✖


Jump to content

Доклиническая визуализация

(Перенаправлено с изображений In vivo )

Доклиническая визуализация — это визуализация живых животных в исследовательских целях. [1] например, разработка лекарств. Методы визуализации уже давно имеют решающее значение для исследователей при наблюдении изменений на органном, тканевом, клеточном или молекулярном уровне у животных, реагирующих на физиологические изменения или изменения окружающей среды. Неинвазивные методы визуализации in vivo стали особенно важными для продольного изучения моделей животных. В широком смысле эти системы визуализации можно разделить на преимущественно морфологические/анатомические и преимущественно молекулярные методы визуализации. [2] Такие методы, как высокочастотное микроультразвук, магнитно-резонансная томография (МРТ) и компьютерная томография (КТ), обычно используются для анатомической визуализации, тогда как оптическая визуализация ( флуоресценция и биолюминесценция ), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и однофотонная эмиссионная компьютерная томография. Томография (ОФЭКТ) обычно используется для молекулярной визуализации. [2]

В наши дни многие производители предлагают мультимодальные системы, сочетающие преимущества анатомических методов, таких как КТ и МРТ, с функциональной визуализацией ПЭТ и ОФЭКТ. Как и на клиническом рынке, распространенными комбинациями являются ОФЭКТ/КТ , ПЭТ/КТ и ПЭТ/МР . [ нужна ссылка ]

МикроУЗИ

[ редактировать ]

Принцип: Высокочастотный микроультразвук генерирует безвредные звуковые волны от датчиков в живые системы. Когда звуковые волны распространяются через ткани, они отражаются обратно и улавливаются датчиком, а затем могут быть преобразованы в 2D- и 3D-изображения. Микроультразвук специально разработан для исследований на мелких животных и имеет частоты в диапазоне от 15 МГц до 80 МГц. [3]

Сильные стороны: микроультразвук сам по себе является единственным методом визуализации в реальном времени, позволяющим собирать данные со скоростью до 1000 кадров в секунду. Это означает, что он не только способен визуализировать кровоток in vivo , но и может быть использован для изучения высокоскоростных событий, таких как кровоток и сердечная функция у мышей. Микроультразвуковые системы портативны, не требуют специального оборудования и чрезвычайно экономичны по сравнению с другими системами. Он также не несет риска искажать результаты из-за побочных эффектов радиации. В настоящее время возможна визуализация размером до 30 мкм. [3] позволяющая визуализировать крошечную сосудистую сеть при раковом ангиогенезе . Для изображения капилляров это разрешение можно увеличить до 3–5 мкм за счет введения микропузырькового контрастного вещества. Кроме того, микропузырьки могут быть конъюгированы с такими маркерами, как активированные рецепторы гликопротеина IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) на тромбоцитах и ​​сгустках. [4] α v β 3 интегрин, а также рецепторы фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR) для обеспечения молекулярной визуализации. Таким образом, он способен найти широкий спектр применений, которые могут быть достигнуты только с помощью двойных методов визуализации, таких как микро-МРТ/ПЭТ. Устройства микроультразвука обладают уникальными свойствами, относящимися к интерфейсу ультразвуковых исследований , благодаря которому пользователи этих устройств получают доступ к необработанным данным, которые обычно недоступны в большинстве коммерческих ультразвуковых (микро- и немикро) систем.

Слабые стороны: В отличие от микро-МРТ, микро-КТ, микро-ПЭТ и микро-ОФЭКТ, микро-УЗИ имеет ограниченную глубину проникновения. По мере увеличения частоты (и разрешения) максимальная глубина изображения уменьшается. Обычно микроультразвук позволяет визуализировать ткани на глубине около 3 см под кожей, и этого более чем достаточно для мелких животных, таких как мыши. Часто считается, что качество ультразвуковой визуализации связано с опытом и навыками оператора. Однако ситуация быстро меняется, поскольку системы превращаются в удобные для пользователя устройства, дающие высоковоспроизводимые результаты. Еще одним потенциальным недостатком микроультразвука является то, что целевые контрастные вещества в виде микропузырьков не могут диффундировать из сосудистой сети даже в опухолях. Однако на самом деле это может быть полезно для таких приложений, как визуализация перфузии опухоли и ангиогенеза.

Исследования рака. Достижения в области микроультразвука помогли исследованиям рака множеством способов. Например, исследователи могут легко оценить размер опухоли в двух и трех измерениях. Мало того, скорость и направление кровотока также можно наблюдать с помощью ультразвука. Кроме того, микроультразвук можно использовать для обнаружения и количественной оценки кардиотоксичности в ответ на противоопухолевую терапию, поскольку это единственный метод визуализации, обеспечивающий мгновенное получение изображения. Благодаря своей природе в режиме реального времени микроультразвук может также направлять микроинъекции лекарств, стволовых клеток и т. д. мелким животным без необходимости хирургического вмешательства. Животному можно вводить контрастные вещества для перфузии опухоли в реальном времени, целевой молекулярной визуализации и количественного определения биомаркеров . Недавно [ когда? ] Было даже доказано, что микроультразвук является эффективным методом доставки генов. [5]

Функциональное УЗИ головного мозга

[ редактировать ]

Было показано, что в отличие от обычного микроультразвукового устройства с ограниченной чувствительностью к кровотоку, специальные сверхбыстрые ультразвуковые сканеры, работающие в режиме реального времени, с соответствующей последовательностью и обработкой, способны фиксировать очень тонкие гемодинамические изменения в мозге мелких животных в режиме реального времени. Эти данные затем можно использовать для вывода о нейрональной активности посредством нейроваскулярной связи. Метод функциональной ультразвуковой визуализации (фУЗ) можно рассматривать как аналог функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ). ФУЗ можно использовать для ангиографии головного мозга, картирования функциональной активности мозга, установления функциональной связи мозга у мышей с приматами, включая бодрствующих животных.

Микро-ПАТ

[ редактировать ]

Принцип: Фотоакустическая томография (ПАТ) использует естественное явление термоэластичного расширения тканей при стимуляции внешними электромагнитными волнами, такими как короткие лазерные импульсы. Это приводит к излучению ультразвуковых волн из этих тканей, которые затем могут быть уловлены ультразвуковым датчиком. Термоупругое расширение и возникающая в результате ультразвуковая волна зависят от длины волны используемого света. PAT обеспечивает полную неинвазивность при визуализации животного. Это особенно важно при работе с моделями опухолей головного мозга. [6] которые, как известно, трудно изучать.

Сильные стороны: Micro-PAT можно охарактеризовать как метод визуализации, применимый для выполнения самых разных функций. Он сочетает в себе высокую чувствительность оптического изображения с высоким пространственным разрешением ультразвукового изображения. По этой причине он может не только отображать структуру, но и разделять различные типы тканей, изучать гемодинамические реакции и даже отслеживать молекулярные контрастные вещества, конъюгированные с конкретными биологическими молекулами. Кроме того, он неинвазивный и может быть быстро выполнен, что делает его идеальным для продольных исследований одного и того же животного.

Слабые стороны: Поскольку микро-ПАТ по-прежнему ограничен проникающей силой света и звука, он не имеет неограниченной глубины проникновения. Однако достаточно пройти через череп крысы и изображение на глубину до нескольких сантиметров, что более чем достаточно для большинства исследований на животных. Еще одним недостатком микро-ПАТ является то, что для получения обратной связи он использует оптическое поглощение ткани, поэтому плохо васкуляризированную ткань, такую ​​как простата, трудно визуализировать. [7] На сегодняшний день на рынке представлены три коммерчески доступные системы, а именно: VisualSonics, iThera и Endra, последняя из которых является единственной машиной, выполняющей реальное получение 3D-изображений.

Исследования рака. Изучение рака головного мозга значительно затруднено из-за отсутствия простого метода визуализации для изучения животных in vivo . Для этого часто требуется краниотомия , а также многочасовая анестезия, искусственная вентиляция легких и т. д., что существенно изменяет параметры эксперимента. По этой причине многие исследователи довольствовались умерщвлением животных в разные моменты времени и изучением ткани мозга традиционными гистологическими методами. По сравнению с лонгитюдным исследованием in vivo для получения значимых результатов необходимо гораздо больше животных, и чувствительность всего эксперимента подвергается сомнению. Как говорилось ранее, проблема заключается не в нежелании исследователей использовать методы визуализации in vivo , а в отсутствии подходящих методов. Например, хотя оптическая визуализация обеспечивает быстрые функциональные данные и окси- и дезокси -гемоглобина , анализ [7] он требует краниотомии и обеспечивает глубину проникновения всего несколько сотен микрометров. Более того, оно сосредоточено на одной области мозга, в то время как исследования ясно показали, что функции мозга в целом взаимосвязаны. С другой стороны, микрофМРТ чрезвычайно дорога и обеспечивает неудовлетворительное разрешение и время получения изображения при сканировании всего мозга. Он также предоставляет мало информации о сосудах. Было продемонстрировано, что Micro-PAT является значительным улучшением по сравнению с существующими in vivo устройствами нейровизуализации . Он быстрый, неинвазивный и обеспечивает множество выводимых данных. Микро-ПАТ может отображать мозг с высоким пространственным разрешением, обнаруживать молекулярно-направленные контрастные вещества, одновременно определять количественные функциональные параметры, такие как SO2 и HbT, а также предоставлять дополнительную информацию от функциональной и молекулярной визуализации, которая была бы чрезвычайно полезна при количественной оценке опухолей и клеточно-центрированной терапии. анализ. [6]

Микро-МРТ

[ редактировать ]

Принцип: Магнитно-резонансная томография (МРТ) использует ядерное магнитное расположение различных атомов внутри магнитного поля для создания изображений. Аппараты МРТ состоят из больших магнитов, которые генерируют магнитные поля вокруг объекта анализа. [8] Эти магнитные поля заставляют атомы с ненулевым спиновым квантовым числом, такие как водород, гадолиний и марганец, выравниваться с магнитным диполем вдоль магнитного поля. частоте ларморовской Подается радиочастотный (РЧ) сигнал, точно соответствующий прецессии ядер-мишени, нарушая выравнивание ядер с магнитным полем. После радиочастотного импульса ядра расслабляются и излучают характерный радиочастотный сигнал, который улавливается машиной. Используя эти данные, компьютер сгенерирует изображение объекта на основе резонансных характеристик различных типов тканей.

Безкриогенная доклиническая система МРТ 7T – это серия MRS 7000.

С 2012 года использование технологии безкриогенных магнитов значительно снизило требования к инфраструктуре и зависимость от доступности криогенных охлаждающих жидкостей, которые становится все труднее получить. [9]

Сильные стороны: Преимущество микро-МРТ заключается в том, что она имеет хорошее пространственное разрешение — до 100 мкм и даже 25 мкм в магнитных полях очень высокой силы. Он также имеет превосходное контрастное разрешение, позволяющее различать нормальные и патологические ткани. Микро-МРТ можно использовать в самых разных целях, включая анатомическую, функциональную и молекулярную визуализацию. Более того, поскольку механизм микро-МРТ основан на магнитном поле, он намного безопаснее по сравнению с методами визуализации на основе излучения, такими как микро-КТ и микро-ПЭТ.

Слабые стороны: Одним из самых больших недостатков микро-МРТ является ее стоимость. В зависимости от магнитной силы (которая определяет разрешение) системы, используемые для визуализации животных с плотностью магнитного потока от 1,5 до 14 тесла, варьируются от 1 до более 6 миллионов долларов, при этом стоимость большинства систем составляет около 2 миллионов долларов. Кроме того, время получения изображения чрезвычайно велико: минуты и даже часы. Это может отрицательно повлиять на животных, находящихся под наркозом в течение длительного периода времени. Кроме того, микро-МРТ обычно делает снимок объекта во времени, и поэтому он не может хорошо изучить кровоток и другие процессы в реальном времени. Даже несмотря на недавние достижения в области высокоинтенсивной функциональной микро-МРТ, для достижения пиковой интенсивности сигнала все еще требуется около 10–15 секунд задержки. [10] затрудняет доступ к важной информации, такой как количественная оценка скорости кровотока.

Исследование рака: микро-МРТ часто используется для визуализации мозга из-за ее способности неинвазивно проникать в череп. Благодаря высокому разрешению микроМРТ также позволяет обнаруживать на ранних стадиях опухоли небольшого размера. Связанные с антителами парамагнитные наночастицы также можно использовать для повышения разрешения и визуализации молекулярной экспрессии в системе. [2]

Исследование инсульта и черепно-мозговой травмы. МикроМРТ часто используется для анатомической визуализации при исследовании инсульта и черепно-мозговой травмы. Молекулярная визуализация — новая область исследований. [11] [12]

МикроКТ

[ редактировать ]
Система микроКТ
Объемная визуализация реконструированной КТ черепа мыши.

Принцип: компьютерная томография (КТ) работает с помощью рентгеновских лучей, испускаемых сфокусированным источником излучения, который вращается вокруг испытуемого, помещенного в середину компьютерного томографа. [2] Рентгеновское излучение ослабляется с разной скоростью в зависимости от плотности ткани, через которую оно проходит, а затем улавливается датчиками на противоположном конце компьютерного томографа от источника излучения. В отличие от традиционного 2D-рентгенографии, поскольку источник излучения в компьютерном томографе вращается вокруг животного, серию 2D-изображений затем можно объединить с помощью компьютера в 3D-структуры.

Сильные стороны: МикроКТ может иметь превосходное пространственное разрешение, которое может достигать 6 мкм в сочетании с контрастными веществами. Однако доза радиации, необходимая для достижения такого разрешения, смертельна для мелких животных, а пространственное разрешение 50 мкм лучше отражает пределы микроКТ. Это также прилично с точки зрения времени получения изображения, которое для мелких животных может достигать нескольких минут. [8] Кроме того, микроКТ отлично подходит для визуализации костей.

Слабые стороны: Одним из основных недостатков микроКТ является доза радиации , воздействующая на подопытных животных. Хотя это, как правило, не смертельно, радиация достаточно высока, чтобы повлиять на иммунную систему и другие биологические пути, что в конечном итоге может изменить результаты экспериментов. [13] Кроме того, радиация может влиять на размер опухоли в моделях рака, поскольку она имитирует лучевую терапию , и поэтому могут потребоваться дополнительные контрольные группы для учета этой потенциальной мешающей переменной . Кроме того, контрастное разрешение микроКТ довольно плохое, и поэтому оно не подходит для различения схожих типов тканей, например, нормальных и больных тканей.

Исследования рака. МикроКТ чаще всего используется в качестве системы анатомической визуализации при исследованиях на животных из-за преимуществ, упомянутых ранее. Контрастные вещества также можно вводить для изучения кровотока. Однако контрастные вещества для микроКТ, такие как йод, трудно конъюгировать с молекулярными мишенями1, и поэтому они редко используются в методах молекулярной визуализации. Таким образом, микроКТ часто комбинируют с микроПЭТ/ОФЭКТ для анатомической и молекулярной визуализации в исследованиях. [14]

Микро-ПЭТ

[ редактировать ]

Принцип: Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) позволяет получать изображения живых систем путем регистрации высокоэнергетических γ-лучей, излучаемых изнутри объекта. [15] Источником излучения являются биологические молекулы, связанные с испусканием позитронов, такие как 18F-ФДГ (флудезоксиглюкоза), которые вводятся испытуемому. При распаде радиоизотопов они испускают позитроны, которые аннигилируют с электронами, естественным образом присутствующими в организме. При этом образуются два гамма-луча, расположенные на расстоянии ~ 180° друг от друга, которые улавливаются датчиками на противоположных концах ПЭТ-машины. Это позволяет локализовать отдельные события излучения внутри тела, а набор данных реконструировать для создания изображений.

Сильные стороны: Преимущество микро-ПЭТ заключается в том, что, поскольку источник радиации находится внутри животного, глубина визуализации практически неограничена. Время сбора данных также достаточно быстрое, обычно около минут. Поскольку разные ткани имеют разную скорость поглощения молекулярных зондов, меченных радиоактивным изотопом, микроПЭТ также чрезвычайно чувствителен к молекулярным деталям, и поэтому для визуализации необходимы только нанограммы молекулярных зондов. [15]

Слабые стороны: Радиоактивные изотопы, используемые в микроПЭТ, имеют очень короткий период полураспада (110 минут для 18F-ФДГ). Чтобы генерировать эти изотопы, в радиохимических лабораториях необходимы циклотроны, расположенные в непосредственной близости от машин микроПЭТ. Кроме того, радиация может влиять на размер опухоли в моделях рака, поскольку она имитирует лучевую терапию, и поэтому могут потребоваться дополнительные контрольные группы для учета этой потенциальной мешающей переменной. Микро-ПЭТ также имеет плохое пространственное разрешение — около 1 мм. Чтобы провести всестороннее исследование, включающее не только молекулярную, но и анатомическую визуализацию, микро-ПЭТ необходимо использовать в сочетании с микро-МРТ или микро-КТ, что еще больше снижает доступность для многих исследователей из-за высокой стоимости и специализации. удобства.

Исследования рака: ПЭТ обычно широко используется в клинической онкологии, поэтому результаты исследований на мелких животных легко интерпретируются. Из-за того, как 18F-ФДГ метаболизируется в тканях, он приводит к интенсивному радиоактивному мечению при большинстве видов рака, таких как опухоли головного мозга и печени. С помощью микроПЭТ можно отследить практически любое биологическое соединение, если оно может быть конъюгировано с радиоизотопом, что делает его пригодным для изучения новых путей.

Микро-ОФЭКТ

[ редактировать ]
Основная статья: Доклиническая ОФЭКТ
Высокое разрешение 99 м ОФЭКТ-сканирование мыши Tc-MDP: анимированное изображение вращающихся проекций максимальной интенсивности.

Принцип: Подобно ПЭТ, однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) также позволяет визуализировать живые системы посредством гамма-лучей, излучаемых изнутри объекта. В отличие от ПЭТ, радиоизотопы, используемые в ОФЭКТ (например, технеций-99m ), излучают γ-лучи напрямую. [8] а не от событий аннигиляции позитрона и электрона. Эти лучи затем фиксируются γ-камерой, вращающейся вокруг объекта, и впоследствии преобразуются в изображения.

Сильные стороны: Преимущество этого подхода заключается в том, что ядерные изотопы гораздо более доступны, дешевле и имеют более длительный период полураспада по сравнению с изотопами микроПЭТ. Как и микро-ПЭТ, микро-ОФЭКТ также имеет очень хорошую чувствительность и требует всего лишь нанограммов молекулярных зондов. [15] Кроме того, благодаря использованию радиоизотопов разной энергии, конъюгированных с разными молекулярными мишенями, микро-ОФЭКТ имеет преимущество перед микро-ПЭТ, поскольку позволяет одновременно отображать несколько молекулярных событий. В то же время, в отличие от микро-ПЭТ, микро-ОФЭКТ может достигать очень высокого пространственного разрешения за счет изучения принципа точечной коллимации (Бикман и др.). [16] В этом подходе, поместив объект (например, грызуна) близко к апертуре обскуры, можно достичь большого увеличения его проекции на поверхность детектора и эффективно компенсировать собственное разрешение кристалла.

Слабые стороны: Микро-ОФЭКТ все еще имеет значительное излучение, которое может повлиять на физиологические и иммунологические пути у мелких животных. Кроме того, радиация может влиять на размер опухоли в моделях рака, поскольку она имитирует лучевую терапию , и поэтому могут потребоваться дополнительные контрольные группы для учета этой потенциальной мешающей переменной . Микро-ОФЭКТ также может быть на два порядка менее чувствителен, чем ПЭТ. [2] Кроме того, для мечения соединений изотопами микро-ОФЭКТ требуются хелатирующие молярности, которые могут изменить их биохимические или физические свойства.

Исследования рака. Микро-ОФЭКТ часто используется в исследованиях рака для молекулярной визуализации ракоспецифичных лигандов. Его также можно использовать для визуализации мозга из-за его проникающей способности. Поскольку новые радиоизотопы включают в себя наночастицы, такие как наночастицы оксида железа, меченные 99mTC , в будущем их потенциально можно будет комбинировать с системами доставки лекарств. [14]

Следующие системы ОФЭКТ для мелких животных были разработаны в различных группах и доступны коммерчески:

Ссылка Бренд Описание системы Радиус вращения (см) Разрешение (мм) Чувствительность (Имп/с/МБк)
Саджеди и др.,

2014, [17]

HiReSPECT [18] Пиксельные кристаллы CsI(Tl),

Коллиматор с параллельными отверстиями LEHR,Визуализация крыс и мышей

25 1.7 36
Магота и др.,

2011, [19]

Инвеон кристаллы NaI(Tl),

Коллиматоры с одинарным отверстием 0,5 мм

25 0.84 35.3
ван дер Хаве и др.,

2009, Ivashchenko et al., 2015, [20] [21]

У-ОФЭКТ II три неподвижных кристалла NaI(Tl),

75 точечных отверстий в 5 кольцах, без мультиплексирования

ЧТО 0,25 лучший 340 (0,25 мм)

13000 лучших

Дель Герра и др.,

2007, [22]

X-ОФЭКТ два вращающихся детектора NaI(Tl),

различные отверстия

ЧТО 0,62 лучший 855

Комбинированный ПЭТ-МР

[ редактировать ]
На изображении показана система мультимодальной визуализации для доклинической МРТ 3Т с пристегивающейся ПЭТ для последовательной визуализации.

Принцип: Технология ПЭТ-МР для визуализации мелких животных представляет собой крупный прорыв в области высокоэффективной технологии функциональной визуализации, особенно в сочетании с безкриогенной системой МРТ. Система ПЭТ-МР обеспечивает превосходный контраст мягких тканей и возможность молекулярной визуализации для превосходной визуализации, количественного определения и трансляционных исследований. Доклиническую систему ПЭТ-МР можно использовать для одновременной мультимодальной визуализации. Использование технологии безкриогенных магнитов также значительно снижает требования к инфраструктуре и зависимость от доступности криогенных охлаждающих жидкостей, которые становится все труднее получить.

Сильные стороны: Исследователи могут использовать автономную операцию ПЭТ или МРТ или использовать мультимодальную визуализацию. Методы ПЭТ и МРТ могут выполняться как независимо (с использованием систем ПЭТ или МРТ как автономных устройств), так и последовательно (с прикрепляемым ПЭТ) перед отверстием системы МРТ или одновременно (с ПЭТ-системой). вставлен внутрь магнита МРТ). Это позволяет получить гораздо более точную картину гораздо быстрее. Одновременное использование систем ПЭТ и МРТ позволяет увеличить рабочий процесс в лаборатории. Система MR-PET от MR Solutions включает в себя новейшую технологию кремниевых фотоумножителей (SiPM), которая значительно уменьшает размер системы и позволяет избежать проблем, связанных с использованием фотоумножителей или других устаревших типов детекторов в магнитном поле МРТ. Рабочие характеристики SiPM аналогичны характеристикам обычного ФЭУ, но с практическими преимуществами полупроводниковой технологии.

Слабые стороны: поскольку это комбинация систем визуализации, недостатки, связанные с каждым методом визуализации, в значительной степени компенсируются другим. При последовательной ПЭТ-МР оператору необходимо дать немного времени для перемещения субъекта между положениями получения ПЭТ и МР. Это отрицается при одновременной ПЭТ-МР. Однако в последовательных системах ПЭТ-МР само ПЭТ-кольцо легко закрепить или снять и перенести из одного помещения в другое для независимого использования. Исследователю необходимы достаточные знания для интерпретации изображений и данных из двух разных систем, и для этого ему потребуется пройти обучение.

Исследования рака: сочетание МРТ и ПЭТ гораздо эффективнее по времени, чем использование одного метода за раз. Изображения от двух модальностей также могут быть зарегистрированы гораздо точнее, поскольку временная задержка между модальностями ограничена для последовательных систем ПЭТ-МР и практически отсутствует для одновременных систем. Это означает, что возможность грубого перемещения объекта между приобретениями практически отсутствует.

Комбинированная ОФЭКТ-МР

[ редактировать ]
Система доклинической визуализации с прикрепляемой ОФЭКТ

Принцип: Новый ОФЭКТ-МР для визуализации мелких животных основан на технологии нескольких точечных отверстий, обеспечивающей высокое разрешение и высокую чувствительность. В сочетании с безкриогенной МРТ комбинированная технология ОФЭКТ-МР значительно увеличивает рабочий процесс в исследовательских лабораториях, одновременно снижая требования к лабораторной инфраструктуре и уязвимость к поставкам криогена. [23]

Сильные стороны: исследовательским центрам больше не нужно приобретать несколько систем, и они могут выбирать между различными конфигурациями систем визуализации. ОФЭКТ или МРТ-оборудование можно использовать как отдельное устройство на столе, либо можно выполнять последовательную визуализацию, прикрепив модуль ОФЭКТ к системе МРТ. Животное автоматически переходит из одной модальности в другую по той же оси. Вставив модуль ОФЭКТ внутрь магнита МРТ, можно одновременно получать данные ОФЭКТ и МРТ. Рабочий процесс в лаборатории можно увеличить за счет получения нескольких модальностей одного и того же объекта за один сеанс или за счет использования систем ОФЭКТ и МРТ отдельно, одновременно визуализируя разные объекты. ОФЭКТ-МР доступен в различных конфигурациях с различным трансаксиальным полем зрения, что позволяет получать изображения от мышей до крыс.

Слабые стороны: поскольку это комбинация систем визуализации, недостатки, связанные с тем или иным методом визуализации, больше не применимы. При последовательной ОФЭКТ-МР оператору необходимо дать немного времени для перемещения субъекта между положениями ОФЭКТ и МР-съемки. Это отрицается при одновременной ОФЭКТ-МР. Однако при последовательной ОФЭКТ-МР модуль ОФЭКТ можно легко закрепить или снять и переносить из одной комнаты в другую. Исследователь должен обладать достаточными знаниями для интерпретации двух разных результатов системы, и для этого ему потребуется пройти обучение.

Исследование рака: сочетание МРТ, которая используется в качестве неинвазивного метода визуализации, и ОФЭКТ дает результаты гораздо быстрее по сравнению с использованием одного метода за раз. Изображения от двух модальностей также могут быть зарегистрированы гораздо точнее, поскольку временная задержка между модальностями ограничена для последовательных систем ОФЭКТ-МР и практически отсутствует для одновременных систем. Это означает, что возможность грубого перемещения объекта между приобретениями практически отсутствует. Благодаря раздельной независимой работе систем МРТ и ОФЭКТ рабочий процесс можно легко увеличить.

Оптическая визуализация

[ редактировать ]
Основная статья: Оптическая визуализация

Принцип: Оптическая визуализация делится на флуоресценцию и биолюминесценцию .

  • Флуоресцентная визуализация работает на основе флуорохромов внутри объекта, которые возбуждаются внешним источником света и в ответ излучают свет другой длины волны. Традиционные флуорохромы включают GFP, RFP и их многочисленные мутанты. Однако серьезные проблемы возникают in vivo из-за автофлуоресценции тканей на длинах волн ниже 700 нм. Это привело к переходу на красители ближнего инфракрасного диапазона и инфракрасные флуоресцентные белки (700–800 нм), которые продемонстрировали гораздо большую пригодность для визуализации in vivo из-за гораздо более низкой автофлуоресценции ткани и более глубокого проникновения в ткани на этих длинах волн. [24] [25] [26] [27]
  • С другой стороны, биолюминесцентная визуализация основана на свете, генерируемом хемилюминесцентными ферментативными реакциями. Как при флуоресцентной, так и при биолюминесцентной визуализации световые сигналы улавливаются камерами с зарядовой связью (ПЗС), охлаждаемыми до -150 °C, что делает их чрезвычайно светочувствительными. [2] В случаях, когда создается больше света, для визуализации изображения можно использовать менее чувствительные камеры или даже невооруженный глаз.

Сильные стороны: Оптическая визуализация выполняется быстро и легко, а также относительно недорога по сравнению со многими другими методами визуализации. Кроме того, он чрезвычайно чувствителен и способен обнаруживать молекулярные события в диапазоне 10–15 М. Кроме того, поскольку биолюминесцентная визуализация требует не возбуждения репортера, а самой реакции катализа, она является индикатором биологического/молекулярного процесса и практически не имеет фонового шума. [8]

Слабые стороны: Основным недостатком оптической визуализации является глубина проникновения, которая в случае видимых красителей составляет всего несколько миллиметров. Флуоресценция в ближнем инфракрасном диапазоне позволила достичь глубины в несколько сантиметров. [24] [25] Поскольку свет в инфракрасном диапазоне имеет наилучшую глубину проникновения, многочисленные флуорохромы были специально разработаны для оптимального возбуждения в этой области. [26] Оптическая визуализация, флуоресценция имеет разрешение, ограниченное дифракцией света ~ 270 нм, а биолюминесценция имеет разрешение ~ 1–10 мм, в зависимости от времени получения, по сравнению с МРТ при 100 мкм и микроультразвуком при 30 мкм.

Исследования рака: из-за плохой глубины проникновения оптическая визуализация обычно используется только для молекулярных целей, а не для анатомической визуализации. Из-за плохой глубины проникновения видимых длин волн он используется для подкожных моделей рака, однако флуоресценция в ближнем инфракрасном диапазоне сделала возможным использование ортотопических моделей. [28] Часто исследование экспрессии специфического белка при раке и воздействия лекарств на эту экспрессию изучается in vivo с помощью генно-инженерных светоизлучающих репортерных генов. [2] Это также позволяет идентифицировать механизмы тканеселективного воздействия на гены при раке и за его пределами. [29]

Комбинированная ПЭТ-оптическая визуализация, флуоресценция

[ редактировать ]
Многоцветная флуоресцентная визуализация живых клеток HeLa с мечеными митохондриями (красный), актином (зеленый) и ядрами (голубой). Каждая ячейка имеет размер ~10 мкм, и изображения показывают, что оптическое изображение обеспечивает разрешение ≤1 мкм.

Принцип: Химия диоксаборолана позволяет использовать радиоактивный фторид ( 18 F ) мечение антител [30] или эритроциты , [31] который позволяет проводить позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) и флуоресцентную визуализацию рака. [32] [33] и кровоизлияния , [31] соответственно. Генетическая, излучающая позитроны и флуоресцентная репортерная система человеческого происхождения (HD-GPF) использует человеческий белок, PSMA и неиммуногенный, а также небольшую молекулу, излучающую позитроны (связанную с бором). 18 F ) и флуоресцентный для двухмодальной ПЭТ и флуоресцентной визуализации клеток с модифицированным геномом, например раковых , CRISPR/Cas9 или CAR T -клеток, у целой мыши. [32] Комбинирование этих методов визуализации было предсказано лауреатом Нобелевской премии 2008 года Роджером Ю. Цяном , чтобы компенсировать недостатки отдельных методов визуализации. [34]

Сильные стороны: Сочетает в себе сильные стороны ПЭТ и оптической визуализации , флуоресценции . ПЭТ позволяет получать анатомические изображения для определения местоположения меченых клеток у целых животных или людей, поскольку радиоактивная метка , 18 F находится внутри животного или человека на практически неограниченную глубину проникновения. 18 F имеет период полураспада 110 минут и ограничивает радиоактивное воздействие на животное или человека. Оптическая визуализация обеспечивает более высокое разрешение с субклеточным разрешением ~ 270 нм или пределом дифракции света, что позволяет визуализировать отдельные клетки и локализовать расположение клеток на клеточной мембране, эндосомах, цитоплазме или ядрах (см. Рисунок многоцветного изображения). клетки HeLa). Этот метод позволяет маркировать небольшие молекулы, [32] [35] [36] антитела , [30] клетки ( раковые [30] [32] и эритроциты [31] ), спинномозговая жидкость , [37] кровоизлияния , [31] рака простаты , удаление [32] [38] и клетки с отредактированным геномом, экспрессирующие генетически кодируемый человеческий белок PSMA , для визуализации отредактированных CRISPR/Cas9 и CAR T-клеток . [32]

Слабые стороны: сочетание ПЭТ и оптической визуализации позволяет использовать два агента визуализации, которые компенсируют недостатки других. 18 F Период полураспада составляет 110 минут, а сигнал ПЭТ не является постоянным. Флуоресцентные небольшие молекулы обеспечивают постоянный сигнал при хранении в темноте и без фотоотбеливания . В настоящее время не существует ни одного прибора, который мог бы отображать сигнал ПЭТ и отображать флуоресценцию с субклеточным разрешением (см. Рисунок многоцветных клеток HeLa). Для визуализации ПЭТ, флуоресценции всего органа и флуоресценции отдельных клеток с субклеточным разрешением требуется несколько инструментов.

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Кисслинг Ф., Пихлер Б.Дж. (2011). Визуализация мелких животных: основы и практическое руководство (1-е изд.). Спрингер. ISBN  978-3-642-12944-5 .
  2. ^ Jump up to: а б с д и ж г Уиллманн Дж. К., ван Брюгген Н., Динкельборг Л. М., Гамбхир СС (июль 2008 г.). «Молекулярная визуализация в разработке лекарств». Обзоры природы. Открытие наркотиков . 7 (7): 591–607. дои : 10.1038/nrd2290 . ПМИД   18591980 . S2CID   37571813 .
  3. ^ Jump up to: а б Фостер Ф.С., Мехи Дж., Лукач М., Хирсон Д., Уайт С., Чаггарес С., Нидлс А. (октябрь 2009 г.). «Новый микроультразвуковой сканер на базе матрицы 15–50 МГц для доклинической визуализации». Ультразвук в медицине и биологии . 35 (10): 1700–8. doi : 10.1016/j.ultrasmedbio.2009.04.012 . ПМИД   19647922 .
  4. ^ Ван X, Хагемейер CE, Хоманн Дж.Д., Лейтнер Э., Армстронг П.С., Цзя Ф., Ольшевски М., Нидлз А., Питер К., Аренс I (июнь 2012 г.). «Новые микропузырьки, нацеленные на одноцепочечные антитела, для молекулярной ультразвуковой визуализации тромбозов: проверка уникального неинвазивного метода быстрого и чувствительного обнаружения тромбов и мониторинга успеха или неудачи тромболизиса у мышей» . Тираж . 125 (25): 3117–26. doi : 10.1161/CIRCULATIONAHA.111.030312 . ПМИД   22647975 .
  5. ^ Дэн СХ, Силинг Ф, Пан Х, Цуй Дж (апрель 2004 г.). «Пористость клеточной мембраны, вызванная ультразвуком». Ультразвук в медицине и биологии . 30 (4): 519–26. doi : 10.1016/j.ultrasmedbio.2004.01.005 . ПМИД   15121254 .
  6. ^ Jump up to: а б Ли МЛ, О Дж.Т., Се Икс, Ку Г, Ван В., Ли С., Лунгу Г., Стойка Г., Ван Л.В. (март 2008 г.). «Одновременная молекулярная визуализация и визуализация гипоксии опухолей головного мозга in vivo с использованием спектроскопической фотоакустической томографии» (PDF) . Процесс IEEE . 96 (3): 481–9. дои : 10.1109/JPROC.2007.913515 . S2CID   1815688 .
  7. ^ Jump up to: а б Ван X, Фаулкс Дж.Б., Карсон П.Л. (2008). «Экспериментальная оценка системы высокоскоростной фотоакустической томографии на базе коммерческой ультразвуковой установки». Симпозиум IEEE по ультразвуку 2008 г. стр. 1234–7. дои : 10.1109/ULTSYM.2008.0298 . ISBN  978-1-4244-2428-3 . S2CID   42410198 . {{cite book}}: |journal= игнорируется ( помогите )
  8. ^ Jump up to: а б с д Ку В., Гамильтон П.В., Уильямсон К. (2006). «Неинвазивная визуализация in vivo при исследованиях на мелких животных» . Клеточная онкология . 28 (4): 127–39. дои : 10.1155/2006/245619 . ПМЦ   4617494 . ПМИД   16988468 .
  9. ^ «Дорогая, я уменьшил магнит: доклиническая МРТ 7Т работает без криогена»
  10. ^ ван дер Цвааг В., Фрэнсис С., Хед К., Питерс А., Гоуленд П., Моррис П., Боутелл Р. (октябрь 2009 г.). «ФМРТ при 1,5, 3 и 7 Т: характеризующие ЖИРНЫЕ изменения сигнала». НейроИмидж . 47 (4): 1425–34. doi : 10.1016/j.neuroimage.2009.05.015 . ПМИД   19446641 . S2CID   20246002 .
  11. ^ Ван М., Хун X, Чанг К.Ф., Ли Q, Ма Б., Чжан Х. и др. (июль 2015 г.). «Одновременное выявление и разделение сверхострого внутримозгового кровоизлияния и ишемии головного мозга с помощью МРТ с переносом протонов амида» . Магнитный резонанс в медицине . 74 (1): 42–50. дои : 10.1002/mrm.25690 . ПМЦ   4608848 . ПМИД   25879165 .
  12. ^ Ван В., Чжан Х., Ли Д.Х., Ю Дж., Ченг Т., Хун М., Цзян С., Фань Х., Хуан Икс, Чжоу Дж., Ван Дж. (август 2017 г.). «Использование методов функциональной и молекулярной МРТ для выявления нейровоспаления и нейропротекции после черепно-мозговой травмы» . Мозг, поведение и иммунитет . 64 : 344–353. дои : 10.1016/j.bbi.2017.04.019 . ПМЦ   5572149 . ПМИД   28455264 .
  13. ^ Бун Дж. М., Веласкес О., Черри С.Р. (июль 2004 г.). «Доза рентгеновского излучения на мелких животных при микроКТ». Молекулярная визуализация . 3 (3): 149–58. дои : 10.1162/1535350042380326 . ПМИД   15530250 .
  14. ^ Jump up to: а б Шобер О., Рахбар К., Риман Б. (февраль 2009 г.). «Мультимодальная молекулярная визуализация - от описания цели до клинических исследований». Европейский журнал ядерной медицины и молекулярной визуализации . 36 (2): 302–14. дои : 10.1007/s00259-008-1042-4 . ПМИД   19130054 . S2CID   25389532 .
  15. ^ Jump up to: а б с Масуд Т.Ф., Гамбхир СС (март 2003 г.). «Молекулярная визуализация живых существ: взгляд на фундаментальные биологические процессы в новом свете» . Гены и развитие . 17 (5): 545–80. дои : 10.1101/gad.1047403 . ПМИД   12629038 .
  16. ^ Бикман Ф., ван дер Хаве Ф. (февраль 2007 г.). «Обскура: путь к трехмерной радионуклидной визуализации сверхвысокого разрешения». Европейский журнал ядерной медицины и молекулярной визуализации . 34 (2): 151–61. дои : 10.1007/s00259-006-0248-6 . ПМИД   17143647 . S2CID   32330635 .
  17. ^ Саджеди С., Зерааткар Н., Моджи В., Фарахани М.Х., Саркар С., Араби Х. и др. (март 2014 г.). «Проектирование и разработка ОФЭКТ-сканера животных с высоким разрешением, предназначенного для визуализации крыс и мышей». Ядерные приборы и методы в физических исследованиях. Раздел А: Ускорители, спектрометры, детекторы и сопутствующее оборудование . 741 : 169–76. Бибкод : 2014NIMPA.741..169S . дои : 10.1016/j.nima.2014.01.001 .
  18. ^ «Системы медицинской визуализации» . Проектирование и разработка систем медицинской визуализации . Парто Негар Персия.
  19. ^ Магота К., Кубо Н., Куге Й., Нисидзима К., Чжао С., Тамаки Н. (апрель 2011 г.). «Описание характеристик доклинической системы ПЭТ/ОФЭКТ/КТ для мелких животных Inveon для мультимодальной визуализации». Европейский журнал ядерной медицины и молекулярной визуализации . 38 (4): 742–52. дои : 10.1007/s00259-010-1683-y . hdl : 2115/48719 . ПМИД   21153410 . S2CID   19890309 .
  20. ^ ван дер Хаве Ф., Вастенхау Б., Рамакерс Р.М., Брандерхорст В., Кра Д.О., Джи С., Сталенс С.Г., Бикман Ф.Дж. (апрель 2009 г.). «U-SPECT-II: устройство сверхвысокого разрешения для молекулярной визуализации мелких животных» . Журнал ядерной медицины . 50 (4): 599–605. дои : 10.2967/jnumed.108.056606 . ПМИД   19289425 .
  21. ^ Иващенко О., ван дер Хаве Ф., Гурден М.С., Рамакерс Р.М., Бикман Ф.Дж. (март 2015 г.). «ОФЭКТ субмиллиметровой мыши сверхвысокой чувствительности» . Журнал ядерной медицины . 56 (3): 470–5. дои : 10.2967/jnumed.114.147140 . ПМИД   25678487 .
  22. ^ Дель Герра А., Белкари Н. (декабрь 2007 г.). «Современное состояние ПЭТ, ОФЭКТ и КТ для визуализации мелких животных». Ядерные приборы и методы в физических исследованиях. Раздел А: Ускорители, спектрометры, детекторы и сопутствующее оборудование . 583 (1): 119–24. Бибкод : 2007NIMPA.583..119D . дои : 10.1016/j.nima.2007.08.187 .
  23. ^ «Увеличение результатов: доклинические технологии улучшают понимание болезней»
  24. ^ Jump up to: а б Вайсследер Р., Махмуд У (май 2001 г.). «Молекулярная визуализация». Радиология . 219 (2): 316–33. doi : 10.1148/radiology.219.2.r01ma19316 . ПМИД   11323453 .
  25. ^ Jump up to: а б Ковар Дж.Л., Симпсон М.А., Шутц-Гешвендер А., Олив Д.М. (август 2007 г.). «Системный подход к разработке флуоресцентных контрастных веществ для оптической визуализации моделей рака у мышей» . Аналитическая биохимия . 367 (1): 1–12. дои : 10.1016/j.ab.2007.04.011 . ПМИД   17521598 . S2CID   16426577 .
  26. ^ Jump up to: а б Адамс К.Е., Ке С., Квон С., Лян Ф., Фан З., Лу Й., Хирши К., Мавад М.Э., Барри М.А., Севик-Мурака Э.М. (2007). «Сравнение видимых и ближних инфракрасных флуоресцентных красителей для молекулярной визуализации рака» . Журнал биомедицинской оптики . 12 (2): 024017. Бибкод : 2007JBO....12b4017A . дои : 10.1117/1.2717137 . ПМИД   17477732 . S2CID   39806507 .
  27. ^ Шу X, Ройант А., Лин М.З., Агилера Т.А., Лев-Рам В., Штайнбах П.А., Цянь Р.Ю. (май 2009 г.). «Экспрессия инфракрасных флуоресцентных белков у млекопитающих, созданных на основе бактериального фитохрома» . Наука . 324 (5928): 804–7. Бибкод : 2009Sci...324..804S . дои : 10.1126/science.1168683 . ПМК   2763207 . ПМИД   19423828 .
  28. ^ Ковар Дж.Л., Джонсон М.А., Волчек В.М., Чен Дж., Симпсон М.А. (октябрь 2006 г.). «Экспрессия гиалуронидазы индуцирует метастазирование опухоли простаты на модели ортотопических мышей» . Американский журнал патологии . 169 (4): 1415–26. дои : 10.2353/ajpath.2006.060324 . ПМК   1698854 . ПМИД   17003496 .
  29. ^ Нурс Дж., Токалов С., Коххар С., Хан Э., Шотт Л.К., Хинц Л., Эдер Л., Арнольд-Шилд Д., Пробст Х.К., Данквардт С. (2021). «Неинвазивная визуализация экспрессии генов и динамики секреции белка у живых мышей». bioRxiv   10.1101/2021.07.08.451623 .
  30. ^ Jump up to: а б с Родригес Э.А., Ван Й., Крисп Дж.Л., Вера Д.Р., Цянь Р.Ю., Тинг Р. (май 2016 г.). «Новая химия диоксаборолана обеспечивает создание [(18)F]-позитрон-эмиссионных флуоресцентных [(18)F]-мультимодальных биомолекул из твердой фазы» . Биоконъюгатная химия . 27 (5): 1390–1399. doi : 10.1021/acs.bioconjchem.6b00164 . ПМЦ   4916912 . ПМИД   27064381 .
  31. ^ Jump up to: а б с д Ван Ю, Ан ФФ, Чан М, Фридман Б, Родригес Э.А., Цянь Р.Ю., Арас О, Тинг Р. (март 2017 г.). «Эритроциты, излучающие позитроны/флуоресцентно меченные 18F, позволяют визуализировать внутреннее кровоизлияние на мышиной модели внутричерепного кровоизлияния» . Журнал церебрального кровотока и метаболизма . 37 (3): 776–786. дои : 10.1177/0271678X16682510 . ПМК   5363488 . ПМИД   28054494 .
  32. ^ Jump up to: а б с д и ж Го Х, Харикришна К, Ведвяс Ю, Макклоски Дж. Э., Чжан В, Чен Н, Нурили Ф, Ву АП, Сайман Х. Б., Акин О, Родригес Э. А., Арас О, Джин М., Тинг Р. (май 2019 г.). «Агент, излучающий 18F]-позитроны, для визуализации PMSA позволяет осуществлять генетическую отчетность в усыновленных генетически модифицированных клетках» . АКС Химическая биология . 14 (7): 1449–1459. doi : 10.1021/acschembio.9b00160 . ПМЦ   6775626 . ПМИД   31120734 .
  33. ^ Коммиди Х., Го Х., Нурили Ф., Ведвяс Ю., Джин М.М., МакКлюр Т.Д. и др. (май 2018 г.). «18F-излучающий позитроны/триметинцианин-флуоресцентный контраст для лечения рака простаты под визуальным контролем» . Журнал медицинской химии . 61 (9): 4256–4262. doi : 10.1021/acs.jmedchem.8b00240 . ПМК   6263152 . ПМИД   29676909 .
  34. ^ Цянь Р.Ю. (сентябрь 2003 г.). «Представляя будущее визуализации». Обзоры природы. Молекулярно-клеточная биология . Дополнение: SS16-21. ПМИД   14587522 .
  35. ^ Коммиди Х., Тоси У., Мачани У.Б., Го Х., Марнелл К.С., Лоу Б., Сувейдан М.М., Тинг Р. (февраль 2018 г.). «Панобиностат, меченный радиоактивным изотопом 18F, позволяет осуществлять доставку ингибитора гистондеацетилазы под контролем позитронно-эмиссионной томографии» . Письма ACS по медицинской химии . 9 (2): 114–119. doi : 10.1021/acsmedchemlett.7b00471 . ПМК   5807872 . ПМИД   29456798 .
  36. ^ Ван М, Коммиди Х, Тоси У, Го Х, Чжоу З, Швейцер М.Э., Ву Л.И., Сингх Р., Хоу С., Лоу Б., Тинг Р., Сувейдане М.М. (декабрь 2017 г.). «18[F]-Позитрон-эмиссионное флуоресцентное производное дазатиниба» . Молекулярная терапия рака . 16 (12): 2902–2912. дои : 10.1158/1535-7163.MCT-17-0423 . ПМК   6287766 . ПМИД   28978723 .
  37. ^ Коммиди Х, Го Х, Чен Н, Ким Д, Хэ Б, Ву АП, Арас О, Тин Р (2017). «18F]-позитрон-излучающий флуоресцентный зонд спинномозговой жидкости для визуализации повреждений головного мозга и позвоночника» . Тераностика . 7 (9): 2377–2391. дои : 10.7150/thno.19408 . ПМЦ   5525743 . ПМИД   28744321 .
  38. ^ Коммиди Х., Го Х., Нурили Ф., Ведвяс Ю., Джин М.М., МакКлюр Т.Д., Эдай Б., Сайман Х.Б., Акин О., Арас О., Тинг Р. (май 2018 г.). «18F-излучающий позитроны/триметинцианин-флуоресцентный контраст для лечения рака простаты под визуальным контролем» . Журнал медицинской химии . 61 (9): 4256–4262. doi : 10.1021/acs.jmedchem.8b00240 . ПМК   6263152 . ПМИД   29676909 .

Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Preclinical_imaging&oldid=1224539768"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 53229b5dc658a3db833b599c0fb4624d__1716066540
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/53/4d/53229b5dc658a3db833b599c0fb4624d.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Preclinical imaging - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)