Репрессилятор

Репрессилятор состоящую представляет собой генетическую регуляторную сеть, как минимум из одной петли обратной связи с как минимум тремя генами, каждый из которых экспрессирует белок, который репрессирует следующий ген в петле. ^{[ 1 ]} В биологических исследованиях репрессиляторы использовались для создания клеточных моделей и понимания функций клеток. Существуют как искусственные, так и естественные репрессиляторы. естественная цепь генов репрессиляторов в системах Arabidopsis thaliana ( A. thaliana Недавно была изучена ) и млекопитающих.

Искусственные репрессиляторы

Искусственные репрессиляторы были впервые разработаны Майклом Еловицем и Станисласом Лейблером в 2000 году. ^{[ 2 ]} дополняя другие исследовательские проекты, изучающие простые системы клеточных компонентов и функций. Чтобы понять и смоделировать конструкцию и клеточные механизмы, обеспечивающие функцию клетки, Эловиц и Лейблер создали искусственную сеть, состоящую из петли с тремя репрессорами транскрипции . Эта сеть была разработана с нуля, чтобы демонстрировать стабильные колебания, которые действуют как система электрических генераторов с фиксированными периодами времени. Сеть была реализована в Escherichia coli ( E.coli) посредством переноса рекомбинантной ДНК. Затем было подтверждено, что сконструированные колонии действительно демонстрируют желаемое колебательное поведение.

Репрессилятор состоит из трех генов, соединенных в петлю обратной связи , так что каждый ген репрессирует следующий ген в петле и подавляется предыдущим геном. При синтетической вставке в E. Coli в качестве репортера использовался зеленый флуоресцентный белок (GFP), так что поведение сети можно было наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии .

Генетическая регуляторная сеть репрессиляторов, в которой каждый белок, транслируемый геном, подавляет следующий в цикле.

При разработке репрессилятора использовались биологические и схемные принципы с дискретной и стохастической моделями анализа. Шесть дифференциальных уравнений использовались для моделирования кинетики репрессиляторной системы на основе концентраций белка и мРНК , а также соответствующих параметров и коэффициента Хилла значений . В своем исследовании Эловиц и Лейблер создали рисунки, показывающие колебания белков-репрессоров, используя интеграцию и типичные значения параметров, а также стохастическую версию модели репрессилятора с использованием аналогичных параметров. Эти модели были проанализированы для определения значений различных скоростей, которые привели бы к устойчивым колебаниям. Было обнаружено, что этим колебаниям благоприятствуют промоторы , связанные с эффективными сайтами связывания рибосом , кооперативными репрессорами транскрипции и сопоставимыми скоростями распада белка и мРНК.

Этот анализ определил две конструктивные особенности, которые были встроены в гены. Во-первых, промоторные области были заменены более эффективным гибридным промотором, который сочетал в себе E. coli фага промотор PL (λ PL) с операторными последовательностями lac-репрессора ( Lacl ) и Tet-репрессора ( TetR ). Во-вторых, чтобы уменьшить разницу между временем жизни белков-репрессоров и мРНК, метка на карбокси-конце, на 3'-конце каждого гена-репрессора была добавлена основанная на последовательности ssrA-РНК. Эта метка распознается протеазами, которые направляют белок на деградацию. Дизайн был реализован с использованием плазмиды с низкой копией , кодирующей репрессилятор, и репортера с более высокой копией, которые были использованы для трансформации культуры E. coli .

Природные репрессиляторы

Растения

Циркадные цепи у растений имеют петлю обратной связи, регулирующую транскрипцию, называемую репрессилятором. В петле основного осциллятора (обведенной серым цветом) у A. thaliana свет сначала воспринимается двумя криптохромами и пятью фитохромами . Два фактора транскрипции, Circadian Clock Associated 1 (CCA1) и Late Elongated Hypocotyl (LHY), подавляют гены, связанные с вечерней экспрессией, такие как определение времени экспрессии CAB 1 ( TOC1 ), и активируют гены, связанные с утренней экспрессией, путем связывания с их промоторами. TOC1 , вечерний ген, положительно регулирует CCA1 и LHY посредством неизвестного механизма. ^{[ 3 ]} Фактор вечерней фазы транскрипции CCA1 Hiking Expedition (CHE) и гистон-деметилаза jumonji C, содержащий домен 5 (JMJD5), непосредственно репрессируют CCA1 . Было обнаружено, что другие компоненты экспрессируются в течение дня и прямо или косвенно ингибируют или активируют соответствующий элемент циркадной цепи, создавая тем самым сложную, надежную и гибкую сеть петель обратной связи. ^{[ 3 ]}

Утренняя фаза экспрессии

Петля экспрессии утренней фазы относится к генам и белкам, которые регулируют ритмы в течение дня у A. thaliana . Двумя основными генами являются LHY и CCA1, которые кодируют факторы транскрипции LHY и CCA1. ^{[ 4 ]} Эти белки образуют гетеродимеры , которые проникают в ядро и связываются с промотором гена ТОС1 , подавляя выработку белка ТОС1. Когда экспрессируется белок TOC1, он регулирует LHY и CCA1 путем ингибирования их транскрипции. Позже в 2012 году это было подтверждено доктором Александрой Похило, которая с помощью компьютерного анализа показала, что TOC1 выполняет эту роль в качестве ингибитора экспрессии LHY и CCA1 . ^{[ 5 ]} Утренняя петля служит для ингибирования удлинения гипокотиля , в отличие от петли вечерней фазы, которая способствует удлинению гипокотиля. Было показано, что петля утренней фазы неспособна поддерживать циркадные колебания, когда гены экспрессии вечерней фазы мутированы. ^{[ 5 ]} что предполагает взаимозависимость каждого компонента этого естественного репрессилятора.

Вечерняя фаза экспрессии

Раннее цветение 3 ( ELF3 ), Раннее цветение 4 ( ELF4 ) и Phytoclock1 ( LUX ) являются ключевыми элементами экспрессии генов вечерних часов у A. thaliana. Они образуют вечерний комплекс, в котором LUX связывается с промоторами фактора взаимодействия фитохромов 4 ( PIF4 ) и фактора взаимодействия фитохромов 5 ( PIF5 ) и ингибирует их. ^{[ 3 ]} В результате удлинение гипокотиля подавляется ранним вечером. Когда поздно ночью торможение ослабляется, гипокотиль удлиняется. Фотопериод цветения контролируется выходным геном Gigantea ( GI ). GI активируется ночью и активирует экспрессию Констанса ( CO ), что активирует экспрессию Цветущего Локуса Т ( FT ). Затем FT вызывает цветение в течение длинного дня. ^{[ 3 ]}

Млекопитающие

У млекопитающих развился эндогенный механизм синхронизации, позволяющий координировать физиологию и поведение с 24-часовым периодом. ^{[ 6 ]} В 2016 году исследователи определили последовательность из трех последующих торможений в рамках этого механизма, который они определили как репрессилятор, который, как теперь полагают, служит основным ключевым элементом этой циркадной сети. Необходимость этой системы была установлена посредством серии нокаутов генов криптохрома ( Cry ), периода ( Per ) и Rev-erb — основных генов часов млекопитающих, нокауты которых приводят к аритмичности. ^{[ 6 ]} Модель, созданная этими исследователями, включает Bmal1 в качестве драйвера транскрипции, опосредованной E-box, Per2 и Cry1 как ранние и поздние репрессоры E-box соответственно, а также регулятор D-box Dbp и ядерный рецептор Rev-erb-α. . Последовательные торможения с помощью Rev-erb , Per и Cry1 могут генерировать устойчивые колебания, а при зажиме всех остальных компонентов, кроме этого репрессилятора, колебания сохраняются с одинаковыми амплитудами и периодами. ^{[ 6 ]} Все колебательные сети, по-видимому, включают в себя любую комбинацию этих трех основных генов, как показано на различных схемах, опубликованных исследователями.

Недавние работы

Модель репрессилятора использовалась для моделирования и изучения других биологических путей и систем. С тех пор была проведена обширная работа по моделированию репрессилятора. В 2003 году представление репрессилятором и проверка биологических моделей, представляющих собой модель со многими переменными, были выполнены с использованием системы Simpathica, которая подтвердила, что модель действительно колеблется со всеми ее сложностями.

Как указано в оригинальной работе Эловица и Лейблера, конечная цель исследования репрессиляторов — создать искусственные циркадные часы, которые отражают свои природные, эндогенные аналоги. Это потребует разработки искусственных часов с пониженным уровнем шума и температурной компенсацией, чтобы лучше понять циркадные ритмы, которые можно обнаружить во всех сферах жизни. ^{[ 7 ]} Нарушение циркадных ритмов может привести к потере ритмичности метаболических и транскрипционных процессов и даже ускорить возникновение некоторых нейродегенеративных заболеваний , таких как болезнь Альцгеймера . ^{[ 8 ]} В 2017 году в лаборатории были созданы осцилляторы, генерирующие циркадные ритмы и не сильно влияющие на температуру. ^{[ 6 ]}

Что касается патологии , то модель репрессилятора можно использовать для моделирования роста клеток и возможных аномалий, например, присутствующих в раковых клетках. ^{[ 9 ]} При этом могут быть разработаны новые методы лечения, основанные на циркадной активности раковых клеток. Кроме того, в 2016 году исследовательская группа усовершенствовала предыдущую конструкцию репрессилятора. После анализа шума (обработки сигналов) авторы переместили репортерную конструкцию GFP на плазмиду-репрессилятор и удалили метки деградации ssrA из каждого белка-репрессора. Это увеличило период и улучшило регулярность колебаний репрессилятора. ^{[ 10 ]}

В 2019 году исследование дополнило модель Эловица и Лейблера, улучшив репрессиляторную систему за счет создания модели с уникальным устойчивым состоянием и новой функцией скорости. Этот эксперимент расширил современные знания о репрессии и регуляции генов . ^{[ 11 ]}

Значение

Синтетическая биология

Искусственные репрессиляторы были открыты путем имплантации синтетической петли ингибирования в E. coli . Это представляло собой первое внедрение синтетических колебаний в организм. Дальнейшие последствия этого включают возможность синтетического спасения мутировавших компонентов колебаний в модельных организмах. ^{[ 7 ]}

Искусственный репрессилятор является важной вехой в синтетической биологии, которая показывает, что генетические регуляторные сети могут быть спроектированы и реализованы для выполнения новых функций. Однако было обнаружено, что колебания клеток с течением времени смещались по фазе, и на активность искусственного репрессилятора влиял рост клеток. Первоначальный эксперимент ^{[ 7 ]} поэтому дал новую оценку циркадным часам, обнаруженным у многих организмов, поскольку эндогенные репрессиляторы значительно более надежны, чем имплантированные искусственные репрессиляторы. Новые исследования в Центре количественной биологии RIKEN показали, что химические модификации одной молекулы белка могут образовывать независимый от температуры самоподдерживающийся осциллятор. ^{[ 12 ]}

Искусственные репрессиляторы потенциально могут помочь в исследованиях и лечении в самых разных областях — от циркадной биологии до эндокринологии. Они все чаще способны демонстрировать синхронизацию, присущую природным биологическим системам и факторам, которые на них влияют. ^{[ 13 ]}

Циркадная биология

Лучшее понимание естественного репрессилятора в модельных организмах с эндогенными циркадными ритмами, таких как A. thaliana, может найти применение в сельском хозяйстве, особенно в отношении выращивания растений и управления животноводством. ^{[ 14 ]}

Ссылки

^ Оливейра, Сэмюэл, доктор медицины; Чандрасилан, Джером Г.; Хаккинен, Антти; Гонсалвес, Надя С.М.; Юли-Харья, Олли; Старцева, София; Рибейро, Андре С. (2015). «Одноклеточная кинетика репрессилятора при реализации в однокопийной плазмиде». Мол. БиоСист . 11 (7): 1939–1945. дои : 10.1039/c5mb00012b . ПМИД 25923804 .
^ Станислас Лейблер; Еловиц, Майкл Б. (20 января 2000 г.). «Синтетическая колебательная сеть регуляторов транскрипции». Природа . 403 (6767): 335–338. Бибкод : 2000Natur.403..335E . дои : 10.1038/35002125 . ISSN 1476-4687 . ПМИД 10659856 . S2CID 41632754 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Кей, Стив А.; Нагель, Дон Х. (21 августа 2012 г.). «Сложность организации и регуляции циркадных сетей растений» . Современная биология . 22 (16): Р648–Р657. дои : 10.1016/j.cub.2012.07.025 . ISSN 0960-9822 . ПМЦ 3427731 . ПМИД 22917516 .
^ Сюй, Полли Иншань; Хармер, Стейси Л. (весна 2014 г.). «Колеса в колесах: циркадная система растений» . Тенденции в науке о растениях . 19 (4): 240–249. doi : 10.1016/j.tplants.2013.11.007 . ISSN 1360-1385 . ПМЦ 3976767 . ПМИД 24373845 .
^ Jump up to: ^а ^б Похилко, Александра; Фернандес, Аврора Пиньяс; Эдвардс, Кирон Д; Саузерн, Меган М; Холлидей, Карен Дж; Миллар, Эндрю Дж (13 марта 2012 г.). «Цепь часового гена Arabidopsis включает в себя репрессилятор с дополнительными петлями обратной связи» . Молекулярная системная биология . 8 : 574. дои : 10.1038/msb.2012.6 . ISSN 1744-4292 . ПМК 3321525 . ПМИД 22395476 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Ву, Лили; Оуян, Ци; Ван, Хунли (2 февраля 2017 г.). «Надежные сетевые топологии для генерации колебаний с периодами, не зависящими от температуры» . ПЛОС ОДИН . 12 (2): e0171263. Бибкод : 2017PLoSO..1271263W . дои : 10.1371/journal.pone.0171263 . ISSN 1932-6203 . ПМК 5289577 . ПМИД 28152061 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Синтетическая колебательная сеть регуляторов транскрипции; Майкл Еловиц и Станислас Лейблер ; Природа. 20 января 2000 г.; 403 (6767): 335-8.
^ Гомолак, Ян; Мудрович, Моника; Вукич, Барбара; Тольян, Карло (21 июня 2018 г.). «Циркадный ритм и болезнь Альцгеймера» . Медицинские науки . 6 (3): 52. doi : 10.3390/medsci6030052 . ISSN 2076-3271 . ПМК 6164904 . ПМИД 29933646 .
^ Шиманская, Зузанна; Цитовский, Мацей; Митчелл, Элейн; Макнамара, Сисели К.; Капеллан Марк Эй Джей (май 2018 г.). «Вычислительное моделирование развития и роста рака: моделирование в нескольких масштабах и многомасштабное моделирование» (PDF) . Бюллетень математической биологии . 80 (5): 1366–1403. дои : 10.1007/s11538-017-0292-3 . hdl : 10023/14364 . ISSN 1522-9602 . ПМИД 28634857 . S2CID 4009271 .
^ Потвен-Троттье, Лоран; Лорд, Натан Д.; Винникомб, Гленн; Паулссон, Йохан (27 октября 2016 г.). «Синхронные долговременные колебания в синтетической генной цепи» . Природа . 538 (7626): 514–517. Бибкод : 2016Natur.538..514P . дои : 10.1038/nature19841 . ПМК 5637407 . ПМИД 27732583 .
^ Тайлер, Джонатан; Шиу, Энн; Уолтон, Джей (30 марта 2019 г.). «Возвращаясь к синтетической внутриклеточной регуляторной сети, демонстрирующей колебания». Журнал математической биологии . 78 (7): 2341–2368. arXiv : 1808.00595 . дои : 10.1007/s00285-019-01346-3 . ISSN 1432-1416 . ПМИД 30929046 . S2CID 51907979 .
^ Джолли, Крейг С.; Ода, Кодзи Л.; Уэда, Хироки Р. (2012). «Принцип конструкции посттрансляционного биохимического осциллятора» . Отчеты по ячейкам . 2 (4): 938–950. дои : 10.1016/j.celrep.2012.09.006 . ISSN 2211-1247 . ПМИД 23084745 .
^ Гарсия-Охальво, Хорди; Еловиц, Майкл Б.; Строгац, Стивен Х. (27 июля 2004 г.). «Моделирование синтетических многоклеточных часов: репрессиляторы, связанные с ощущением кворума» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 101 (30): 10955–10960. Бибкод : 2004PNAS..10110955G . дои : 10.1073/pnas.0307095101 . ISSN 0027-8424 . ПМК 503725 . ПМИД 15256602 .
^ Готлиб, Дафна (29 июня 2019 г.). «Агрохронобиология: интеграция циркадных часов / биологии времени в управление хранением». Журнал исследований хранимых продуктов . 82 : 9–16. дои : 10.1016/j.jspr.2019.03.003 . ISSN 0022-474X . S2CID 109800308 .

Внешние ссылки

Прямая ссылка на модель репрессилятора и описание в базе данных BioModels.
Моделирование репрессилятора в R: https://gist.github.com/AndreyAkinshin/37f3e68a1576f9ea1e5c01f2fd64fe5e
Онлайн-симуляция репрессилятора: https://www.yschaerli.com/repressilator.html.
Схема A. системы петель обратной связи у thaliana
Прямая ссылка на информацию о гене CCA1 и его роли в A. thaliana.

[1] Оливейра, Сэмюэл, доктор медицины; Чандрасилан, Джером Г.; Хаккинен, Антти; Гонсалвес, Надя С.М.; Юли-Харья, Олли; Старцева, София; Рибейро, Андре С. (2015). «Одноклеточная кинетика репрессилятора при реализации в однокопийной плазмиде». Мол. БиоСист . 11 (7): 1939–1945. дои : 10.1039/c5mb00012b . ПМИД 25923804 .

[2] Станислас Лейблер; Еловиц, Майкл Б. (20 января 2000 г.). «Синтетическая колебательная сеть регуляторов транскрипции». Природа . 403 (6767): 335–338. Бибкод : 2000Natur.403..335E . дои : 10.1038/35002125 . ISSN 1476-4687 . ПМИД 10659856 . S2CID 41632754 .

[:0-3] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Кей, Стив А.; Нагель, Дон Х. (21 августа 2012 г.). «Сложность организации и регуляции циркадных сетей растений» . Современная биология . 22 (16): Р648–Р657. дои : 10.1016/j.cub.2012.07.025 . ISSN 0960-9822 . ПМЦ 3427731 . ПМИД 22917516 .

[4] Сюй, Полли Иншань; Хармер, Стейси Л. (весна 2014 г.). «Колеса в колесах: циркадная система растений» . Тенденции в науке о растениях . 19 (4): 240–249. doi : 10.1016/j.tplants.2013.11.007 . ISSN 1360-1385 . ПМЦ 3976767 . ПМИД 24373845 .

[:1-5] Jump up to: ^а ^б Похилко, Александра; Фернандес, Аврора Пиньяс; Эдвардс, Кирон Д; Саузерн, Меган М; Холлидей, Карен Дж; Миллар, Эндрю Дж (13 марта 2012 г.). «Цепь часового гена Arabidopsis включает в себя репрессилятор с дополнительными петлями обратной связи» . Молекулярная системная биология . 8 : 574. дои : 10.1038/msb.2012.6 . ISSN 1744-4292 . ПМК 3321525 . ПМИД 22395476 .

[:2-6] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Ву, Лили; Оуян, Ци; Ван, Хунли (2 февраля 2017 г.). «Надежные сетевые топологии для генерации колебаний с периодами, не зависящими от температуры» . ПЛОС ОДИН . 12 (2): e0171263. Бибкод : 2017PLoSO..1271263W . дои : 10.1371/journal.pone.0171263 . ISSN 1932-6203 . ПМК 5289577 . ПМИД 28152061 .

[repressilator-7] Jump up to: ^а ^б ^с Синтетическая колебательная сеть регуляторов транскрипции; Майкл Еловиц и Станислас Лейблер ; Природа. 20 января 2000 г.; 403 (6767): 335-8.

[8] Гомолак, Ян; Мудрович, Моника; Вукич, Барбара; Тольян, Карло (21 июня 2018 г.). «Циркадный ритм и болезнь Альцгеймера» . Медицинские науки . 6 (3): 52. doi : 10.3390/medsci6030052 . ISSN 2076-3271 . ПМК 6164904 . ПМИД 29933646 .

[9] Шиманская, Зузанна; Цитовский, Мацей; Митчелл, Элейн; Макнамара, Сисели К.; Капеллан Марк Эй Джей (май 2018 г.). «Вычислительное моделирование развития и роста рака: моделирование в нескольких масштабах и многомасштабное моделирование» (PDF) . Бюллетень математической биологии . 80 (5): 1366–1403. дои : 10.1007/s11538-017-0292-3 . hdl : 10023/14364 . ISSN 1522-9602 . ПМИД 28634857 . S2CID 4009271 .

[10] Потвен-Троттье, Лоран; Лорд, Натан Д.; Винникомб, Гленн; Паулссон, Йохан (27 октября 2016 г.). «Синхронные долговременные колебания в синтетической генной цепи» . Природа . 538 (7626): 514–517. Бибкод : 2016Natur.538..514P . дои : 10.1038/nature19841 . ПМК 5637407 . ПМИД 27732583 .

[11] Тайлер, Джонатан; Шиу, Энн; Уолтон, Джей (30 марта 2019 г.). «Возвращаясь к синтетической внутриклеточной регуляторной сети, демонстрирующей колебания». Журнал математической биологии . 78 (7): 2341–2368. arXiv : 1808.00595 . дои : 10.1007/s00285-019-01346-3 . ISSN 1432-1416 . ПМИД 30929046 . S2CID 51907979 .

[12] Джолли, Крейг С.; Ода, Кодзи Л.; Уэда, Хироки Р. (2012). «Принцип конструкции посттрансляционного биохимического осциллятора» . Отчеты по ячейкам . 2 (4): 938–950. дои : 10.1016/j.celrep.2012.09.006 . ISSN 2211-1247 . ПМИД 23084745 .

[13] Гарсия-Охальво, Хорди; Еловиц, Майкл Б.; Строгац, Стивен Х. (27 июля 2004 г.). «Моделирование синтетических многоклеточных часов: репрессиляторы, связанные с ощущением кворума» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 101 (30): 10955–10960. Бибкод : 2004PNAS..10110955G . дои : 10.1073/pnas.0307095101 . ISSN 0027-8424 . ПМК 503725 . ПМИД 15256602 .

[14] Готлиб, Дафна (29 июня 2019 г.). «Агрохронобиология: интеграция циркадных часов / биологии времени в управление хранением». Журнал исследований хранимых продуктов . 82 : 9–16. дои : 10.1016/j.jspr.2019.03.003 . ISSN 0022-474X . S2CID 109800308 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]