Спектроскопия ядерного магнитного резонанса нуклеиновых кислот
ЯМР нуклеиновых кислот — это использование спектроскопии ядерного магнитного резонанса для получения информации о структуре и динамике молекул нуклеиновых кислот , таких как ДНК или РНК . Он полезен для молекул длиной до 100 нуклеотидов, и по состоянию на 2003 год почти половина всех известных структур РНК была определена с помощью ЯМР-спектроскопии. [1]
ЯМР имеет преимущества перед рентгеновской кристаллографией , которая является другим методом определения структуры нуклеиновой кислоты с высоким разрешением , поскольку молекулы наблюдаются в их естественном состоянии раствора, а не в кристаллической решетке , которая может повлиять на структурные свойства молекулы. Динамику также можно исследовать с помощью ЯМР. Это происходит за счет немного менее точных и подробных структур, чем кристаллография. [2]
В ЯМР нуклеиновых кислот используются методы, аналогичные методам ЯМР белков , но есть несколько отличий. Нуклеиновые кислоты содержат меньший процент атомов водорода, которые обычно наблюдаются в ЯМР, и поскольку двойные спирали нуклеиновых кислот жесткие и примерно линейные, они не сворачиваются сами по себе, образуя «дальние» корреляции. Нуклеиновые кислоты также имеют тенденцию иметь резонансы, распределенные в меньшем диапазоне, чем белки, что делает спектры потенциально более перегруженными и трудными для интерпретации. [3]
Экспериментальные методы
[ редактировать ]Двумерные методы ЯМР почти всегда используются с нуклеиновыми кислотами. К ним относятся корреляционная спектроскопия (COSY) и спектроскопия переноса полной когерентности (TOCSY) для обнаружения ядерных связей через связь, а также спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY) для обнаружения связей между ядрами, расположенными близко друг к другу в космосе. Типы ЯМР, обычно выполняемые с нуклеиновыми кислотами: 1 H ЯМР , 13 С ЯМР , 15 N ЯМР и 31 П ЯМР . 19 F-ЯМР также полезен, если в цепь нуклеиновой кислоты включены неприродные нуклеотиды, такие как 2'-фтор-2'-дезоксиаденозин , поскольку природные нуклеиновые кислоты не содержат атомов фтора. [2] [4]
1 Рука 31 P имеют почти 100% естественное изобилие , в то время как 13 С и 15 N имеет низкую естественную численность. Для этих последних двух ядер существует возможность изотопного обогащения желаемыми атомами внутри молекул либо равномерно, либо сайт-специфичным образом. Нуклеотиды, равномерно обогащенные 13 С и/или 15 N можно получить биохимическими методами, проводя полимеразную цепную реакцию с использованием dNTP или NTP, полученных из бактерий, выращенных в изотопно-обогащенной среде. Сайт-специфическое изотопное обогащение должно осуществляться путем химического синтеза меченого мономера нуклеозида фосфорамидита и полной цепи ; однако их сложно и дорого синтезировать. [1] [5]
Поскольку нуклеиновые кислоты имеют относительно большое количество протонов, способных к обмену в растворителе, ЯМР нуклеиновых кислот обычно не проводят в растворителе D 2 O , как это обычно бывает с другими типами ЯМР. Это связано с тем, что дейтерий в растворителе заменит обменные протоны и погасит их сигнал. H 2 O используется в качестве растворителя, а для устранения сильного сигнала растворителя используются другие методы, такие как насыщение сигнала растворителя перед нормальной последовательностью импульсов («преднасыщение»), что лучше всего работает при низкой температуре для предотвращения обмена насыщенных протоны растворителя с протонами нуклеиновой кислоты; или возбуждать только интересующие резонансы («селективное возбуждение»), что имеет дополнительный, потенциально нежелательный эффект, заключающийся в искажении пиковых амплитуд. [2]
Определение структуры
[ редактировать ]Обменные и необменные протоны обычно относят к своим конкретным пикам как две независимые группы. Для обменных протонов, которые по большей части являются протонами, участвующими в спаривании оснований , NOESY можно использовать для поиска корреляций между соседними основаниями в пространстве, что позволяет назначить всю дуплексную молекулу посредством последовательного обхода . Для необменных протонов, многие из которых находятся в сахарной части нуклеиновой кислоты, COSY и TOCSY используются для идентификации систем связанных ядер, тогда как NOESY снова используется для корреляции сахара с основанием и каждого основания с соседним основанием. Для необменных протонов дуплексной ДНК протоны H6/H8 на основании коррелируют со своими аналогами на соседних основаниях и с протоном H1' на сахаре, что позволяет осуществлять последовательное хождение. Для РНК различия в химической структуре и геометрии спирали делают это задание более технически сложным, но все же возможным. Методика последовательного обхода невозможна для структур нуклеиновой кислоты, не имеющих двойной спирали, а также для Форма Z-ДНК , что затрудняет определение резонансов. [2] [3]
Параметры, взятые из спектра, в основном кросс-пики NOESY и константы связи , могут использоваться для определения локальных структурных особенностей, таких как углы гликозидной связи , двугранные углы (с использованием уравнения Карплюса ) и конформации сахарных складок. Наличие или отсутствие имино-протонных резонансов или связи между 15 Атомы N поперек водородной связи указывают на наличие или отсутствие спаривания оснований. Для крупномасштабной структуры эти локальные параметры должны быть дополнены другими структурными предположениями или моделями, поскольку ошибки накапливаются по мере прохождения двойной спирали, и в отличие от белков, двойная спираль не имеет компактной внутренней части и не сгибается обратно. сам. Однако информация об ориентации на большие расстояния может быть получена посредством экспериментов по остаточному диполярному связыванию в среде, которая вызывает слабое выравнивание молекул нуклеиновой кислоты. [1] [2]
Недавно ЯМР твердого тела . для определения структуры нуклеиновых кислот была внедрена методология [6] Протокол подразумевает два подхода: селективное мечение РНК по нуклеотидному типу и использование экспериментов по гетероядерной корреляции.
ЯМР также полезен для исследования нестандартной геометрии, такой как изогнутые спирали , спаривание оснований не по принципу Ватсона-Крика и коаксиальная укладка . Это было особенно полезно при исследовании структуры природных олигонуклеотидов РНК, которые имеют тенденцию принимать сложные конформации, такие как стеблевые петли и псевдоузлы . Взаимодействия между РНК и ионами металлов можно исследовать рядом методов, включая наблюдение за изменениями химического сдвига при связывании ионов, наблюдение за уширением линий для парамагнитных видов ионов и наблюдение за межмолекулярными контактами NOE для металлоорганических имитаторов ионов металлов. ЯМР также полезен для исследования связывания молекул нуклеиновой кислоты с другими молекулами, такими как белки или лекарства. Это можно сделать с помощью карт химического сдвига, позволяющих увидеть, какие резонансы смещаются при связывании другой молекулы, или с помощью экспериментов по перекрестному насыщению, когда одна из связывающих молекул избирательно насыщается, и, если она связана, насыщение передается другой. Молекула в комплексе. [1] [2]
Динамические свойства, такие как равновесие дуплекс-одноцепочечный и скорости связывания других молекул с дуплексами, также могут быть определены по их влиянию на спин-решеточной релаксации время T 1 , но эти методы нечувствительны к промежуточным скоростям 10 4 –10 8 с −1 , который необходимо исследовать другими методами, такими как ЯМР твердого тела . Динамику механических свойств двойной спирали нуклеиновой кислоты, таких как изгиб и скручивание, также можно изучать с помощью ЯМР. Эксперименты ЯМР с градиентом импульсного поля можно использовать для измерения констант диффузии . [1] [2] [7]
История
[ редактировать ]Исследования ЯМР нуклеиновых кислот были проведены еще в 1971 г. [8] и сосредоточился на использовании имино-протонных резонансов в слабом поле для исследования взаимодействий спаривания оснований. Эти ранние исследования были сосредоточены на тРНК, потому что эти нуклеиновые кислоты были единственными доступными в то время образцами с достаточно низкой молекулярной массой, чтобы ширина спектральных линий ЯМР была практичной. Исследование было сосредоточено на протонах слабого поля, поскольку они были единственными протонами, которые можно было надежно наблюдать в водном растворе с использованием лучших спектрометров, доступных на тот момент. Вскоре стало понятно, что спектры имино-протонов в слабом поле дают ключ к пониманию третичной структуры тРНК в растворе. Первый ЯМР-спектр двухспиральной ДНК был опубликован в 1977 году. [9] с использованием синтетической двойной спирали из 30 пар оснований. Чтобы преодолеть резкое уширение линий нативной ДНК, была приготовлена и изучена полностью деградированная природная ДНК, чтобы узнать длину персистентности двойной спирали ДНК. [10] В то же время были изучены ядра нуклеосомных частиц, чтобы лучше понять гибкость двойной спирали. [11] Первые спектры ЯМР, полученные для однородной низкомолекулярной ДНК с нативной последовательностью, полученной с помощью ферментов рестрикции , были опубликованы в 1981 году. [12] Эта работа также была первым сообщением о спектрах ЯМР нуклеиновых кислот, полученных в сильном поле. О двумерных исследованиях ЯМР начали сообщать в 1982 году. [13] а затем, с появлением синтеза олигонуклеотидов и более сложных приборов, начиная с 1983 года, стало известно о многих детальных структурных исследованиях. [14]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и Фюртиг, Борис; Рихтер, Кристиан; Вёнерт, Йенс; Швальбе, Харальд (2003). «ЯМР-спектроскопия РНК». ХимБиоХим . 4 (10): 936–962. дои : 10.1002/cbic.200300700 . ПМИД 14523911 . S2CID 33523981 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г Веммер, Дэвид (2000). «Глава 5: Структура и динамика по данным ЯМР». В Блумфилде, Виктор А.; Кротерс, Дональд М.; Тиноко, Игнасио (ред.). Нуклеиновые кислоты: структура, свойства и функции . Саусалито, Калифорния: Университетские научные книги. ISBN 0-935702-49-0 .
- ^ Jump up to: а б Аддесс, Кеннет Дж.; Фейгон, Джули (1996). «Введение в 1 H ЯМР-спектроскопия ДНК». Ин Хехт, Сидни М. (ред.). Биоорганическая химия: нуклеиновые кислоты . Нью-Йорк: Oxford University Press . ISBN. 0-19-508467-5 .
- ^ Кан, Лу-синг; Цо, Пол ОП (1986). «Ядерно-магнитно-резонансное исследование нуклеиновых кислот». Ин Чиен, Шу; Хо, Чиен (ред.). ЯМР в биологии и медицине . Нью-Йорк: Рэйвен Пресс. ISBN 0-88167-231-9 .
- ^ Кодзима, К; Оно, А; Оно, А; Кайношо, М (2002). «Твердофазный синтез селективно меченной ДНК: применение для многомерной спектроскопии ядерного магнитного резонанса». Ядерный магнитный резонанс биологических макромолекул . Часть А. Методы энзимологии. Том. 338. стр. 261–283. дои : 10.1016/S0076-6879(02)38224-7 . ISBN 9780121822392 . ПМИД 11460552 .
- ^ Марчанка, Александр; Саймон, Бернд; Альтхофф-Оспельт, Герхард; Карломаньо, Тереза (2015). «Определение структуры РНК методом твердотельной ЯМР-спектроскопии» . Природные коммуникации . 6 : 7024. Бибкод : 2015NatCo...6.7024M . дои : 10.1038/ncomms8024 . ПМЦ 4432599 . ПМИД 25960310 .
- ^ Робинсон, Б.Х.; Дробный, ГП (1995). «[19] Сайт-специфическая динамика ДНК: теория и эксперимент». Ядерный магнитный резонанс и нуклеиновые кислоты . Методы энзимологии. Том. 261. стр. 451–509. дои : 10.1016/S0076-6879(95)61021-9 . ISBN 978-0-12-182162-3 . ISSN 0076-6879 . ПМИД 8569508 .
- ^ Кернс, Дэвид; Патель, Диншоу; Шульман, Роберт (1971). «Исследование ядерным магнитным резонансом высокого разрешения протонов тРНК, связанных с водородной связью, в воде». Природа . 229 (5283): 338–339. Бибкод : 1971Natur.229..338K . дои : 10.1038/229338a0 . ПМИД 4927207 . S2CID 4290896 .
- ^ Рано, Томас; Кернс, Дэвид; Берд, Джон; Ларсон, Жаклин; Уэллс, Роберт (1977). «Исследование протонным ядерным магнитным резонансом высокого разрешения структурных и динамических свойств d(C15A15)·d(T15G15)». Биохимия . 16 (3): 541–551. дои : 10.1021/bi00622a031 . ПМИД 836800 .
- ^ Рано, Томас; Кернс, Дэвид (1979). «1H-ядерное магнитно-резонансное исследование гибкости ДНК» . ПНАС . 76 (9): 4165–4169. Бибкод : 1979PNAS...76.4165E . дои : 10.1073/pnas.76.9.4165 . ПМЦ 411531 . ПМИД 291958 .
- ^ Фейгон, Джули; Кернс, Дэвид (1979). «1H ЯМР исследование конформационных состояний ДНК в частицах ядра нуклеосомы» . Исследования нуклеиновых кислот . 6 (6): 2327–2337. дои : 10.1093/нар/6.6.2327 . ПМК 327853 . ПМИД 461191 .
- ^ Рано, Томас; Кернс, Дэвид; Хиллен, Вольфганг; Уэллс, Роберт (1980). «Исследование протонным ЯМР на частоте 300 МГц и 600 МГц рестрикционного фрагмента из 12 пар оснований: исследование структуры путем релаксационных измерений» . Исследования нуклеиновых кислот . 8 (23): 5795–5812. дои : 10.1093/нар/8.23.5795 . ПМЦ 324342 . ПМИД 6258152 .
- ^ Фейгон, Джули; Райт, Джон; Люпен, Вернер; Денни, Вашингтон; Кернс, Дэвид (1982). «Использование двумерного ЯМР в исследовании двухцепочечной ДНК». Дж. Ам. хим. Соц . 104 (20): 5540–5541. дои : 10.1021/ja00384a069 .
- ^ Адрес, Кеннет; Фейгон, Джули (1996). «Введение в 1H ЯМР-спектроскопию ДНК». В Хехте, Сидни (ред.). Биоорганическая химия: нуклеиновые кислоты . Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета. ISBN 0-19-508467-5 .