конструкция ДНК

Конструкция ДНК представляет собой искусственно созданный сегмент ДНК, нанесенный на вектор , который можно использовать для включения генетического материала в целевую ткань или клетку . ^{[ 1 ]} Конструкция ДНК содержит вставку ДНК , называемую трансгеном трансформации , доставляемую через вектор , который позволяет реплицировать и/или экспрессировать последовательность вставки в клетке-мишени. Этот ген можно клонировать из природного гена. ^{[ 2 ]} или синтетически сконструированы. ^{[ 3 ]} Вектор может быть доставлен с использованием физических, химических или вирусных методов. ^{[ 4 ]} Обычно векторы, используемые в конструкциях ДНК, содержат точку начала репликации , сайт множественного клонирования и селектируемый маркер . ^{[ 2 ]} Некоторые векторы могут нести дополнительные регуляторные элементы в зависимости от используемой системы экспрессии. ^{[ 5 ]}

Конструкции ДНК могут иметь размер от нескольких тысяч пар оснований (кб) ДНК, несущих один ген, при использовании таких векторов, как плазмиды или бактериофаги , или до сотен кбп для крупномасштабных геномных исследований с использованием искусственной хромосомы. ^{[ 2 ]} Конструкция ДНК может экспрессировать белок дикого типа, предотвращать экспрессию определенных генов за счет экспрессии конкурентов или ингибиторов или экспрессировать мутантные белки, такие как делеционные мутации или миссенс-мутации . Конструкции ДНК широко адаптируются в исследованиях в области молекулярной биологии для таких методов, как секвенирование ДНК, экспрессия белков и исследования РНК. ^{[ 5 ]}

История

Первый стандартизированный вектор, pBR220, был разработан в 1977 году исследователями из лаборатории Герберта Бойера. Плазмида содержит различные сайты рестрикции и стабильный ген устойчивости к антибиотикам, свободный от транспозонной активности. ^{[ 6 ]}

В 1982 году Джеффри Виейра и Йоахим Мессинг описали разработку векторов pUC, полученных из M13mp7, которые состоят из множественного сайта клонирования и позволяют более эффективно секвенировать и клонировать с использованием набора универсальных праймеров M13. Три года спустя те же ученые создали популярную ныне плазмиду pUC19. ^{[ 7 ]}

Строительство

Ген в интересующей последовательности ДНК может быть либо клонирован из существующей последовательности, либо разработан синтетически. Чтобы клонировать естественную последовательность в организме, ДНК организма сначала разрезается ферментами рестрикции , которые распознают последовательности ДНК и разрезают их вокруг целевого гена. Затем ген можно амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Обычно этот процесс включает использование коротких последовательностей, известных как праймеры, для первоначальной гибридизации с целевой последовательностью; кроме того, точковые мутации можно вводить в последовательности праймеров, а затем копировать в каждом цикле, чтобы модифицировать целевую последовательность. ^{[ 2 ]}

Также возможно синтезировать целевую цепь ДНК для конструкции ДНК. Короткие цепи ДНК, известные как олигонуклеотиды, можно получить с помощью колоночного синтеза, при котором основания добавляются по одному к цепи ДНК, прикрепленной к твердой фазе. Каждая база имеет защитную группу, предотвращающую связывание, которое не удаляется до тех пор, пока не будет готова к добавлению следующая база, гарантируя, что они связаны в правильной последовательности. Олигонуклеотиды также можно синтезировать на микрочипе, что позволяет синтезировать десятки тысяч последовательностей одновременно, чтобы снизить стоимость. ^{[ 3 ]} Чтобы синтезировать более крупный ген, разрабатываются олигонуклеотиды с перекрывающимися последовательностями на концах, а затем соединяются вместе. Самый распространенный метод называется полимеразной циклической сборкой (PCA): фрагменты гибридизуются в перекрывающихся областях и удлиняются, а в каждом цикле создаются более крупные фрагменты. ^{[ 2 ]}

После выделения последовательности ее необходимо вставить в вектор . Самый простой способ сделать это — разрезать векторную ДНК с помощью ферментов рестрикции; если для выделения целевой последовательности использовались одни и те же ферменты, то на каждом конце будут созданы одни и те же «свисающие» последовательности, что позволяет осуществлять гибридизацию. Как только целевой ген гибридизуется с векторной ДНК, их можно соединить с помощью ДНК-лигазы . ^{[ 2 ]} Альтернативная стратегия использует рекомбинацию между гомологичными сайтами целевого гена и векторной последовательностью, устраняя необходимость в ферментах рестрикции. ^{[ 8 ]}

Способы доставки

Существует три основных категории доставки конструкций ДНК: физическая, химическая и вирусная. ^{[ 4 ]} Физические методы, которые доставляют ДНК путем физического проникновения в клетку, включают микроинъекцию , электропорацию и биолистику . ^{[ 9 ]} Химические методы основаны на химических реакциях доставки ДНК и включают трансформацию клеток, ставших компетентными, с использованием фосфата кальция, а также доставку через липидные наночастицы. ^{[ 10 ]}^{[ 11 ]} Вирусные методы используют различные вирусные векторы для доставки ДНК, включая аденовирус , лентивирус и вирус простого герпеса. ^{[ 12 ]}

Векторная структура

Помимо целевого гена, вектор содержит три важных элемента: точку начала репликации, селектируемый маркер и сайт множественного клонирования. Инициал репликации — это последовательность ДНК, которая запускает процесс репликации ДНК, позволяя вектору клонировать себя. Множественный сайт клонирования содержит сайты связывания для нескольких ферментов рестрикции, что упрощает вставку различных последовательностей ДНК в вектор. Выбираемый маркер придает некоторый признак, который можно легко выбрать в клетке-хозяине, чтобы можно было определить, была ли трансформация успешной. Наиболее распространенными селектируемыми маркерами являются гены устойчивости к антибиотикам, поэтому клетки-хозяева без конструкции погибнут при воздействии антитела, и останутся только клетки-хозяева с конструкцией. ^{[ 2 ]}

Типы конструкций ДНК

Обычно используемый плазмидный вектор pET28a. ^{[ 13 ]}

Бактериальные плазмиды представляют собой кольцевые участки ДНК, которые естественным образом реплицируются в бактериях. ^{[ 2 ]} Плазмиды способны содержать вставки длиной примерно до 20 т.п.н. Эти типы конструкций обычно содержат ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотикам, точку начала репликации, регуляторные элементы, такие как Lac ингибиторы , полилинкер и белковую метку , которая облегчает очистку белка. ^{[ 14 ]}
Бактериофаговые векторы — это вирусы, которые могут заражать бактерии и реплицировать свою собственную ДНК. ^{[ 2 ]}
Искусственные хромосомы обычно используются в исследованиях геномных проектов из-за их способности содержать вставки размером до 350 кб. Эти векторы получены из плазмиды F с использованием преимуществ высокой стабильности и способности к конъюгации, привносимых фактором F. ^{[ 15 ]}
Фосмиды представляют собой гибрид бактериальных плазмид F и методов клонирования фага λ. Вставки предварительно упаковываются в фаговые частицы, а затем вставляются в клетку-хозяина, способную удерживать ~45 кб. Их обычно используют для создания библиотеки ДНК из-за их повышенной стабильности. ^{[ 16 ]}

Приложения

Конструкции ДНК можно использовать для производства белков, включая как природные белки, так и сконструированные мутантные белки. Эти белки можно использовать для производства терапевтических продуктов, таких как фармацевтические препараты и антитела. Конструкции ДНК также могут изменять уровни экспрессии других генов путем экспрессии регуляторных последовательностей, таких как промоторы и ингибиторы. Кроме того, конструкции ДНК можно использовать для таких исследований, как создание геномных библиотек, секвенирование клонированной ДНК и изучение экспрессии РНК и белков. ^{[ 5 ]}

См. также

Вектор (молекулярная биология)

Ссылки

^ Пинкерт, Карл (2014). Технология трансгенных животных: Лабораторный справочник . Амстердам: Эльзевир. п. 692. ИСБН 9780124095366 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Картер, Мэтт; Ши, Дженнифер К. (2010), «Молекулярное клонирование и технология рекомбинантной ДНК» , Руководство по методам исследования в неврологии , Elsevier, стр. 207–227, номер документа : 10.1016/b978-0-12-374849-2.00009-4 , ISBN 978-0-12-374849-2 , получено 10 ноября 2021 г.
^ Jump up to: ^а ^б Хьюз, Рэндалл А.; Эллингтон, Эндрю Д. (январь 2017 г.). «Синтез и сборка синтетической ДНК: использование синтетического в синтетической биологии» . Перспективы Колд-Спринг-Харбор в биологии . 9 (1): а023812. doi : 10.1101/cshperspect.a023812 . ISSN 1943-0264 . ПМК 5204324 . ПМИД 28049645 .
^ Jump up to: ^а ^б Картер, Мэтт; Ши, Дженнифер К. (2010), «Стратегии доставки генов» , Руководство по методам исследования в неврологии , Elsevier, стр. 229–242, doi : 10.1016/b978-0-12-374849-2.00010-0 , ISBN 978-0-12-374849-2 , получено 24 октября 2020 г.
^ Jump up to: ^а ^б ^с Глик, Бернард Р.; Паттен, Шерил Л. (2017). Молекулярная биотехнология: принципы и применение рекомбинантной ДНК . Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press.
^ Боливар, Франциско; Родригес, Раймонд Л.; Бетлах, Мэри К.; Бойер, Герберт В. (1 ноября 1977 г.). «Конструирование и характеристика новых средств клонирования I. Устойчивые к ампициллину производные плазмиды pMB9» . Джин . 2 (2): 75–93. дои : 10.1016/0378-1119(77)90074-9 . ISSN 0378-1119 . ПМИД 344136 .
^ Яниш-Перрон, Селеста; Виейра, Джеффри; Мессинг, Иоахим (1 января 1985 г.). «Улучшенные векторы для клонирования фага M13 и штаммы-хозяева: нуклеотидные последовательности векторов M13mpl8 и pUC19» . Джин . 33 (1): 103–119. дои : 10.1016/0378-1119(85)90120-9 . ISSN 0378-1119 . ПМИД 2985470 .
^ Коупленд, Нил Г.; Дженкинс, Нэнси А.; Суд, Дональд Л. (октябрь 2001 г.). «Рекомбинирование: новый мощный инструмент для функциональной геномики мышей» . Обзоры природы Генетика . 2 (10): 769–779. дои : 10.1038/35093556 . ISSN 1471-0064 . ПМИД 11584293 . S2CID 10916548 .
^ Мейерумберт, С; Гай, Р. (5 апреля 2005 г.). «Физические методы переноса генов: Улучшение кинетики доставки генов в клетки» . Обзоры расширенной доставки лекарств . 57 (5): 733–753. дои : 10.1016/j.addr.2004.12.007 . ПМИД 15757758 .
^ Фельгнер, Польша; Гадек, ТР; Холм, М.; Роман, Р.; Чан, HW; Венц, М.; Нортроп, JP; Ринголд, генеральный менеджер; Дэниэлсен, М. (1 ноября 1987 г.). «Липофекция: высокоэффективная процедура липид-опосредованной ДНК-трансфекции» . Труды Национальной академии наук . 84 (21): 7413–7417. Бибкод : 1987PNAS...84.7413F . дои : 10.1073/pnas.84.21.7413 . ISSN 0027-8424 . ПМК 299306 . ПМИД 2823261 .
^ Кингстон, Роберт Э.; Чен, Клаудия А.; Роуз, Джон К. (2003). «Трансфекция фосфатом кальция» . Современные протоколы молекулярной биологии . 63 (1): 9.1.1–9.1.11. дои : 10.1002/0471142727.mb0901s63 . ISSN 1934-3647 . ПМИД 18265332 . S2CID 46188175 .
^ Роббинс, Пол Д.; Гивиззани, Стивен С. (1998). «Вирусные векторы для генной терапии» . Фармакология и терапия . 80 (1): 35–47. дои : 10.1016/S0163-7258(98)00020-5 . ПМИД 9804053 .
^ Шен, Эйми; Лупардус, Патрик Дж.; Морелл, Маунт; Подумайте, Элизабет Л.; Садагиани, А. Масуд; Гарсия, К. Кристофер; Богьо, Мэтью (2 декабря 2009 г.). Сюй, Вэньцин (ред.). «Упрощенная, улучшенная очистка белка с использованием индуцируемой автопроцессирующей ферментной метки» . ПЛОС ОДИН 4 (12): e8 Бибкод : 2009PLoSO...4.8119S . дои : 10.1371/journal.pone.0008119 . ISSN 1932-6203 . ПМК 2780291 . ПМИД 19956581 .
^ Гриффитс, Энтони Дж. Ф. (2015). Введение в генетический анализ . Нью-Йорк: WH Freeman & Company. ISBN 978-1464188046 .
^ Годиска, Р.; У, Ц.-Ц.; Мид, Д.А. (01 января 2013 г.), «Геномные библиотеки» , в Малой, Стэнли; Хьюз, Келли (ред.), Энциклопедия генетики Бреннера (второе издание) , Сан-Диего: Academic Press, стр. 306–309, doi : 10.1016/b978-0-12-374984-0.00641-0 , ISBN 978-0-08-096156-9 , получено 6 ноября 2020 г.
^ Ху, Бо; Хара, Пратик; Кристи, Питер Дж. (9 июля 2019 г.). «Структурные основы конъюгации F-плазмиды и биогенеза F-pilus в Escherichia coli» . Труды Национальной академии наук . 116 (28): 14222–14227. Бибкод : 2019PNAS..11614222H . дои : 10.1073/pnas.1904428116 . ISSN 0027-8424 . ПМК 6628675 . ПМИД 31239340 .

Эта по молекулярной биологии статья незавершена . Вы можете помочь Википедии, расширив ее .

[1] Пинкерт, Карл (2014). Технология трансгенных животных: Лабораторный справочник . Амстердам: Эльзевир. п. 692. ИСБН 9780124095366 .

[:14-2] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Картер, Мэтт; Ши, Дженнифер К. (2010), «Молекулярное клонирование и технология рекомбинантной ДНК» , Руководство по методам исследования в неврологии , Elsevier, стр. 207–227, номер документа : 10.1016/b978-0-12-374849-2.00009-4 , ISBN 978-0-12-374849-2 , получено 10 ноября 2021 г.

[:04-3] Jump up to: ^а ^б Хьюз, Рэндалл А.; Эллингтон, Эндрю Д. (январь 2017 г.). «Синтез и сборка синтетической ДНК: использование синтетического в синтетической биологии» . Перспективы Колд-Спринг-Харбор в биологии . 9 (1): а023812. doi : 10.1101/cshperspect.a023812 . ISSN 1943-0264 . ПМК 5204324 . ПМИД 28049645 .

[:0-4] Jump up to: ^а ^б Картер, Мэтт; Ши, Дженнифер К. (2010), «Стратегии доставки генов» , Руководство по методам исследования в неврологии , Elsevier, стр. 229–242, doi : 10.1016/b978-0-12-374849-2.00010-0 , ISBN 978-0-12-374849-2 , получено 24 октября 2020 г.

[:23-5] Jump up to: ^а ^б ^с Глик, Бернард Р.; Паттен, Шерил Л. (2017). Молекулярная биотехнология: принципы и применение рекомбинантной ДНК . Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press.

[6] Боливар, Франциско; Родригес, Раймонд Л.; Бетлах, Мэри К.; Бойер, Герберт В. (1 ноября 1977 г.). «Конструирование и характеристика новых средств клонирования I. Устойчивые к ампициллину производные плазмиды pMB9» . Джин . 2 (2): 75–93. дои : 10.1016/0378-1119(77)90074-9 . ISSN 0378-1119 . ПМИД 344136 .

[7] Яниш-Перрон, Селеста; Виейра, Джеффри; Мессинг, Иоахим (1 января 1985 г.). «Улучшенные векторы для клонирования фага M13 и штаммы-хозяева: нуклеотидные последовательности векторов M13mpl8 и pUC19» . Джин . 33 (1): 103–119. дои : 10.1016/0378-1119(85)90120-9 . ISSN 0378-1119 . ПМИД 2985470 .

[8] Коупленд, Нил Г.; Дженкинс, Нэнси А.; Суд, Дональд Л. (октябрь 2001 г.). «Рекомбинирование: новый мощный инструмент для функциональной геномики мышей» . Обзоры природы Генетика . 2 (10): 769–779. дои : 10.1038/35093556 . ISSN 1471-0064 . ПМИД 11584293 . S2CID 10916548 .

[9] Мейерумберт, С; Гай, Р. (5 апреля 2005 г.). «Физические методы переноса генов: Улучшение кинетики доставки генов в клетки» . Обзоры расширенной доставки лекарств . 57 (5): 733–753. дои : 10.1016/j.addr.2004.12.007 . ПМИД 15757758 .

[10] Фельгнер, Польша; Гадек, ТР; Холм, М.; Роман, Р.; Чан, HW; Венц, М.; Нортроп, JP; Ринголд, генеральный менеджер; Дэниэлсен, М. (1 ноября 1987 г.). «Липофекция: высокоэффективная процедура липид-опосредованной ДНК-трансфекции» . Труды Национальной академии наук . 84 (21): 7413–7417. Бибкод : 1987PNAS...84.7413F . дои : 10.1073/pnas.84.21.7413 . ISSN 0027-8424 . ПМК 299306 . ПМИД 2823261 .

[11] Кингстон, Роберт Э.; Чен, Клаудия А.; Роуз, Джон К. (2003). «Трансфекция фосфатом кальция» . Современные протоколы молекулярной биологии . 63 (1): 9.1.1–9.1.11. дои : 10.1002/0471142727.mb0901s63 . ISSN 1934-3647 . ПМИД 18265332 . S2CID 46188175 .

[12] Роббинс, Пол Д.; Гивиззани, Стивен С. (1998). «Вирусные векторы для генной терапии» . Фармакология и терапия . 80 (1): 35–47. дои : 10.1016/S0163-7258(98)00020-5 . ПМИД 9804053 .

[13] Шен, Эйми; Лупардус, Патрик Дж.; Морелл, Маунт; Подумайте, Элизабет Л.; Садагиани, А. Масуд; Гарсия, К. Кристофер; Богьо, Мэтью (2 декабря 2009 г.). Сюй, Вэньцин (ред.). «Упрощенная, улучшенная очистка белка с использованием индуцируемой автопроцессирующей ферментной метки» . ПЛОС ОДИН 4 (12): e8 Бибкод : 2009PLoSO...4.8119S . дои : 10.1371/journal.pone.0008119 . ISSN 1932-6203 . ПМК 2780291 . ПМИД 19956581 .

[14] Гриффитс, Энтони Дж. Ф. (2015). Введение в генетический анализ . Нью-Йорк: WH Freeman & Company. ISBN 978-1464188046 .

[15] Годиска, Р.; У, Ц.-Ц.; Мид, Д.А. (01 января 2013 г.), «Геномные библиотеки» , в Малой, Стэнли; Хьюз, Келли (ред.), Энциклопедия генетики Бреннера (второе издание) , Сан-Диего: Academic Press, стр. 306–309, doi : 10.1016/b978-0-12-374984-0.00641-0 , ISBN 978-0-08-096156-9 , получено 6 ноября 2020 г.

[16] Ху, Бо; Хара, Пратик; Кристи, Питер Дж. (9 июля 2019 г.). «Структурные основы конъюгации F-плазмиды и биогенеза F-pilus в Escherichia coli» . Труды Национальной академии наук . 116 (28): 14222–14227. Бибкод : 2019PNAS..11614222H . дои : 10.1073/pnas.1904428116 . ISSN 0027-8424 . ПМК 6628675 . ПМИД 31239340 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]