание для измерения интересующих белков или антител для связывания с интересующими белками.
Изменение размера и морфологии клеток
[ редактировать ]Клетки в схожей в остальном популяции могут различаться по размеру и морфологии из-за различий в функциях, изменений в метаболизме или просто нахождения в разных фазах клеточного цикла или какого-либо другого фактора. Например, стволовые клетки могут делиться асимметрично. [ 13 ] это означает, что две образовавшиеся дочерние клетки могут иметь разную судьбу (специализированные функции) и могут отличаться друг от друга по размеру и форме. Исследователи, изучающие развитие, могут быть заинтересованы в отслеживании физических характеристик отдельного потомства в растущей популяции, чтобы понять, как стволовые клетки с течением времени дифференцируются в сложную ткань или организм.
Микроскопию можно использовать для анализа размера и морфологии клеток путем получения высококачественных изображений с течением времени. Эти изображения обычно содержат популяцию клеток, но алгоритмы можно применять для идентификации и отслеживания отдельных клеток на нескольких изображениях. Алгоритмы должны быть способны обрабатывать гигабайты данных для удаления шума и суммирования соответствующих характеристик для данного исследовательского вопроса. [ 14 ]
Изменение клеточного цикла
[ редактировать ]Отдельные клетки в популяции часто находятся в разных точках клеточного цикла. Ученым, желающим понять характеристики клетки в конкретный момент цикла, будет сложно использовать оценки на уровне популяции, поскольку они будут усреднять измерения клеток на разных стадиях. Кроме того, важно понимать клеточный цикл в отдельных больных клетках, например, в опухолевых, поскольку их цикл часто сильно отличается от цикла здоровых клеток. Одноклеточный анализ характеристик клеточного цикла позволит ученым понять эти свойства более детально.
Вариабельность клеточного цикла можно изучать с помощью нескольких ранее описанных методов. Например, клетки в G2 будут довольно большими по размеру (поскольку они находятся как раз в той точке, где они вот-вот разделятся на две части), и их можно идентифицировать с помощью протоколов по размеру и форме ячеек. Клетки в S-фазе копируют свои геномы и могут быть идентифицированы с использованием протоколов окрашивания ДНК и измерения ее содержания с помощью проточной цитометрии или количественной флуоресцентной микроскопии или с помощью зондов для генов, высоко экспрессируемых на определенных фазах клеточного цикла.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Хабиби, Иман; Чеонг, Раймонд; Липняцкий, Томаш; Левченко, Андре; Эмамян, Эффат С.; Абди, Али (05 апреля 2017 г.). «Вычисление и измерение ошибок принятия решений ячейкой с использованием данных одной ячейки» . PLOS Вычислительная биология . 13 (4): e1005436. Бибкод : 2017PLSCB..13E5436H . дои : 10.1371/journal.pcbi.1005436 . ISSN 1553-7358 . ПМК 5397092 . ПМИД 28379950 .
- ^ Гидт, Рэнди Дж.; Кох, Питер Д.; Вайсследер, Ральф; Муньос-Баррутия, Аррате (10 апреля 2013 г.). «Одноклеточный анализ распределения лекарств с помощью прижизненной визуализации» . ПЛОС ОДИН . 8 (4): e60988. Бибкод : 2013PLoSO...860988G . дои : 10.1371/journal.pone.0060988 . ПМЦ 3622689 . ПМИД 23593370 .
- ^ Сандберг, Рикард (30 декабря 2013 г.). «Вход в эпоху одноклеточной транскриптомики в биологии и медицине» . Природные методы . 11 (1): 22–24. дои : 10.1038/nmeth.2764 . ПМИД 24524133 . S2CID 27632439 .
- ^ Салиба А.-Э.; Вестерманн, AJ; Горский, SA; Фогель, Дж. (22 июля 2014 г.). «Секвенирование одноклеточной РНК: достижения и будущие проблемы» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (14): 8845–8860. дои : 10.1093/nar/gku555 . ПМК 4132710 . ПМИД 25053837 .
- ^ Маколей, Иэн К.; Воэт, Тьерри; Майзелс, Нэнси (30 января 2014 г.). «Одноклеточная геномика: достижения и перспективы» . ПЛОС Генетика . 10 (1): e1004126. дои : 10.1371/journal.pgen.1004126 . ПМЦ 3907301 . ПМИД 24497842 .
- ^ Барби, Джозеф; Пардолл, Дрю; Пан, Фан (март 2013 г.). «Метаболический контроль оси Treg/Th17» . Иммунологические обзоры . 252 (1): 52–77. дои : 10.1111/imr.12029 . ПМЦ 3576873 . ПМИД 23405895 .
- ^ Рубахин, Станислав С; Романова, Елена В; Немес, Питер; Свидлер, Джонатан В. (30 марта 2011 г.). «Профилирование метаболитов и пептидов в одиночных клетках» . Природные методы . 8 (4с): С20–С29. дои : 10.1038/nmeth.1549 . ПМЦ 3312877 . ПМИД 21451513 .
- ^ Коэн, А.А.; Гева-Заторский Н.; Иден, Э.; Френкель-Моргенштерн, М.; Исаева И.; Сигал, А.; Майло, Р.; Коэн-Сайдон, К.; Лирон, Ю.; Кам, З.; Коэн, Л.; Данон, Т.; Перзов Н.; Алон, У. (5 декабря 2008 г.). «Динамическая протеомика отдельных раковых клеток в ответ на лекарство» . Наука . 322 (5907): 1511–1516. Бибкод : 2008Sci...322.1511C . дои : 10.1126/science.1160165 . ПМИД 19023046 . S2CID 9553016 .
- ^ Jump up to: а б с Вэй, Вэй; Шин, Янг; Ма, Чао; Ван, Цзюнь; Элитас, Мельтем; Фан, Ронг; Хит, Джеймс Р. (2013). «Платформы микрочипов для мультиплексной функциональной протеомики одиночных клеток с применением в иммунологии и исследованиях рака» . Геномная медицина . 5 (8): 75. дои : 10,1186/gm479 . ПМЦ 3978720 . ПМИД 23998271 .
- ^ Зоргер, Питер К.; Фаллахи-Сичани, Мохаммед; Линь, Цзя-Рен (24 сентября 2015 г.). «Высоко-мультиплексная визуализация одиночных клеток с использованием высокопроизводительного метода циклической иммунофлуоресценции» . Природные коммуникации . 6 : 8390. Бибкод : 2015NatCo...6.8390L . дои : 10.1038/ncomms9390 . ISSN 2041-1723 . ПМЦ 4587398 . ПМИД 26399630 .
- ^ Вайсследер, Ральф; Юрич, Деян; Кастильо, Андрес Фернандес дель; Макфарланд, Филип Дж.; Карлсон, Джонатан Коннектикут; Патания, Дивья; Гидт, Рэнди Дж. (31 октября 2018 г.). «Анализ одноклеточных штрих-кодов обеспечивает быстрое считывание клеточных сигнальных путей в клинических образцах» . Природные коммуникации . 9 (1): 4550. Бибкод : 2018NatCo...9.4550G . дои : 10.1038/s41467-018-07002-6 . ISSN 2041-1723 . ПМК 6208406 . ПМИД 30382095 .
- ^ Линь, Цзя-Рен; Изар, Бенджамин; Ван, Шу; Япп, Кларенс; Мэй, Шаолинь; Шах, Парин М; Сантагата, Сандро; Зоргер, Питер К. (11 июля 2018 г.). Чакраборти, Аруп К.; Радж, Арджун; Марр, Карстен; Хорват, Петер (ред.). «Высокомультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация тканей и опухолей человека с использованием t-CyCIF и обычных оптических микроскопов» . электронная жизнь . 7 : е31657. дои : 10.7554/eLife.31657 . ISSN 2050-084X . ПМК 6075866 . ПМИД 29993362 .
- ^ Кноблих, Юрген А. (февраль 2008 г.). «Механизмы асимметричного деления стволовых клеток» . Клетка . 132 (4): 583–597. дои : 10.1016/j.cell.2008.02.007 . ПМИД 18295577 .
- ^ Коэн, Арканзас (3 ноября 2014 г.). «Извлечение смысла из данных биологических изображений» . Молекулярная биология клетки . 25 (22): 3470–3473. дои : 10.1091/mbc.E14-04-0946 . ПМК 4230605 . ПМИД 25368423 .