ТНП-АТП

TNP-ATP — это флуоресцентная молекула , которая способна определить, связывается ли белок с АТФ , и константы, связанные с этим связыванием. Он в основном используется во флуоресцентной спектроскопии , но также очень полезен в качестве молекулы-акцептора в FRET и в качестве флуоресцентного зонда во флуоресцентной микроскопии и рентгеновской кристаллографии .

ТНП СВЯЗКА

Составные части

TNP относится к химическому соединению 2,4,6-тринитрофенолу, также известному как пикриновая кислота . Он является основным компонентом многих неразорвавшихся мин и является родственником тротила , но менее стабилен. Он признан загрязнителем окружающей среды и токсичен для многих организмов. Он до сих пор широко используется в производстве фейерверков , взрывчатых веществ и ракетного топлива , а также в кожевенной, фармацевтической и красильной промышленности.

АТФ является важным медиатором жизни. Он используется для преодоления неблагоприятных энергетических барьеров для инициирования и подпитки химических реакций. Он также используется для управления биологическими механизмами и регулирования ряда процессов посредством фосфорилирования белков . Однако белки, которые связывают АТФ как для регуляции, так и для ферментативных реакций, очень разнообразны — многие из них еще не открыты — и для многих белков их связь с АТФ с точки зрения количества сайтов связывания , констант связывания и констант диссоциации остается неясной.

ТНП-АТП

Конъюгация TNP с АТФ делает этот нуклеотидтрифосфат флуоресцентным и окрашенным, сохраняя при этом свою биологическую активность. Таким образом, TNP-ATP является флуоресцентным аналогом АТФ. Эта конъюгация очень полезна для получения информации о взаимодействиях между АТФ и АТФ-связывающим белком, поскольку TNP-АТФ взаимодействует с белками и ферментами как заменитель родительского нуклеотида и обладает сильным сродством к связыванию с большинством систем, которым требуется АТФ.

ТНП возбуждается при длине волны 408 и 470 нм и флуоресцирует в диапазоне 530–560 нм. Это очень полезный диапазон возбуждения, поскольку он находится далеко от места поглощения белков или нуклеотидов. Когда ТНП-АТФ находится в воде или других водных растворах, это выделение очень слабое. Однако как только TNP-ATP связывается с белком , происходит резкое увеличение интенсивности флуоресценции. Это свойство позволяет исследователям изучать взаимодействие связывания различных белков с АТФ. Таким образом, по усилению флуоресценции можно увидеть, связывается ли белок с АТФ.

Когда TNP-ATP в воде возбуждается при длине волны 410 нм, TNP-ATP показывает единственный максимум флуоресценции при 561 нм. Этот максимум смещается при изменении вязкости жидкости. Например, в N,N-диметилформамиде вместо максимумов при 561 нм, как в воде, максимумы находятся при 533 нм.

Связывание с белком также изменит длину волны максимального излучения, а также изменение интенсивности флуоресценции. Например, связывание с белком хемотаксиса CheA указывает на многократное увеличение интенсивности флуоресценции и сдвиг длины волны максимального излучения в синюю сторону.

Во многих случаях было показано, что использование этого аналога нуклеотида TNP превосходит традиционные методы, основанные на радионуклеотидной маркировке . Проблемы со здоровьем и стоимость, связанная с использованием радиоактивных изотопов, делают TNP-ATP привлекательной альтернативой.

Первый флуоресцентно -модифицированный рибозой АТФ представляет собой 2',3'-O-(2,4,7-тринитроциклогексадиенилиден)аденозин-5'трифосфат (TNP-ATP) и был представлен в 1973 году Хирацукой и Учидой. TNP-ATP был первоначально синтезирован для исследования сайта связывания АТФ миозиновой АТФазы . Сообщения об успехах TNP-ATP в исследовании этого моторного белка расширили использование TNP-ATP на другие белки и ферменты. TNP-ATP в настоящее время используется в качестве спектроскопического зонда для многочисленных белков, предположительно имеющих АТФ-взаимодействия. К ним относятся несколько протеинкиназ , АТФазы , миозин и другие белки, связывающие нуклеотиды. За последние двадцать лет были опубликованы сотни статей, описывающих использование и применение TNP-ATP. Многие применения этого флуоресцентно меченного нуклеотида помогли прояснить структурно-функциональные взаимосвязи многих АТФ-требующих белков и ферментов. Также появляется все больше статей, в которых показано использование TNP-ATP как средство оценки АТФ-связывающей способности различных мутантных белков.

Подготовка

Получение TNP-ATP представляет собой одностадийный синтез, относительно безопасный и простой. Рибозная часть аденозина может быть тринитрофенилирована 2,4,6-тринитробензол-1-сульфонатом ( TNBS ). Полученное соединение приобретает ярко-оранжевый цвет и имеет видимые характеристики поглощения, что характерно для спирокомплексного соединения Мейзенхаймера, связывающего .

Чтобы узнать точный метод получения, обратитесь к статье Т. Хирацуки и К. Учиды «Получение и свойства 2'(r 3')-O(2,4,6-тринитрофенил)аденозин-5'-трифосфата, аналога. аденозинтрифосфата», найденного в справочном разделе.

Чтобы вернуть ТНП-АТФ обратно на составные части или, другими словами, гидролизовать ТНП-АТФ с образованием эквимолярных количеств пикриновой кислоты (ТНП) и АТФ, ТНП-АТФ следует обработать 1 М HCl при 100 градусах Цельсия в течение 1,5 часов. . Это связано с тем, что если TNP-ATP подкисляется в мягких условиях, это приводит к раскрытию диоксоланового кольца, присоединенного к 2'-кислороду, в результате чего единственным продуктом остается производное 3'O-TNP.

Хранилище

TNP-ATP следует хранить при температуре -20 °C, в темноте и использовать при минимальном освещении. Срок хранения TNP-ATP в растворе составляет около 30 дней.

pKa и изобестическая точка

Когда поглощение измеряли в зависимости от длины волны при различных значениях pH, изменения на длинах волн 408 нм и 470 нм давали сигмоидальную линию со средней точкой 5,1. Это указывало на то, что поглощение на этих двух длинах волн зависит от ионизации хромофорной части TNP-АТФ и не зависит от ионизации АТФ. Хотя эта константа ионизации 5,1 не находится в физиологическом диапазоне, было показано, что поглощение TNP-ATP достаточно чувствительно, чтобы обнаружить изменения, вызванные небольшими сдвигами нейтрального pH. Спектроскопическая точка TNP-ATP суперпозиция показала, что изобестическая равна 339 нм.

Константы и вычисления

При низких концентрациях TNP-ATP (≤1 мкМ) интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации добавленного TNP. Однако при концентрациях, превышающих 1 мкМ, эффекты внутреннего фильтра приводят к тому, что эта зависимость перестает быть линейной. Чтобы исправить это, исследователи должны определить соотношение прогнозируемой теоретической интенсивности флуоресценции (при условии линейности) к наблюдаемой интенсивности флуоресценции, а затем применить этот поправочный коэффициент. Однако в большинстве случаев исследователи стараются поддерживать концентрацию ТНП на уровне ниже 1 мкМ.

Для определения аффинности связывания к раствору добавляют TNP-ATP, а затем титруют белком. Это создает кривую насыщения, по которой можно определить аффинность связывания. Количество сайтов связывания также можно определить с помощью этой кривой насыщения, проверяя, есть ли внезапные изменения наклона. Можно также титровать фиксированное количество белка с увеличением количества TNP-ATP, чтобы получить кривую насыщения. Однако сделать это может быть сложно из-за эффектов внутреннего фильтра, которые необходимо будет скорректировать.

Чтобы определить константы диссоциации, TNP-ATP можно конкурировать с АТФ от белка. Затем значение константы диссоциации K _d для одноцентрового связывания можно получить, применив уравнение Ленгмюра для аппроксимации кривой:

$\mathrm {RFU_{obs}} =\mathrm {RFU_{free}} +{\frac {(\mathrm {RFU_{bound}} -\mathrm {RFU_{free}} )\times \left((\mathrm {[protein]_{total}} +\mathrm {[TNP]_{total}} +\mathrm {K_{d}} )-{\sqrt {(\mathrm {[protein]_{total}} +\mathrm {[TNP]_{total}} +\mathrm {K_{d}} )^{2}-(4\times \mathrm {[protein]_{total}} \times \mathrm {[TNP]} )}}\right)}{2\mathrm {[TNP]_{total}} }}$

где RFU — относительные единицы флуоресценции, RFU _obs — наблюдаемая флуоресценция, RFU _free — это флуоресценция свободного TNP-ATP, а RFU _{связанный} — это флуоресценция TNP-ATP при полном связывании с белком.

Чтобы измерить конкурента АТФ, можно добавить конкурента к предварительно инкубированным образцам белка: TNP-ATP. Фракцию TNP-ATP, связанную с белком, можно рассчитать по формуле:

$\theta ={\frac {\mathrm {RFU_{obs}} -\mathrm {RFU_{free}} }{\mathrm {RFU_{max}} -\mathrm {RFU_{free}} }}$

где θ — эта фракция, а RFU _max — значение интенсивности флуоресценции при насыщении, то есть когда связано 100% TNP-ATP.

Константы диссоциации для TNP и конкурента можно затем рассчитать по уравнению:

$\theta ={\frac {1}{2}}\mathrm {[TNP]} \times \left(\mathrm {K_{TNP}} +{\frac {\mathrm {K_{TNP}} }{\mathrm {K_{competitor}} }}\times \mathrm {[competitor]} +\mathrm {[TNP]} +\mathrm {[protein]} -{\sqrt {\left(\mathrm {K_{TNP}} +{\frac {\mathrm {K_{TNP}} }{\mathrm {K_{competitor}} }}\times \mathrm {[competitor]} +\mathrm {[TNP]} +\mathrm {[protein]} \right)^{2}-4\times \mathrm {[TNP]} \times \mathrm {[protein]} }}\right)$

По причинам, еще не до конца понятным, TNP-ATP обычно связывает сайты связывания АТФ с белками и ферментами в один-три раза прочнее, чем обычный АТФ. Константы диссоциации обычно составляют около 0,3–50 мкМ.

Другое использование

Помимо использования TNP-ATP для определения того, связывает ли белок АТФ, его аффинности связывания и констант диссоциации, а также количества сайтов связывания, TNP-ATP также можно использовать в исследованиях связывания лигандов. Для этого титры белка добавляют к TNP-ATP. Затем добавляется лиганд для замещения связанного аналога. Это измеряется уменьшением флуоресценции. Это также можно сделать путем титрования белка TNP-ATP в присутствии и в отсутствие различных концентраций интересующего лиганда. Использование любого эксперимента позволит измерить аффинность связывания лиганда с белком.

TNP-ATP также является ценным акцептором флуоресценции. Это связано с тем, что, как и любой хороший акцептор, TNP-ATP поглощает в широком диапазоне длин волн, который соответствует диапазону излучения обычных доноров FRET . Таким образом, TNP-ATP можно использовать для изучения конформационных изменений, которые претерпевают белки. Например, для Na+/K+-АТФазы было показано, что расстояние между активным сайтом и Cys457 изменяется от 25 ангстрем до 28 ангстрем при переходе от конформации Na+ к конформации K+.

Помимо флуоресцентной спектроскопии, TNP-ATP очень полезен во флуоресцентной микроскопии . Это связано с тем, что он значительно увеличивает чувствительность наблюдений при связывании с белками — усиленная флуоресценция значительно уменьшает проблему фоновой флуоресценции. Это особенно верно при эпифлуоресцентном освещении (освещение и свет находятся на одной и той же стороне образца).

TNP-ATP также использовался в рентгеновской кристаллографии, поскольку его можно использовать для определения констант связывания кристаллизованных субстратов. Этот метод также демонстрирует структуру белков в присутствии или в отсутствие TNP-АТФ, которая может соответствовать или не соответствовать структуре белков, когда они связывают АТФ.